药用野生稻愈伤组织诱导与分化探讨

水稻愈伤分化和再生研究进展朱克明;陶慧敏;徐硕;端礼钦;杨艳华【摘要】水稻是我国最重要的粮食作物,维持着超过半数人口的生存.转基因技术是水稻产量提高和质量提升的一个重要工具.然而,籼稻中大多数品种由于愈伤诱导困难以及分化率低,限制了转基因技术在籼稻中的应用.本文综述了基因型、外植体来源、培养基和外源激素对籼稻愈伤诱导和分化的影响,以及调控愈伤分化和再生的基因,为今后籼稻品种的进一步遗传改良提供理论依据.【期刊名称】《种子》【年(卷),期】2016(035)011【总页数】5页(P55-59)【关键词】水稻;愈伤组织;组织培养;转基因;籼稻【作者】朱克明;陶慧敏;徐硕;端礼钦;杨艳华【作者单位】江苏大学生命科学研究院, 江苏镇江212013;江苏大学生命科学研究院, 江苏镇江212013;江苏大学生命科学研究院, 江苏镇江212013;徐州市农水畜禽产品质量检测中心, 江苏徐州221003;江苏大学生命科学研究院, 江苏镇江212013【正文语种】中文【中图分类】S511水稻是禾本科模式植物，也是最重要的粮食作物之一，养活了全世界一半以上的人口[1]。

但是随着世界人口的不断增加，粮食供求也越来越紧张。

目前，主要通过传统育种提高水稻的产量，但是转基因育种具有周期短、适用对象广等特点。

由于粳稻品种愈伤分化和植株再生率较高，转基因育种在粳稻中已取得了可喜的成果，但是占整个水稻品种的80%以上的籼稻，由于愈伤组织诱导和植株再生率低造成遗传转化困难，严重地制约了转基因技术在籼稻中的应用[2-3]。

本文主要从影响水稻愈伤分化和再生因素以及调控基因等方面的研究进行综述。

水稻遗传转化采用最多的体系为愈伤组织再生系统，水稻体细胞组织培养作为水稻基因工程的基础技术，在水稻遗传改良中具有重要的作用。

利用愈伤组织再生系统具有以下优点： 1) 外植体来源广泛； 2) 繁殖速度快； 3) 易于接受外源基因； 4) 转化效率高[4]。

水稻愈伤组织的诱导实验报告This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020水稻愈伤组织的诱导一、实验目的1、掌握外植体的消毒方法和接种技术；2、了解愈伤组织诱导的过程。

二、实验原理以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。

愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。

外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。

对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展着剂（吐温20）以增强消毒效果。

三、实验材料与用具1、材料：水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）；2、试剂：75%酒精，2% NaCLO，无菌水(每组1瓶400mL)；3、培养基：诱导培养基：NB+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L（）；4、仪器设备：培养室、超净工作台、培养皿（￠9cm）2个、枪形镊、量筒（100mL）2个、三角瓶（50mL、无菌）2个、废液缸、保鲜膜、标签纸。

四、实验步骤1、接种室、培养基及用具表面消毒用75%酒精棉球试擦超净工作台、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。

之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。

2、种子去壳选取饱满、无霉变、成熟的水稻种子，手工脱去谷壳（注意保持胚完整），每人准备30粒去壳种子，并按照分组放到三角瓶中。

3、操作者双手的清洗与消毒在进入无菌室之前，各操作者先用自来水清洗干净双手并晾干，然后进入无菌室，坐在超净台前位子上后，用含75%酒精的酒精喷壶喷洒双手对双手进行消毒，在超净台风口待双手酒精风干后进入超净工作台。

（注意：酒精喷壶喷洒双手时切记不要把酒精喷到超净台的有机玻璃板上！）4、超净台面的表面消毒（以下工作在超净工作台内进行）用枪形镊子从含75%酒精棉球的容器中取一团棉球，仔细把整个超净台面擦试一遍，尽量降低超净台面的带菌量，并将废棉球丢到废液缸中，然后点亮超净台里面放置的酒精灯。

第五章 愈伤组织的诱导、形成及分化第一节 愈伤组织的诱导、形成及特点一、愈伤组织的诱导和形成愈伤组织是在离体培养条件下，经植物细胞脱分化和不断增殖所形成的无特定结构的组织。

经一段时间的生长和增殖以后，在其内部出现一定程度的分化，产生出一些具有分生组织结构的细胞团、色素细胞或管状分子。

植物外植体在培养基和外界环境的作用下，经过一个复杂的过程形成愈伤组织，即： 外植体＋培养基＋环境愈伤组织愈伤组织的形成一般可分为三个时期：诱导期、细胞分裂期和细胞分化期（见图4.1）。

图4.1 愈伤组织的形成特点1. 诱导期愈伤组织诱导期又称启动期，是指外植体组织受外界条件刺激后，开始改变原来的分裂方向和代谢方式，合成代谢活动加强，大量合成蛋白质和核酸物质，为细胞分裂做准备。

