体外纯化乳鼠许旺细胞的4种方法比较

小鼠乳鼠心肌细胞培养物品：手术器械（眼科剪2把、眼科镊2把、手术镊1把）、培养皿4个、小烧杯2个、离心管4个、200目筛网、6孔板、垃圾桶、一次性吸管、加液枪（配各型号枪头）、75%酒精试剂：D-Hanks液2瓶（其中一瓶在操作前37℃预热）、2.5％胰酶消化液、加有FBS（浓度为10％）的DMEM培养基、Brdu、1％明胶、0.4％台盼蓝液操作程序：1、将备用物品（手术器械、培养皿、烧杯、离心管、200目筛网）进行高压灭菌2、用酒精擦拭层流台，将高压灭菌后的物品放入层流台，紫外线消毒30分钟3、将1％明胶加入六孔板中（每孔1ml）4、用镊子夹住小鼠颈部将小鼠在酒精中浸泡两次，每次2-3秒5、将消毒后的小鼠放入培养皿中，用剪刀将小鼠头部剪去，并将胸部剪开暴露出心脏，用另一个剪刀将小鼠心脏剪下放入装有预冷的D-Hanks液的培养皿中，将心脏剪开清洗残留的血液。

6、将心肌组织转移至另一个装有预冷的D-Hanks液的培养皿中进一步剪碎心脏后，加入等体积的2.5％胰酶。

7、将心肌组织转移至离心管中，反复吹打10min,静置2min后，弃上清。

8、再次加入D-Hanks液和等体积的2.5％胰酶，常温下反复吹打10min，静置2min后将上层液转移至100ml容器中，加入含10%FBS的M199培养基或DMEM培养基终止消化9、重复上一步骤至组织完全消化，适当控制消化时间10、用200目筛网过滤得到细胞混悬液，转移至10ml离心管。

11、以300g室温离心5min12、弃去上清后加入DMEM+Brdu培养基吹打，转移至50ml培养瓶中后放入37℃ 5% CO2培养箱进行差速贴壁1h13、将六孔板中的明胶吸出14、计数心肌细胞15、按六孔板细胞数（4~5×105个/每孔）加入细胞悬液，并添加M199+Brdu培养基或DMEM+Brdu培养基至3ml16、至置培养箱37℃5% CO2培养箱培养。

17、24h后换液，培养基改用不含5-BdrU的培养基继续观察培养。

ＡＣＢＤ图１．１Ａ：组织块培养法种植４８小时后组织块中可见到有细胞爬出，部分许旺细胞（ＳＣ）为圆形，体积小，胞浆少，多数呈双极型，少数为三极状，细胞折光性较强。

成纤维细胞（ＦＢ）胞体较大，扁平暗淡细胞里多角形或不规则。

（×１６０）Ｂ；７２小时后檀块周固见细胞数量增多，分布均匀。

（Ｘ】６０）Ｃ：５－６天组织块周围细胞汇台成片。

（×１６０）Ｄ：７天后在倒置显微镜下观察ＳＣ细胞密度增高，在植块周围放射状向外生长，多数细胞为取极状．胞体缅长，ＦＢ也大量增殖．细胞甸空隙少。

（ｘ１６０）ＡＣＢＤ圈１－２Ａ：ＳＣ经酶消化后呈圆形相互散开，接种４８小时后细胞贴壁，细胞分布均匀，多数为椭圆形．少数细胞呈长梭形或三角形。

（×６０）Ｂ：７２小时ｓｃ多数呈细长双极状，端对端排列。

（×１００）Ｃ：５天后细胞生长旺盛，大量增殖．细胞聚合现象较为多见，形成大小不等的细胞团块。

（ｘ６０）Ｄ：７天后ｓｃ数量更多，细胞排列更加紧密，并可见到较多的细胞代谢产物。

（×１００）ＡＣＢＤ圜１－３Ａ：乳鼠ＳＣ培养一周后倒置显微镜Ｆ观察，Ｓ－１００染色前（×１６０）Ｂ：Ｓ－１００蛋白酶联免疫化学染色，普通光学显微镜下观察，ｓｃ呈圆形或梭形，分布均匀（Ｘ４０）ｃ：ｓｃ胞体及突起呈棕褐色，ＦＢ核大，胞体１；着色。

（ｘ１６０）Ｄ：倒置显微镜下观察ｓｃ呈长梭形，两端突起纤长，胞体和突起均被染成棕色，ＦＢ扁平来着色，为不规则多角形，呈透明状。

（）（２００）－１３－ＡＢ圈２－１Ａ：ＳＣ与单丝联合培养．ｓｃ沿着材料单丝迁移，井将单丝包裹．多散ＳＣ捧列成链状，并可见到ＳＣ重叠生长（“０）Ｂ：有些Ｓｃ分敞排列于纤维的一侧或两倒（ｘ１００）ＣＤ图２．２Ｃ：ＳＣ沿着纵行的ＰＧＬＡ纤维呈链状向远处延伸（ｘ１６０）Ｄ：ＳＣ在甲壳素涂层的ＰＧＬＡ单丝上贴附紧密．细胞呈双楹形或圆形（）（２００）．１Ｂ．ＡＢ圈３．１Ａ：自梨状肌下缘切除１０ｍｍ长坐骨神经。

乳鼠心肌细胞的培养配液：Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、碳酸氢钠液、盐酸液。

取鼠：鼠盆用棉铺好，取鼠。

准备：事先检查显微镜、磁力搅拌器及离心机是否好用，提前三小时把小牛血清、胰酶、抗生素拿出来化开。

其余未冻药品也提前20分钟拿出来缓和一下。

新洁尔灭（0.1％）泡纱布（用10ml5％的新洁尔灭加水至500ml即得），消毒地面（1：500的84液）。

用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。

物品：白大衣、饭盒小剪子、小镊子（4套）（一套剪皮肤、一套开胸取心，一套剔除心缘纤维组织，一套剪碎心脏）瓶皿（2套）[两个小圆培养皿，培养皿内加DMEM液，先后装取出的心和剔出纤维组织后的心] [一个小烧杯装碘酒和酒精棉球]250ml烧杯3个[一个用于水浴，事先加好水，最好是一或二蒸] [一个装0.1％新洁尔灭150ml左右，消毒小鼠]500ml烧杯1个，用作废液缸。

50ml烧杯3个（剪碎心肌组织，最后配液）三角烧杯（50ml）+小转子（小转子，酒精擦，双蒸水冲后，再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压）离心管及帽（12-14个），两个试管吸管（5~8个）大镊子（两把，持物，例夹棉球等）台面：磁力搅拌器、纱布（事先用于托盘装0.1％新洁尔灭浸泡）、试管架、泡沫塑料板、五个针头（不用消毒）75％酒精棉球及碘酒（消毒棉球，泡酒精、碘酒）大镊子两把（一把夹棉球，一把取鼠）、3个250ml烧瓶（一个装一蒸水，一个装新洁尔灭，另一为空的备用）1个500ml烧瓶（废液缸）、温度计、PH试纸（事先调PH值）、酒精灯、打火机/火柴、载玻片（5-10个）[用于培养前看接种密度及消化后看细胞密度]、注射器5ml 6个（胰酶、DMEM、小牛血清）1ml 2个（双抗液）20ml备用2个、微量加样器1000ml及500ml以上物品均用紫外线照30分钟。

另外准备手套、帽子、口罩、24孔培养板、离心机+一把小锁、未冻药品及DMEM、HCL、NaHCO3、小牛血清。

中国组织工程研究第16卷第14期 2012–04–01出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research April 1, 2012 Vol.16, No.14 ISSN 1673-8225 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH2593 Department of Orthopedics, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, ChinaChen Bao★, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, Chinayunqingcb@ Corresponding author: WangGuang-lin: Doctor, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, Chinawglfrank@ Supported by: the National Natural Science Foundation of China,No.30772204* Received: 2011-12-12 Accepted: 2012-01-20遗传霉素(G418)纯化许旺细胞过程中成纤维细胞胞浆空泡化的光镜观察*★陈宝，史晓远，向宁，王光林Cytoplasm vacuolization of fibroblasts during purification of Schwann cells by geneticin (G418): An optical microscope observation and analysisChen Bao, Shi Xiao-yuan, Xiang Ning, Wang Guang-linAbstractBACKGROUND: Geneticin (G418) combined with differential adhesion method and differential detachment method are used toeliminate the contaminated fibroblasts in the purification of Schwann cells. Most of the researches prefer to describe purity ofSchwann cells, rather than give a description of cell morphology change and its probable cause during the purification process.OBJECTIVE: To describe the pathological changes of fibroblasts through the morphological photos of purified fibroblasts andSchwann cells at different time points taken by optical microscope.METHODS: Schwann cells were isolated from sciatic nerves of rats by geneticin (G418) combined with differential adhesionmethod and differential detachment method in primary cultivation. The cultivated cells were divided into two groups. In theexperimental group, the cells were transferred to another 6-well plate after once differential adhesion, and the waste productaccumulated medium was changed to fresh basal medium every 2 days, the differential detachment method was used topassage. In the control group, cells were given differential detachment once again and transferred to another 6-well tissue cultureplate, and the waste product accumulated medium was changed to fresh purification medium every 2 days, the differentialdetachment method was used to passage. Cytopathologic changes of fibroblasts in different periods were observed by opticalmicroscope.RESULTS AND CONCLUSION: Cytopathologic changes of fibroblasts could not be observed under optical microscope in earlystage of the purification, the proliferation of the fibroblasts was decreased and the cytoplasm vacuolization of fibroblasts wasobserved obviously after cells were sub-cultured for three times or more (three to four weeks). Fibroblast proliferation wasrestricted in early stage of the Schwann cells purification process by geneticin (G418), but cytoplasm vacuolization of fibroblastsdelayed to the third generation or more.Chen B, Shi XY, Xiang N, Wang GL.Cytoplasm vacuolization of fibroblasts during purification of Schwann cells by geneticin(G418): An optical microscope observation and analysis.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2012;16(14): 2593-2596.[ ]摘要背景：以往研究应用遗传霉素(G418)联合差速贴壁及差速分离法除去成纤维细胞用于许旺细胞的纯化，对纯化过程中成纤维细胞形态变化的描述及可能其原理的推测很少。