诱导期的长短因植物种类、外植体的生理状态和外部因素而异，即使是同一种物种不同基因型同一外植体的愈伤组织，其诱导期也不同。

有的植物愈伤组织诱导期只有1天（菊芋），而有的植物诱导期需要数天（胡萝卜）。

刚收获的菊芋块茎的诱导期仅22 h ，但经贮藏5个月后，诱导期延长为2天。

2. 分裂期外植体在培养基上经过离体诱导后，外层细胞开始发生分裂，细胞脱分化。

愈伤组织的细胞分裂快，结构疏松，缺少组织结构，颜色浅而透明（见图4.2）。

分裂期的细胞分裂局限在愈伤组织的外缘，主要是垂周分裂。

小麦幼胚 分裂期 分裂期分化期 分化期图4.2 小麦幼胚愈伤组织诱导分裂期与分化期（东北农业大学小麦研究室，李文雄，曾寒冰，胡尚连等，1994）愈伤组织进入分裂期时，外植体的脱分化因植物种类、基因型、外植体种类和生理状况而有很大差异。

烟草、胡萝卜等的脱分化很容易，而禾谷类则较难；花器官脱分化较易，茎叶较难；幼茎组织脱分化较易，而成熟的老组织较难。

进入分裂期的愈伤组织，如仍在原来的培养基上继续培养，某些愈伤组织将不可避免地发生分化，产生新的结构，但将其及时转移到新鲜的培养基上（继代培养），则愈伤组织可无限制地进行细胞分裂增殖，维持不分化的状态。

水稻愈伤组织转化一、实验目的1.掌握植物组织培养的基本原理；2.学习水稻愈伤组织的诱导方法；3.学习农杆菌转化法的原理，掌握农杆菌转化水稻愈伤组织的方法；4.学习转基因植株的各种鉴定方法（包括PCR检测、GUS染色、Southern-blot、Western-blot、FISH等），同时能够操作PCR与GUS染色鉴定的方法。

二、实验原理1.植物组织培养植物组织培养（plant tissue culture）是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体和花药等，在人工控制的培养基上培养，使其生长、分化以及形成完整植株的技术。

自1902年Haberlandt 首先用紫鸭跖草( Tradescantia )的叶片栅栏组织进行培养来，植物组织培养已有100余年历史。

用于离体培养的各种植物材料称为外植体（explant）。

根据外植体的类型，又可将组织培养分为：器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养以及原生质体培养等。

（从这个角度讲，本学期的实验属于胚胎培养。

）植物组织培养的理论基础是植物细胞全能性。

2.基因工程基因工程技术是在离体条件下对不同生物的遗传物质(DNA)进行人为“加工”，并按照人们的意愿重新组合，以改变生物的性状和功能，然后再通过适当的载体将重组DNA转入生物体或细胞内，并使其在生物体内或细胞中表达，从而获得新的生物机能。

这种利用基因工程技术获得的植物一般称为“基因工程植物”。

自1983年首次获得转基因植物以来，转基因技术发展十分迅速，成功进行转基因的植物已达60多种，在世界上批准进入田间试验的转基因植物已超过500例，有些转基因产品已进入市场。

通过基因工程改良作物品种在未来的农业生产中日益显示出巨大潜力。

3.农杆菌转化法转基因的方法有很多，对于植物而言，最常用的是农杆菌转化法和基因枪法。

农杆菌转化法使用的是根癌农杆菌，其内含Ti质粒：T-DNA（Transferre DNA）区：农杆菌Ti 质粒中向植物中转移并整合进植物基因组中的部分。

⑶先芽后根： 愈伤组织中产生多个分生细胞形成分生中心，从中仅分化出芽，一般情况下待芽 长到一定大小时，切下移入生根培养基中，在其基部即可分化出根。有些植物在分 化芽的培养基上同时在芽器官基部分化出根，形成完整的植株。大多数植物均属这 类正常的分化途径，这类苗移栽较易成活。 ⑷先根后芽： 有些植物外植体脱分化后在愈伤组织上先分化出根，而后在靠近愈伤组织的根部 上再分化出芽，有的将根切下放入分化培养基，再于根上分化出芽器官，甚至在根 端也能分化出芽。
长素降低些，尤其是使用2，4-D时。 一般地，经过继代培养的愈伤组织在稳定生长1～2代后，具有S型生长曲线。开 始一周生长缓慢，中间3周生长很快，4周以后生长又变迟缓。
第二节 悬浮培养
悬浮培养:一般是把一些小块生长旺盛的愈伤组织
放入液体培养基中，进行振荡培养，从而使愈伤 组织块变成良好分散性的细胞和小的细胞聚集体。 愈伤组织通过悬浮培养能产生大量的比较均一 的细胞，而且细胞增殖速度快，适宜进行大规模
（1）三角烧瓶容纳的培养基占总容积的20%～30%，培养基含量可随培养物量的减 少而减少； （2）转速一般为80～100 r/min； （3）细胞或愈伤组织的生长呈典型的S型曲线，即延滞期（lag phase），对数生长 期（log phase），然后逐渐减慢，直至停止。
3、愈伤组织的生长特性
一般情况下，25℃下培养的愈伤组织需要每4~6周继代一次。大多数研究工作表
官。可以把愈伤组织分化出芽、根器官概括为以下几种方式：
⑴单极分化： 愈伤组织中的分生中心在刺激物质的影响下向着一极分化，形成有根无芽或 者有芽无根的现象。 ⑵双极分化： 愈伤组织中随着细胞分裂出现两个或两个以上分生中心，其中有的分化芽， 有的分化根，根芽之间并无输导等组织沟通，在培养瓶内靠愈伤组织提供养料， 这种以愈伤组织隔离着的芽和根的苗，常常不能移栽成活。