naoh法提取鼠尾dna的原理宝子！今天咱们来唠唠NaOH法提取鼠尾DNA的原理，这可超有趣的呢！咱先说说鼠尾，你看那小小的鼠尾，里面可是藏着好多秘密，就像一个小宝藏盒，而DNA就是其中超级珍贵的宝贝。

那NaOH在这个提取过程里就像是一个超级英雄。

NaOH啊，它是一种强碱。

当我们把鼠尾放到有NaOH的溶液里时，就像是给鼠尾来了一场特别的“洗礼”。

鼠尾的细胞呢，外面都有一层细胞膜，这细胞膜就像一个小卫士，守护着细胞里面的各种东西，包括我们想要的DNA。

但是呢，NaOH可不管这个小卫士有多厉害，它会和细胞膜里的一些成分发生反应。

细胞膜主要是由磷脂双分子层构成的，还有一些蛋白质啥的。

NaOH就像一个调皮的小捣蛋，它会把磷脂双分子层给打乱，就像把一堆整整齐齐的小积木给弄乱了一样。

那些蛋白质呢，也被NaOH搞得晕头转向，结构都被破坏啦。

这么一来，细胞膜就被攻破了，细胞里面的东西就都能跑出来了。

细胞里面有好多东西，像蛋白质啊，RNA啊，还有我们心心念念的DNA。

可是这时候它们都混在一起，就像一锅大杂烩。

但是呢，DNA相对来说比较稳定。

它的结构是双螺旋的，就像一个超级精致的小螺旋楼梯。

在这个碱性的环境里，其他的物质可能会被NaOH进一步影响，比如说一些蛋白质会被水解。

这就好比在一群小伙伴里，有些小伙伴比较脆弱，在这种特殊环境下就被改变了，而DNA就像一个坚强的小战士，还稳稳地保持着自己的状态。

然后呢，我们会进行一些后续的操作。

比如说，我们会调节溶液的酸碱度。

因为NaOH让溶液变得太碱了，DNA虽然稳定但也需要一个合适的环境呀。

我们就会加入一些酸性的物质来中和。

这就像是给这个混乱的小世界重新建立秩序一样。

当酸碱度合适的时候，DNA就更容易被我们分离出来。

而且啊，在这个过程中，我们可能还会用到一些其他的试剂或者操作来进一步纯化DNA。

比如说离心，就像把不同重量的东西分开一样。

那些被破坏的细胞膜碎片啊，被水解的蛋白质啊，就会和DNA分离开来。

体外培养雪旺氏细胞三种方法的比较【摘要】目的找到一种适合修复周围神经缺损要求的雪旺氏细胞培养方法。

方法分别采用三种不同方法进行雪旺氏细胞培养,并比较各种方法培养的雪旺氏细胞的生长情况及纯度。

结果先用酶消化后组织块贴壁培养的的方法,雪旺氏细胞“爬出”速度较直接组织贴壁培养方法快,但较直接酶消化法慢,而纯度均较其他二种方法高。

结论先用酶消化组织块,后再将组织块贴壁培养的方法【关键词】雪旺氏细胞;体外培养;新方法雪旺氏细胞是周围神经的一种胶质细胞,是周围神经的髓鞘细胞,排列成串,一个一个的包裹着周围神经轴突,其外面包有一层基膜。

在有髓神经纤维中,雪旺氏细胞形成神经的髓鞘,是周围神经系统的髓鞘形成细胞,在周围神经再生中起重要的作用,对于周围神经缺损修复有重要的意义。

故体外培养雪旺氏细胞是神经生物学研究的一个重要方面。

本文作者通过对三种不同方法培养出雪旺氏细胞的速度和纯度进行比较,找到一种简易的、稳定的、受外界影响小的、高纯度、大数量的雪旺氏细胞培养法。

1材料与方法1.1设备及试剂普通显微镜、显微手术器械、CO2培养箱(德国产)以及普通细胞培养器材一套,直径50mm一次性培养皿(德国生产)若干个,D-Hank,s液,含10%胎牛血清(杭州四季青产)的F12(Hyclone产)+DMEM(Gibco产)培养液(F12+DMED=1∶1),IV型胶原酶(Gibco产),胰蛋白酶(Sigma公司),EDTA(华美公司)。

1.2雪旺氏细胞的取材注射过量的水合氯醛处死出生3d的SD乳鼠6只,浸于75%医用酒精消毒3min,取出用无菌D-Hank,s液反复冲洗4次,在无菌条件下取出坐骨神和臂层神经,解剖显微镜下仔细剥除神经基膜,再用D-Hank,s液反复冲洗3次,用显微手术剪,将组织块剪成约2mm长的组织碎块,再用D-Hank,s液反复冲洗3次,吸干,置于一次性离心管中。

1.3雪旺氏细胞的培养1.3.1酶消化、组织块贴壁培养往上述离心管中加入等体积0.5%的胰蛋白酶和0.06%IV型胶原,使二者的总体积约为组织块体积的4倍。

体外诊断试剂胶乳比浊法学习胶乳免疫比浊法相关知识很多公司开展了荧光胶乳免疫层析做定量分析及胶乳增强免疫比浊分析项目，关注胶乳标记技术的技术人员越来越多。

本人总结了部分胶乳微球标记技术，并加以分类，以便朋友们查阅：胶乳微球物理吸附：反应微球带磺酸基、羧基、醛基表面的都是疏水微球，都可以用来设计被动吸附蛋白。

磺酸基微球表面含带有负电荷的磺酸基团，pka 大约为2，因此在酸性pH保持稳定。

醛基微球表面也带有磺酸基团，但能和蛋白行程共价键。

羧基微球表面含带负电荷的羧基基团，在pH5.0以上时保持稳定。

带有疏水基团的蛋白的吸附和配位结合，是最简单和直接的标记方法。

这种方法中，微球溶液和含目标蛋白的溶液混合，反应后，未结合的游离蛋白通过清洗步骤除去，从而获得胶体蛋白复合物。

疏水吸附方法只能用于疏水微球（硫酸盐、羧基、醛基表面修饰的微球）。

醛基表面修饰微球是一个特例，其疏水吸附结果取决于后来的共价结合。

虽然物理吸附是不依赖pH的，但反应缓冲液的pH对蛋白的结构有非常大的影响，从而影响蛋白吸附到微球上的反应效率。

一般，在被吸附蛋白等电点附近pH时，物理吸附效率会很高。

反应步骤：1.用反应缓冲液系数蛋白到10mg/ml；2.用反应缓冲液系数胶乳微球到1%；3.将蛋白溶液加入到胶乳微球溶液中，10ml胶乳中加入1ml蛋白溶液。

室温搅拌孵育2hr；4.离心或超滤，除去未结合蛋白；5.将微球蛋白复合物用储存缓冲液溶解。

注意事项：1.最优蛋白标记量影响因素1）有效比表面积：粒径减小时，比表面积/mg微球值得增加；2）胶体稳定性：蛋白对胶乳有稳定和去稳定作用；3）免疫反应：最近标记量由免疫反应需要决定。

2.胶乳微球中加入蛋白后，快速搅拌混合，利于反应均衡。

反应体积是1ml时，可用移液器吸取蛋白加入微球中，并吹打数次。

如果反应体积较大时，用烧杯，边搅拌边加入蛋白，3.储存缓冲液和反应缓冲液不同时，抗体有脱落的可能；4.表面活性剂能使得抗体从胶乳中脱落，所以应避免加入。

小鼠乳腺上皮细胞体外原代培养方法研究进展摘要综述了有关于小鼠乳腺上皮细胞体外原代培养方法的研究进展,阐述了乳腺细胞培养的意义,介绍了乳腺组织原代培养的过程,并分析了所取得的研究成果。

关键词小鼠;乳腺上皮细胞;原代培养;细胞工程原代培养即直接从有机体摘取细胞、组织或器官,使其在体外维持与生长。

合适的培养条件对体外培养细胞的生存和增殖都十分重要。

一般而言,不同动物、不同组织器官来源的细胞对培养条件的要求存在一定差异,因此,需要使体外环境下的培养条件尽可能地模拟体内环境。

体内乳腺组织的增殖、分化和组织结构重塑受内环境(如类固醇、生长因子、结合蛋白及细胞外基质间复杂的相互作用等)因素的影响和作用,这些因素同样也影响体外培养乳腺上皮细胞的增殖分化和功能表现。

对于某种动物特定组织细胞的体外培养,对培养液、添加因子、附着底物及培养温度、pH值等都需进行仔细的选择,乳腺上皮细胞的体外培养建立在乳腺上皮原代培养细胞的基础上,针对不同的研究目的应采取不同的培养方法,以对细胞进行分化诱导。