水稻愈伤组织的诱导李希北京科技大学化学与生物工程学院生物科学与技术系，北京，100083摘要：以水稻种子为外植体，研究了外植体的消毒方法和接种技术，了解了水稻愈伤组织诱导的过程。

结果表明水稻种子接种在诱导培养基上两天已产生愈伤组织发芽2mm，四天愈伤组织呈现浅黄色发芽5-10mm，6天愈伤组织颜色加深发芽1-2cm，8天愈伤组织为橙黄色发芽2-3cm，无杂菌污染。

关键词：水稻种子外植体诱导愈伤组织引言自Niizeki和Oono1968年首次获得水稻花粉植株以来，水稻组织培养取得了很大的进展，如各种水稻品种愈伤组织的诱导、继代、植株再生培养基的筛选，遗传特性，基因工程转化体系的建立等等。

水稻种子愈伤组织的诱导是这些研究的基础，因此掌握外植体的消毒方法和接种技术，了解了水稻愈伤组织诱导的过程至关重要。

以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。

外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。

对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用。

本次试验使用的诱导剂为2,4-D，诱导率为100%。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1实验材料水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）；1.1.2仪器设备及用具超净工作台培养室、培养皿：￠9cm×2枪形镊量筒：100mL×2三角瓶：50mL×2(无菌)；废液缸；保鲜膜；标签纸1.1.3试剂及培养基试剂：75%酒精，2%NaCLO，无菌水(每组1瓶400mL)培养基：诱导培养基：MS+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L（pH5.8）1.2 实验方法1.2.1 MS固体培养基配制：由于实验室中的MS培养基已含有蔗糖和琼脂，所以直接按照41.5g/L的浓度配置。