张以涛比较了不同pH值、不同血清浓度配比的生长培养液对小鼠乳腺上皮细胞生长的影响,结果表明, pH值7. 4含10%血清的培养基为最佳生长液。

现代研究普遍认为,内分泌激素在乳腺上皮细胞发育各个阶段都发挥影响作用,不同时期乳腺组织的形态、组成及功能均有差异,这对选择乳腺上皮细胞体外培养的取材时间有指导意义。

张以涛比较了取自不同时期乳腺上皮细胞的生物学特性,得出妊娠期细胞生存、增殖能力均强于泌乳期细胞,妊娠期小鼠乳腺为获得细胞的最佳取材时期。

乳腺上皮细胞的原代培养,首先是尽可能地分离出乳腺上皮细胞,同时减少分离过程对细胞的损伤和浪费,以及通过采用一定的方法,使最终得到富集的乳腺上皮细胞及杂质细胞尽可能少甚至被完全清除。

1乳腺细胞培养的意义将动物细胞或组织在体外进行培养,能有效排除神经体液等因素对其造成的影响,可直接进行药物对细胞的活动代谢、毒性和杀伤作用等检测,如秦君等以王不留行为试验材料,对其3类主要成分(皂甙类、黄酮甙类及香豆素类)进行提取,分别以不同浓度添加到细胞培养液中,寻找王不留行促进泌乳的有效成分。

新生大鼠雪旺细胞原代培养方法改良陈祥;赵明;周华山;胡火珍【摘要】对常用的阿糖胞苷处理及差速贴壁法进行大鼠雪旺细胞原代培养及纯化的方法进行改进.先用阿糖胞苷处理杀死大部分的成纤维细胞,再用抗-Thy-1.1抗体和兔补体处理去除残余成纤维细胞,获得纯化的雪旺细胞.此外,我们对抗-Thy-1.1抗体和兔补体的浓度、处理时间等都进行了改进,避免了由于雪旺细胞状态不好而引起的大量雪旺细胞死亡.此方法能够将雪旺细胞的纯度由90％提高到99％.【期刊名称】《四川动物》【年(卷),期】2012(031)003【总页数】4页(P464-467)【关键词】雪旺细胞;原代培养【作者】陈祥;赵明;周华山;胡火珍【作者单位】四川大学生命科学学院,成都610064;四川大学生命科学学院,成都610064;四川大学生命科学学院,成都610064;四川大学生命科学学院,成都610064【正文语种】中文【中图分类】Q95-33;Q421雪旺细胞是外周神经系统的主要胶质细胞，在外周神经保护、促进外周神经纤维生长、构成髓鞘等方面具有重要的功能。

它能促进神经发育过程中轴突的生长，促进神经修复和再生(Dezawa，2002)，保证神经纤维功能正常行使。

雪旺细胞的病变能够引起多种疾病，如病理条件下的雪旺细胞是神经纤维瘤的主要形成细胞(Krasnoselsky et al.，1994)。

为了深入相关研究，需要通过培养获得高纯度的雪旺细胞。

目前常用的原代培养法获得的雪旺细胞纯度不高，细胞大量损失，获得的雪旺细胞数量少。

本研究对培养方法进行改良，能够弥补上述缺点，获得大量的高纯度的雪旺细胞。

现报道如下。

新生1～3 d的野生型SD大鼠5只，human neuregulin-β-1 EGF domain(R＆D cat#396-HB-050)，Forskolin(Sigma，F6886)，trypsin(Gibco cat#15090-046)，阿糖胞苷(Sigma cat#C6645)，L-15 培养基(Gibco cat#11415-064)，anti-Thy-1.1 antibody(Serotec cat#MCA04G)，rabbitcomplement(Calbiochem cat#234400)，s100(abcam cat#ab34686)。

DOI ：10.3969/j.issn.1672-9463.2020.04.002乳鼠心肌细胞片状生长的分离、培养及纯化张宇　杨帆【摘要】　目的　探讨乳鼠心肌细胞分离、培养的方法与条件，从而在体外实验中得到纯度、存活率更高的心肌细胞。

方法　出生24h 内C57BL/6J 乳小鼠，开胸分离出左心室并剪碎，用0.1%胰酶与0.1%胶原酶Ⅱ型的混合液消化心肌组织，并用两次差速贴壁法纯化心肌细胞。

在倒置光学及荧光显微镜下观察细胞形态，并计数心肌细胞搏动次数，通过台盼蓝染色法检测细胞存活率。

结果　心肌细胞培养24h 后基本全部贴壁，伸出伪足；培养48h 后，细胞伪足逐渐增多呈局部片状；培养72h 后，大部分心肌细胞的突起相互交联，形成片状。

培养第2天细胞存活率达到（95.33±2.51）%。

…结论　本研究方法所培养的心肌细胞具有存活率高、纯度高及稳定性强等优势，有利于加强心肌细胞的基础实验研究。

【关键词】　心肌细胞　原代培养　改良　存活率　片状生长Isolation, culture and purification of flaky growth of neonatal rat cardiomyocytes Zhang Yu, Yang Fan. Department of Cardiology, Xixiu District People's Hospital of Anshun City, Anshun 561000【Abstract 】　Objective To…investigate…the…methods…and…condition…of…isolation…and…culture…of…the…neonatal…rat…cardiomyocytes,…acquire…the…higher…purity…and…survival…of…cardiomyocytes…in…vitro.…Methods The…C57BL/6J…mice…in…24…hours…of…birth…were…executed…to…obtain…the…left…ventricle.…The…left…ventricle…tissues…were…digested…by…the…mixture…（containing…0.1%…trypsin…and…0.1%…collagenase…type…Ⅱ）…for…isolation…and…then…were…purified…by…twice…adherence.…The…morphology…and…beats…of…cardiomyocytes…were…detected…by…microscope…and…the…cellular…survival…rates…were…measured…by…Trypan…Blue.…Results The…cardiomyocytes…were…adherent…after…24…hours…with…the…protruding…portions.…The…protruding…portions…were…partly…extended…flakily…after…48…hours.…Most…of…cardiomyocytes…were…cross-linked…through…the…increased…protruding…portions…after…72…hours.…The…cellular…survival…rate…was…about…（95.33±2.51）%…after…48…hours.…Conclusion The…high…survival…rate,…purity…and…stability…of…cardiomyocytes…can…be…obtained…by…our…improving…method,…which…could…enhance…the…basic…researches…in…cardiomyocytes.【Key words 】　Cardiomyocyte Primary…culture Improving Survival…rate Flaky…growth▲基金项目：国家自然科学基金资助项目（编号：81960083）；安顺市科技计划项目（编号：安市科社[2019]07号）作者单位：561000　贵州省安顺市西秀区人民医院心内科（张宇）；贵州省人民医院心内科（杨帆）通讯作者：杨帆，E-mail：*********************随着社会进步与人们生活水平提高，心血管疾病的发病率日趋增高并逐步年轻化[1]，心血管疾病研究一直是科研工作者不断探索及关注的领域。

《Lactobacillus pantheris TCP102胞外多糖的提取纯化和功能特性研究》篇一一、引言乳酸菌是一类广泛存在于人体肠道中的有益微生物，其产生的胞外多糖（Exopolysaccharides, EPS）具有多种生物活性，如增强免疫力、抗肿瘤、降血压等。

Lactobacillus pantheris TCP102作为一种具有潜力的乳酸菌株，其胞外多糖（EPS）的提取纯化和功能特性研究具有重要意义。

本文旨在探讨Lactobacillus pantheris TCP102胞外多糖的提取纯化方法，并对其功能特性进行深入研究。

二、材料与方法1. 材料（1）菌种：Lactobacillus pantheris TCP102；（2）培养基：MRS培养基；（3）试剂：乙醇、丙酮、氯化钠等。

2. 方法（1）胞外多糖的提取：采用离心法、超声波法等；（2）纯化：采用透析法、柱层析法等；（3）功能特性研究：通过体外实验、动物实验等方法。

三、胞外多糖的提取与纯化1. 提取将Lactobacillus pantheris TCP102接种于MRS培养基中，培养至对数生长期，离心收集上清液。

采用离心法、超声波法等方法进行胞外多糖的提取。

其中，离心法是通过高速离心使菌体与上清液分离，收集上清液中的多糖；超声波法则是通过超声波对菌体进行破碎，释放出胞内和胞外的多糖。

经过多次试验，发现超声波法提取效果较好，能够获得较高纯度的胞外多糖。

2. 纯化纯化过程中，采用透析法、柱层析法等方法对提取的多糖进行纯化。

透析法是通过将多糖溶液置于半透膜中，利用浓度差使小分子物质透过膜而大分子物质留在膜内，从而达到纯化的目的。

柱层析法则是通过不同孔径的层析柱对多糖进行分级纯化。

经过纯化后的胞外多糖纯度较高，可用于后续的功能特性研究。

四、功能特性研究1. 体外实验通过体外实验研究Lactobacillus pantheris TCP102胞外多糖的生物活性。

贴壁法体外培养纯化鼠骨髓间充质干细胞【摘要】目的研究贴壁法体外分离、纯化及增殖鼠骨髓间充质干细胞（MSCs)，并进行鉴定。

方法取出生5 d的Wistar乳鼠的股骨及胫骨，冲取骨髓，采用贴壁法分离筛选分离鼠的MSCs，通过传代进行纯化，增殖，测定其生长曲线，检测生长周期，流式细胞仪分析表面抗原。