实验中配置50ml培养基，需依次加入2.075gMS，0.1mg2,4-D；用NaOH或HCl调节PH=5.8；高压蒸汽锅121℃灭菌20min。

一、14年育种各论真题，有标注的大多是21年的育种考的。

二、填空题（每空1分，共20分）1、按作物的繁殖方式，品种群体类型大致可分为无性繁殖系群体、近交家系群体、异交群体和杂种品种群体四大类。

2、作物分子育种的研究与应用目前集中在分子标记辅助选择育种和转基因育种两方面。

3、我国水稻品种资源中三大矮源是指矮脚南特矮仔占低脚乌尖。

（自花授粉）、结实率低是籼粳杂交育种的最大障碍，克服其最好的途径是广亲和种质利用。

5、水稻花药培养中，诱导小孢子出愈伤组织的常用培养基是N6。

6、我国育成的自交系的种质来源中，来自我国的种质主要有旅大红骨、金皇后、塘四平头和获嘉白马牙4大种质。

（玉米）7、依据玉米子粒形状、胚乳淀粉的含量与品质等性状，将栽培玉米亚种分为有稃型、爆裂型、粉质型、甜质型、甜粉型、糯质型、马齿型、硬粒型和半马齿型9种类型。

（异花授粉）8、在油菜品质育种中，籽粒含油量与蛋白质含量是呈负相关的。

（异花授粉）9、油菜的品种间杂交育种中，对自交不亲和性的白菜型油菜，回交育种和轮回选择育种法最为常用。

7、油菜的品种间杂交育种中，甘蓝型和芥菜型油菜，均可采用系谱育种法和回交育种法，而且成效显著。

10、我国3大主棉区是指长江流域棉区、黄河流域棉区和新疆棉区。

11、当前我国棉花品种存在的问题是品质单一和抗逆性尤其是黄萎病有待加强。

单项选择题（每题1分，共10分）1、D 2、B 3、C 4、B 5、A 6、C 7、D 8、A 9、D 10、B1、下列水稻雄性不育类型属于配子体不育的是。

A 野败型和冈型B 冈型和红莲型C 冈型和BT型D 红莲型和BT型2、下列野生稻类型中，为普通栽培稻的祖先的是。

A 药用野生稻B 普通野生稻C 疣粒野生稻D 颗粒野生稻3、水稻花药培养中，诱导愈伤组织再分化的培养基通常采用培养基。

A B5B WhiteC MSD N64、在玉米细胞质雄性不育系类型中，育性败育彻底且抗玉米小斑病的类型是。

中国药用野生稻的高度遗传分化
L.－ZCao;邱敦莲;等
【期刊名称】《国外作物育种》
【年(卷),期】2002(021)005
【总页数】2页(P4-5)
【作者】L.－ZCao;邱敦莲;等
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】S511.9
【相关文献】
1.药用野生稻-栽培稻渗入系后代卷叶表型的遗传分析
2.药用野生稻(CC)-栽培稻(AA)异源单体附加系MAAL8的遗传分析
3.栽培稻×药用野生稻种间杂种基因组DNA甲基化的遗传与变异研究
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水稻成熟胚愈伤组织诱导及其植株再生新疆农业科学2007,44(6):889—891XinjiangAgriculturalSciences水稻成熟胚愈伤组织诱导及其植株再生危晓薇,王冬梅,祖木热木?吐尔逊(新疆农科院核生所,鸟鲁木齐830091)摘要:利用水稻成熟胚为外植体,接种在NB培养基上,分别附加不同的外源激素,以诱导愈伤组织并促其分化,最终获得水稻再生植株.结果表明:2,4一D对愈伤组织诱导起决定性作用,当它与低浓度的6一BA配比时更有利于前期愈伤组织的诱导,而高浓度的6一BA则有利于后期芽丛的分化.关键词:水稻;成熟胚;愈伤组织;再生植株中图分类号:$511文献标识码:A文章编号:1001—4330(2O0r7)o6—889—03 CallusInductionandPlantRegenerationofMatureEmbryosinRiceWEIXiao—wei,W ANGDong—mei,Zhumuremu?Tuerxun (InstituteofNuclearandBiologicalTechnologies,XinjiangAcademyofAgriculturalScienc es,Urumqi830091,China)Abstract:ThematureembryoswerecultivatedonNBmediawithdifferenthormones,byusin gthematureembryosinriceasexplants,andregenerationplantswereobtainedsuccessfully.Theresultssh owedthat2,4一DWasimportantfactorincallusinduction.Whenitisproportionaltolowconcentration6一BA,itisusefultocallusinduction,andwhenithasproportionalhighconcentration6一BA,itisnecessarytodi Ⅱ.eI℃ntiategreenbud.Keywords:rice;matureembryos;callusinduction;regenerationplant水稻体细胞组织培养作为水稻基因工程的基础技术,在水稻遗传改良中具有重要的作用.因此,建立一个高效再生体系是实现基因转化的先决条件.1965年,Amemiya等开始水稻组织培养,几十年来,研究者先后从水稻各部位诱导出愈伤组织和再生植株.虽然,幼穗,幼胚,花粉粒,花药愈伤组织诱导率高,愈伤组织质量好而受到青睐被广泛用于水稻的遗传转化,品种培育中.但上述材料多受季节限制,取材不便,阻碍了水稻组织培养的进一步发展.实验利用水稻成熟种胚作为外植体[1'引,通过不同培养基,不同激素类型及浓度对水稻成熟种胚愈伤组织诱导,分化进行了相关研究L2,4,5】,为提高水稻成熟种胚愈伤组织的质量和高效再生频率提供有效依据.1材料与方法1.1材料供试材料为早锦1号,秋田小町[6~8]两个水稻品种.1.2方法1.2.1愈伤组织诱导培养基基本培养基为N6大量元素,B5微量元素及有机成分,辅加水解乳蛋白300mg/L,谷氨酰胺250mg/L,蔗糖3Og/L,pH5.8.表11.2.2愈伤组织分化培养基以N6培养基为基本培养基,辅以水解乳蛋白O.5—1.0g/L,6一BA0.5—3.5mg/L,NAA1.0mg/L,硫酸铜1.5mg/L,蔗糖30g/L,pH5.8.1.2.3生根培养基以MS为基本培养基,蔗糖3Og/L,pH5.8.收稿日期:2007—08—29基金项目:新疆农作物生物技术重点实验室作者简介:危晓薇(1956一),女,湖南人,副研究员,研究方向为基因工程890?新疆农业科学44卷表1添加不同激素的诱导培养基Table1InductivesubsWatmnaddedwititdifferenthormones1.2.4外植体消毒以及培养方法选择饱满成熟的种子,手工剥去颖壳.在超净工作台上,用70%的乙醇浸泡种子30s.0.1%的Hl2溶液表面消毒8～10min,无菌水漂洗3～4次,浸泡过夜.用镊子,解剖刀取出灭菌种子的成熟胚,将其接种于愈伤组织诱导培养基中,26～28~C暗培养.诱导培养7d后,将初始愈伤组织从萌发的种胚上剥离后转到新鲜诱导培养基上,继续培养30d,统计出愈情况.经继代生长60d左右,挑选生长旺盛,自然分散,质地紧密,呈淡黄色颗粒状的愈伤组织接种于分化培养基上,26～28~C光照培养(14h光/10h暗,1500～20001)()诱导芽的分化.绿芽分化后,把绿芽转人生根培养基中,直至成为完整小植株.2结果与分析2.1不同培养基及激素种类与浓度对愈伤组织诱导分化的影响比较Ms,N6,B5三种培养基的无机盐及有机成分,发现用N6培养基的无机盐,B5有成分和微量元素对诱导水稻成熟种胚愈伤组织较适宜.比较6一BA,2,4一D,KT等激素,发现分裂素6一BA0.2—3.5mg/L与生长素,NAA,2,4一D2mg/L进行配比有利于愈伤组织诱导和芽分化.另外,在培养基中适当加入水解乳蛋白,谷氨酰胺和硫酸铜对愈伤组织的诱导和芽丛分化都有一定促进作用.表2表2不同激素浓度配比对愈伤组织诱导的影响(以秋田小町为例)Table2Effectofdifferenthormoneconcentrationoncallusinduction (TakingAkitakaomaqiasanexample)2.2愈伤组织的获得和芽的分化按上述条件和方法进行愈伤组织的诱导,接种7d后即可看到种胚上有初始愈伤出现.15d后愈伤组织形成.继代40d后两个供试材料都诱导出大量的愈伤组织.其中,在2,4一D2mg/L,6一BA0.5mg/L组合中诱导的愈伤质地较硬,淡黄色颗粒状,分散性好.实验表明,这类愈伤组织通过在分化培养基上继代培养30d左右就可以观察到绿芽点的出现,继代培养30～40d就可见小苗生长.图1～32.3再生植株的获得一将生长长度1cm左右的芽丛切下后,接种在生根培养基中,20d左右逐渐生根,30d 后形成根系,此时,地上部分生长迅速,获得完整再生小植株.图4.6期危晓薇等:水稻成熟胚愈伤组织诱导及其植株再生?89l?图1秋田小町的初始愈伤组织Fig.1Imtialcallusof.4ddmlmomaqi图3秋田小町的绿色丛芽Fig.3GreenclumpingbudsofAkitakaomaqi3小结图2秋田小町的大量胚状体组织Fig.2GreatnumberofembryoidofAkitakaomaqi图4秋田小町的完整植株Fig.4WholeplantofAldta~omaqi3.1水稻由于其基因组小,通过组织培养易获得再生植株等特点而在基因克隆,基因功能验证以及遗传转化等研究方面成为模式植物.在实验中,选取了两个水稻品种,查阅国内大量水稻遗传转化的相关文章,对培养基做了适当调节,早锦1号和秋田小町均获得再生植株.在水稻组织培养过程中,发现外源激素是愈伤组织诱导和绿苗分化的关键因素,尤其是2,4一D和6一BA的适宜配比对水稻成熟胚愈伤组织诱导起着决定性作用.3.2新疆水稻种植面积少,主要集中在阿克苏和米泉等地.实验所用秋田小町是新疆当前水稻生产上的主栽品种之一,种植面积约占全疆水稻总面积的1/3.通过组织培养,已经得到了秋ftt4,町的再生植株,现正在对新疆其它水稻栽培品种进行再生植株的培养,这为新疆水稻的遗传转化,功能基因验证等研究贮备了前期条件.参考文献:[1]郑贵朝,胡事君.提高水稻愈伤组织植株再生能力几种方法的评价[J].杂交水稻,2005,2o(2):54—57.【2]李玉静,陈彦龙.2,4一D和6一BA对水稻愈伤组织培养力的影响[J].河北师范大学(自然科学版),2005,29(4):395—403.[3]周玲艳,秦华明.提高水稻愈伤组织再生频率的研究[J].种子,2006,25(7):28—31.[4]陈兴春,牛蓓.水稻愈伤组织分化与不同激素配比关系的研究[J].四川大学(自然科学版),2006,43(1):222—227.[5]姜华,陈静.ABA对水稻愈伤组织,不定胚发育及其植株再生的影响[J].作物,2006,32(9):1379—1383.[6]梁乃亭,魏玉波.优质水稻秋田町及其栽培技术[J].新疆农业科学1997,(2):51—52.[7]魏玉波,布哈丽且木,粱乃亭.新疆水稻优质栽培技术[J].新疆农业科学,2002,39(5):307—309.[8]魏玉波,梁乃亭,布哈丽且木,等.优质水稻品种39及栽培技术[J].新疆农业科学.2004.41(6):448—449.。