结果贴壁培养法能够有效地分离鼠的MSCs，MSCs形态为均一的梭形，生长曲线呈S型，细胞周期显示第三代细胞约有80.89％处于G0/G1期，第三代以后细胞表面抗原CD90阳性，CD34、CD45阴性。

结论建立了一种较好的体外培养、纯化及扩增鼠MSCs的方法，适用于MSCs的进一步研究。

骨髓间充质干细胞（MSCs)来源于中胚层，具有多向分化潜能，在不同诱导条件下，可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞分化，而且具有来源广泛、易于培养和移植、体外基因转染率高等特点，显示了在细胞和基因治疗中良好的应用前景，已引起了广泛的关注〔1〕。

本实验研究鼠的MSCs体外分离纯化、培养和鉴定，为进一步探讨MSCs的应用提供基础。

1 材料与方法1.1 材料清洁级出生5 d的Wistar乳鼠（8.0～10.0 g），购自吉林大学实验动物中心。

主要试剂：DMEM培养基（美国GibcoBRL公司），胎牛血清（美国Hyclone公司），兔抗鼠CD90、CD34、CD45荧光直标抗体（美国BD公司），RNA酶、碘化丙啶(Sigma公司)，0.25%胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)及二甲基亚砜(DMSO)(华美生物工程公司)、青霉素、链霉素(华北制药厂)。

1.2 方法1.2.1 MSCs的体外分离与培养选用出生5 d Wistar乳鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡片刻，无菌条件下分离股骨、胫骨，剪除骨两端，用5.0 ml L��DMEM培养基，冲出骨髓于培养皿内，经吹打制成细胞悬液，1 500 r/min离心5 min，弃上清。

用10 mlL��DMEM重悬细胞，将悬液经1.0 ml注射器和200目滤网过滤成单细胞，用含20%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/ml链霉素的L��DMEM培养液重悬。

免疫磁珠法分离纯化乳鼠肾血管周细胞王丽;马跃荣【期刊名称】《现代医药卫生》【年(卷),期】2016(032)016【摘要】目的：通过建立肾原代细胞培养，探讨免疫磁珠分离纯化乳鼠肾血管周细胞的方法。

方法选取健康BALB/c乳鼠肾脏，剪碎、消化和过滤制成细胞悬液，原代培养并传代（传3代）。

免疫磁珠法分离出神经胶质细胞2型硫酸软骨素糖蛋白（NG-2）；倒置相差显微镜观察细胞形态特点，免疫细胞化学检测NG-2、平滑肌肌动蛋白（SMA）和CD31表达，BrdU法检测细胞增殖活性，鉴定是否符合周细胞特征及纯化后的细胞是否具有增殖活性。

结果纯化后获取的细胞宽大扁平，形态呈梭形、三角形或多边形并有突起。

细胞核椭圆居中，多为单核，偶为双核，细胞质丰富，无接触性抑制生长，符合周细胞形态及生长特征。

NG-2和SMA免疫细胞化学染色阳性表达，CD31免疫细胞化学染色阴性表达，符合周细胞特点。

分离纯化后的细胞48、72 h细胞增殖率分别为（0.37±0.11）%、（0.42±0.10）%。

结论免疫磁珠法可使周细胞从细胞成分复杂的肾组织中分离出来，并具有生物活性，可继续体外培养，为后续研究提供参考依据。

%Objective To establish the primary culture by renal cells and to investigate the isolation and purification method of sucking mice renal vessel pericytes by the imunomagnetic bead technique. Methods The kidney of healthy BALB/c sucking mice was selected,cut into pieces,digested and filtered for preparing the cellular suspension. The primary culture and passage(3 generations)were performed;the mimunomagnetic bead techniqueisolated neurogliocytes(NG-2);the inverted phase contrast microscope was adopted to observe the cellular morphological characteristics ,the immunohistochemistry was used to detect NG-2,SMA and CD31 expression by joint judgement,the cellular proliferation activity was detected by using the BrdU method. Whether meeting pericytes characteristics and whether purified cells having the proliferation activity were identified. Results The cells obtained by purification were wide and flat,the morphologies were fusiform, triangle or polygon with prominence. The cellular nucleus was ellipse and in the middle,the majority were mononucleus,occasionally bi-neucleus,with plentiful cytoplas-ma,without contacting inhibition growth,which conformed to the pericytes morphology and growth characteristics. NG-2 and SMA were positively expressed by immunocytochemical staining,CD31 was negatively expressed,which conformed to the pericytes characteristics. The 48,72 h proliferation activities of isolated and purified cells were (0.37±0.11)%and (0.42±0.10)%respec-tively. Conclusion The imunomagnetic bead method can make the pericytes to be isolated from the kidney with complex cellular compositions,which have biological activity,can continuously culture in vitro and provide the reference basis for subsequent study.【总页数】3页(P2453-2455)【作者】王丽;马跃荣【作者单位】成都中医药大学附属医院病理科，四川成都610036;成都中医药大学附属医院病理科，四川成都610036【正文语种】中文【相关文献】1.免疫磁珠法原代分离培养大鼠视网膜微血管周细胞 [J], 王应利;郭斌;惠延年;张晓光;陈立军;马吉献2.免疫磁珠法分离纯化人肾癌CD133+细胞实验研究 [J], 吴恭瑾;卢建忠;杨宁强;杨发英;岳中瑾3.免疫磁珠法在分离纯化外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群中的应用 [J], 莫雪安;周礼圆;秦超;张德敏;赵伟金4.免疫磁珠法分离纯化胚胎大鼠脊髓源运动神经元的方法探讨 [J], 王菲; 王春芳; 李鹏飞; 蔚洪恩; 韩树峰; 李承罡5.免疫磁珠法分离纯化胚胎大鼠脊髓源运动神经元的方法探讨 [J], 王菲; 王春芳; 李鹏飞; 蔚洪恩; 韩树峰; 李承罡因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