《细胞工程》综合实验——水稻愈伤组织的诱导和分化摘要本实验以水稻成熟种子为实验材料，通过NB诱导、分化培养基培养，诱导出愈伤组织并使其分化形成新的水稻幼苗。

在植物组织培养过程中，外植体生长所必需的营养成分和生长因子，主要由培养基提供不同材料对培养基的要求不尽相同，适当地设计和选用培养基，对组织培养取得成功是至关重要的。

以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养都能形成愈伤组织。

愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。

外植体如果是带菌的，在接种前都必须消毒。

对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展著剂（吐温20）以增强消毒效果。

消毒效果的好坏，直接决定后期培养的成功率。

如果染菌率太高，后期培养可能无法继续下去。

本次实验就是通过组织培养的整个过程，来了解各个步骤的相关知识。

关键词：水稻愈伤组织诱导再分化目录1 前言 (3)2 材料与方法 (4)2.1 仪器 (4)2.2 设备 (4)2.3 试剂 (4)2.4 实验材料 (4)3实验方法 (5)3.1 配母液 (5)3.2 配NB诱导、分化培养基 (5)3.3 高温高压灭菌 (6)3.4 接种室、培养基及用具表面消毒 (6)3.5 消毒剂的配制 (6)3.6 种子去壳 (6)3.7 外植体消毒 (7)3.8 接种与观察（愈伤组织的诱导） (7)3.9 愈伤组织的再分化观察 (7)4 实验结果 (7)4.1愈伤组织的诱导与分化 (7)4.2 实验结果分析 (9)5 讨论分析 (11)5.1愈伤组织的诱导问题分析 (11)5.2愈伤组织再分化问题分析 (12)5.3 操作分析 (13)参考文献 (14)1 前言在我国,愈伤组织的培养和应用已经越来越多以及成熟，如：优良植株的无性繁殖、无病毒植株的获得、优良植株的选育等等。