抗体纯化的方法有哪些？抗体制备出来之后，需要进一步纯化得到纯的多抗或单抗，既有利于保存也有利于排除杂蛋白对结果的影响。

常规用于纯化的材料是腹水和细胞培养上清，而通常经过免疫制备的抗体大多数是IgG的各种亚型，以及少数是IgM，二者电泳条带分步大致如下：硫酸铵沉淀法：基本原理：高浓度的硫酸铵通过与球蛋白竞争水分子破坏蛋白表明的水化膜，降低球蛋白的溶解性，是分离免疫球蛋白的常用方法，而且不同的免疫球蛋白适宜的硫酸铵浓度也稍有差别，一般用来分离抗体的硫酸铵饱和度在33~50%。

适用于：鼠抗所有亚类、其他种属抗体、任何种属的IgM、IgG、IgA 基本操作：1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清；2.加入饱和硫酸铵至终浓度45%，静置沉淀蛋白；3.沉淀蛋白用最小体积PBS或硼酸盐缓冲液溶解，用PBS或硼酸盐缓冲液透析除盐；4.过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱，PBS或硼酸盐（含0.02%叠氮钠）缓冲液洗脱；5.电泳检测分子量大小，分光光度法测定抗体浓度；6.抗体保存浓度在0.1-30 mg/mL适宜，-20 ℃保存不超过一个月，避免反复冻融。

亲和层析法基本原理：基因工程改造的protein A和protein G能特异性结合哺乳动物IgG的Fc区段，将protein A和protein G结合到柱料上，通过亲和层析的方式，可将IgG及其亚类与片段纯化出来。

成员介绍：protein A分离自Staphylococcus aureus的细胞壁，分子量42 kDa，由spa基因编码，具有五个同型的免疫球蛋白结合结构域，每个结构域由三个α螺旋构成。

protein A的B结构域protein A的各个结构域protein A可结合多数免疫球蛋白的Fc段（尤其是人的IgG1、IgG2、IgG4，豚鼠，猕猴，鼠类IgG2a、兔）以及人VH3家族的Fab 段。

基因工程改造的protein A通常使用大肠杆菌作为表达宿主，表达产物仍含有五个Fc结合结构域。

宝枫林
新生鼠处死及表皮细胞提取
分离表皮细胞，需要新生鼠的皮肤全层。

不知道有血会不会有影响。

用乙醚试试？不会出血
方法一
一般用酒精擦拭全身以后，直接用剪刀断头处死，滴尽体内血，用棉球擦干净颈部血，然后大头针固定就好了，不到一分钟就行了，而且不会影响细胞的活力，也没有应激反应。

方法二
既然是要分离细胞要注意无菌操作
1、对乳鼠进行消毒：将乳鼠浸泡在75%的酒精中片刻，或用酒精擦拭乳鼠全身。

2、处死和放血：用无菌剪刀剪乳鼠的左腋下（相当于心脏的位置）彻底放血。

3、取材：取的表皮组织置无菌生理盐水或PBS液中清洗，再进行分细胞的处理。

方法三
1、将乳鼠浸泡在75%的酒精中浸泡5分钟。

（基本上喝酒都喝晕了，还顺便消毒）
2、再新洁尔灭浸泡5分钟（乳鼠已经挂了，再次消毒）。

3、捞出来，从颈部做一切口，尾部及四肢一切口，腹部一切口（注意不要切开腹膜），然后一拉皮就下来了。

取表皮干细胞就是这么取的，仅供参考！
方法四
1）、将表皮再次以0.25%胰酶37度下振荡消化8min左右，加入与胰酶等量的含10% FBS 的培养基终止消化后，充分吹打。

2）、1000rpm/min离心10分钟，弃去上清液及已消化的表皮。

3）、加入ESCs培养基，充分吹打，制成单细胞悬液。