同时，随着消费者对产品安全性要求的日益提高，植物细胞培养的应用已愈来愈广泛，如：药用代谢产物的制造、作为天然食品或者食品添加剂、杀虫剂和杀菌剂、饲料等，不仅更安全，而且能很好地解决现今产品出现的各种问题。

细胞分化出的胚叫体细胞胚；由于离体培养的植物组织细胞是在未经过
有性过程的情况下直接产生胚这一结构，并且形成的胚与性细胞形成的 胚相似，因此也将此类胚称为胚状体。
（二）、胚状体的概念与分类
胚状体: 是植物组织培养中起源于非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的胚状结构。 这个定义包括下列几点含义： ①胚状体是组织培养的产物，只限于组织培养范围使用，区别于无融合生殖的胚；合生殖的胚； ②胚状体起源于非合子细胞，区别于合子胚； ③胚状体的形成经历胚胎发育的过程，区别于组织培养中分化的芽。
因此外观上未见明显变化，但代谢活化了，细胞内一些大分子代谢
动态已发生明显的改变，细胞正积极为下一步分裂进行准备。
• 分裂期:外植体切口边缘开始膨大，外层细胞通过一分为二的方式进行分裂， 而中间的细胞不分裂。另外还有细胞数目增加，体积变小；细胞核和核仁增 到最大等。从而形成一团具有分生组织状态细胞的过程。这时组织细胞代谢
的形成，这一阶段所用的培养基必须含有生长素类物质，主要是2，4-D；
第二阶段包括胚状体的形成和发育，这一阶段必须在降低2，4-D浓度或 完全去除2，4-D的培养基上才能进行。
(2) 细胞分裂素类物质
高钙高磷组合的培养基有利于小麦愈伤组织的诱导、生长和再生。对大多数植物
组织来讲，激素是愈伤组织培养基中不可缺少的组成成分。生长素，对于细胞分裂 的诱导以及在其后的生长和增殖，都是必要的物质。细胞分裂素未必是必需的物质， 然而，常常因不同的供试材料而异。
4、诱导条件
光照：愈伤组织的诱导需弱光或不需光，在黑暗或散光条件下最好。分化、继代培 养一般需光。此时光对器官的作用是一种诱导反应。 温度：外植体接入诱导培养基后，一般采用25-28℃的恒温条件下培养。

水稻愈伤组织转化一、实验目的1.掌握植物组织培养的基本原理；2.学习水稻愈伤组织的诱导方法；3.学习农杆菌转化法的原理，掌握农杆菌转化水稻愈伤组织的方法；4.学习转基因植株的各种鉴定方法（包括PCR检测、GUS染色、Southern-blot、Western-blot、FISH等），同时能够操作PCR与GUS染色鉴定的方法。

二、实验原理1.植物组织培养植物组织培养（plant tissue culture）是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体和花药等，在人工控制的培养基上培养，使其生长、分化以及形成完整植株的技术。

自1902年Haberlandt 首先用紫鸭跖草( Tradescantia )的叶片栅栏组织进行培养来，植物组织培养已有100余年历史。

用于离体培养的各种植物材料称为外植体（explant）。

根据外植体的类型，又可将组织培养分为：器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养以及原生质体培养等。

（从这个角度讲，本学期的实验属于胚胎培养。

）植物组织培养的理论基础是植物细胞全能性。

2.基因工程基因工程技术是在离体条件下对不同生物的遗传物质(DNA)进行人为“加工”，并按照人们的意愿重新组合，以改变生物的性状和功能，然后再通过适当的载体将重组DNA转入生物体或细胞内，并使其在生物体内或细胞中表达，从而获得新的生物机能。

这种利用基因工程技术获得的植物一般称为“基因工程植物”。

自1983年首次获得转基因植物以来，转基因技术发展十分迅速，成功进行转基因的植物已达60多种，在世界上批准进入田间试验的转基因植物已超过500例，有些转基因产品已进入市场。

通过基因工程改良作物品种在未来的农业生产中日益显示出巨大潜力。

3.农杆菌转化法转基因的方法有很多，对于植物而言，最常用的是农杆菌转化法和基因枪法。

农杆菌转化法使用的是根癌农杆菌，其内含Ti质粒：T-DNA（Transferre DNA）区：农杆菌Ti 质粒中向植物中转移并整合进植物基因组中的部分。

3、操作者双手的清洗与消毒
在进入无菌室之前，各操作者先用自来水清洗干净双手并晾干，然后进入无菌室，坐在超净台前位子上后，用含75%酒精的酒精喷壶喷洒双手对双手进行消毒，在超净台风口待双手酒精风干后进入超净工作台。（注意：酒精喷壶喷洒双手时切记不要把酒精喷到超净台的有机玻璃板上！）
4、超净台面的表面消毒（以下工作在超净工作台内进行）
三、实验材料与用具
1、材料：水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）；
2、试剂：75%酒精，2% NaCLO，无菌水(每组1瓶400mL)；
3、培养基：诱导培养基：NB+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L（pH5.8）；
4、仪器设备：培养室、超净工作台、培养皿（￠9cm）2个、枪形镊、量筒（100mL）2个、三角瓶（50mL、无菌）2个、废液缸、保鲜膜、标签纸。
水稻愈伤组织的诱导
一、实验目的
1、掌握外植体的消毒方法和接种技术；
2、了解愈伤组织诱导的过程。
二、实验原理
以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。
外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展着剂（吐温20）以增强消毒效果。
用枪形镊子从含75%酒精棉球的容器中取一团棉球，仔细把整个超净台面擦试一遍，尽量降低超净台面的带菌量，并将废棉球丢到废液缸中，然后点亮超净台里面放置的酒精灯。
5、外植体消毒（分组操作，每组由一位代表操作完成外植体的消毒工作）
将脱谷壳米粒转到一50mL无菌三角瓶→加适量无菌水洗一次（以没过种子为准，下同）→弃水，倒入75%酒精适量，摇动搅拌，放置30秒（过程中适当轻摇动混匀）→弃酒精→加适量无菌水洗一次→弃水→倒入适量2% NaCLO，不时摇动搅拌，共处理30分钟→弃NaCLO→用无菌水洗3次，每次停留1分钟→倒去无菌水，将种子从三角瓶转到带无菌滤纸的无菌培养皿中吸干。

毕业论文开题报告生物工程水稻愈伤组织的诱导1 选题的背景和意义水稻是人们重要的粮食作物之一，也是经典的模式植物．生长和分裂旺盛的胚性愈伤组织细胞培养是获得转基因植物的最好来源。

近年来，研究者先后从水稻各部位诱导出愈伤组织和再生植株。

虽然，幼穗、幼胚、花粉粒、花药愈伤组织诱导率高，愈伤组织质量好而受到青睐，但上述材料多受季节限制，取材不便，阻碍了水稻组织培养的进一步发展．本实验选用本省粳稻种子为材料，对其在不同培养基条件下的出愈率及愈伤组织状态进行研究，以期获得状态较好的愈伤组织，为进一步利用其进行悬浮细胞培养及转基因研究提供理论及实验依据。

2 相关研究的最新成果及动态自1965年我国开展水稻细胞培养研究后，研究者以水稻幼穗、幼胚、花粉粒和花药为材料进行组织培养研究，取得了较大的进展，尤其是建立起来的水稻胚性悬浮细胞系可作为基闪枪的理想受体，在水稻的遗传转化，品种培育巾具有重要作用。

再如细胞次生代谢物的生产，即通过细胞培养可得到大量合成的植物次生化合物，如生物碱、抗菌剂、利血平、橡胶、类同醇、糖类衍生物、天然色素等很多物质。

远源杂种植物的产生，是指由受精后障碍导致远缘杂交的植物不孕，使得植物的种间和远缘杂交常难以成功。

采用胚的早期离体培养可以使杂种胚正常发育，产生远缘杂交后代，从而育成新物种。

植物的快速繁殖，是指利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。

植物快速繁殖是植物组织培养技术在农业生产中应用最广泛，产生经济效益最大的研究领域，涉及的植物种类繁多，技术日益成熟并程序化，繁殖速度突破了植物自然繁殖的界限，成就了工厂育苗的梦想。

植物种质资源的离体保存，即从20世纪60年代开始，人们利用细胞和组织培养再生植株的技术，进行了离体保存种质的研究。

种质资源离体保存是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。

半夏愈伤组织诱导和分化再生植株的研究摘要研究半夏外植体愈伤组织诱导、放置方式、外植体的苗龄对分化再生植株的影响,结果表明:块茎的愈伤组织诱导效果最佳,叶片次之,叶柄最差。

当MS+6-BA 2mg/L+2,4-D 2mg/L激素组配时,愈伤组织分化率达100%。

外植体的放置方式对分化出苗有很大影响,块茎垂直放置出芽率最高,而叶柄和叶片平放于培养基效果较好。

无菌苗苗龄对分化率有较大的影响,最适无菌苗苗龄为10~25d。

当6-BA为3mg/L时芽增殖倍数达4倍左右,而当6-BA 0.2mg/L+2,4-D 0.2mg/L组配时,生根效果最好。

关键词半夏;组织培养;分化再生;愈伤组织StudiesonCallusInductionandPlantletsRegenerationofPinelliaternataHE Feng-mei1ZHU Yong-ping2(1College of Horticulture and Landscape,Yunnan Agricultural University,Kunming Yunnan 650201; 2College of Agriculture and Biotechnology,Yunnan Agricultural University)AbstractThe effect of callus induction,orientation and age of explants on plantlets regeneration of Pinellia ternata was studied.Results showed that tuber had the best ability in callus induction which was followed by leaf and petiole.The combination of MS+6-BA 2mg/L+2,4-D 2mg/L was optimized for differentiation of callus with differentiation frequency up to 100%.There were significant effect of explants orientation on optimum seedling differentiation in which the tuber vertically,and leaf and petiole horizontally placed on medium. Explants harvested from 10 to 25-day-old in vitro shots were significantly better than others in regeneration. The optimum hormone for bud proliferation was MS+6-BA 3mg/L and proliferation multiple of buds achieved 4 times.The combination of MS+6-BA 0.2mg/L+2,4-D 0.2mg/L was optimized for rooting.Key wordsPinellia ternata;tissue culture;preparation and regeneration;callus半夏(Pinelliae ternata)为天南星科多年生草本植物,药用历史悠久,其地下块茎干燥炮制后入药,具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结之功效[1]。

水稻愈伤组织诱导与之植株再生培养体系的建立1：研究的目的和意义1.1：研究的目的1.1.1. 以水稻成熟胚为外植体，寻求一个科学的实验方法，探讨愈伤组织的产生规律。

1.1.2. 用相同的培养方式对不同类型的籼稻品种和粳稻品种成熟胚进行组织培养，比较不同类型的水稻品种成熟胚愈伤组织诱导率之间的差异。

1.1.3. 通过植株再生培养体系,寻求提高水稻成熟胚的再生频率的方法，建立水稻不同种间成熟胚高效的培养体系。

1.2：研究的意义1.2.1. 水稻种子是水稻组织培养研究中使用最早的外植体,与其它外植体相比,种子胚具有再生周期短,再生植株育性好,取材不受生长季节的限制,灭菌容易,外植体均匀,重复性好等优点,因而是一种理想的研究材料。

但种子胚也存在诱导率不高,品种差异明显等限制因素[1]。

为了不断优化该体系的各个环节,人们做了大量研究,有关的研究报道也较多。

杨跃生等[2]以籼稻栽培种成熟胚诱导形成的愈伤组织为材料,对影响植株再生的一些因素进行了研究。

发现与N6相比MS培养基中的无机大量成分严重抑制再生植株根系生长,但MS的无机微量成份对诱导植株再生的效果则较明显。

较高浓度的BA利于诱导更多的植株再生,而较低的BA 浓度则利于壮苗和植株根系的形成。

增加诱导培养基或分化培养基中的渗透压和琼脂浓度,维代培养时加入适量的激动素或6-节基氨基嚓吟以及在分化培养基中加入活性炭、玉米素和AgNO3等均可提高水稻愈伤组织的分化成苗率[3]。

另有研究则发现脱水处理能有效促进水稻愈伤组织的植株再生[4-6]。

目前用于作物转基因的外植体,主要有胚性悬浮细胞系,成熟胚愈伤组织,幼胚及其愈伤组织,花药愈伤组织,分生组织盘,萌发的胚!叶或根,茎尖分生组织等,其中成熟胚具有取材方便,不受季节的限制,在转基因研究中有着较为广阔的应用前景，但是到现在为止,适合不同籼稻品种的有效组织培养体系还未建立,特别是釉稻品种成熟胚的组织培养效果很差,因此,严重影响了籼稻基因工程的开展，为此,进行籼稻愈伤组织的高频率诱导,胚性愈伤组织的保持及高频率绿苗分化的研究,是一项极其重要的水稻细胞工程和基因工程研究的基础工作，因此,研究籼稻成熟胚的组织培养特性,建立杂交水稻亲本成熟胚再生体系具有极其重要的理论和现实意义。

毕业论文文献综述生物工程水稻愈伤组织的诱导及应用一、前言部分1.1 关于水稻愈伤组织的简介水稻是人们重要的食粮之一，由于其基因组小，通过组织培养易获得再生植株等特点而在基因克隆、基因功能验证以及遗传转化等研究方面成为模式植物．生长和分裂旺盛的胚性愈伤组织细胞培养是获得转基因植物的最好来源．因此，建立一个高效再生体系是实现基因转化的先决条件[1]．近年来，研究者先后从水稻各部位诱导出愈伤组织和再生植株．虽然，幼穗、幼胚、花粉粒、花药愈伤组织诱导率高，愈伤组织质量好而受到青睐被广泛用于水稻的遗传转化、品种培育中[2-3]．但上述材料多受季节限制，取材不便，阻碍了水稻组织培养的进一步发展．1.2 组织培养所谓的植物组织培养是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基对离体的植物器官组织细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术[4]。

其研究的类型主要包括组织培养、器官培养、细胞培养、及原生质体培养。

随着研究T作的深入进展，上述5个方面的研究理论和技术体系逐渐得到完善促使植物组织培养的应用范围日益广阔延伸。

组织培养作为一种育种技术在水稻等重要粮食作物已广泛应用，并培育出一大批优良品种，自1965年我国开展水稻细胞培养研究后，研究者以水稻幼穗、幼胚、花粉粒和花药为材料进行组织培养研究，取得了较大的进展，尤其是建立起来的水稻胚性悬浮细胞系可作为基闪枪的理想受体，在水稻的遗传转化，品种培育巾具有重要作用。

再如细胞次生代谢物的生产，即通过细胞培养可得到大量合成的植物次生化合物，如生物碱、抗菌剂、利血平、橡胶、类同醇、糖类衍生物、天然色素等很多物质。

远源杂种植物的产生，是指由受精后障碍导致远缘杂交的植物不孕，使得植物的种间和远缘杂交常难以成功。

采用胚的早期离体培养可以使杂种胚正常发育，产生远缘杂交后代，从而育成新物种。

植物的快速繁殖，是指利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。