实时荧光定量PCR技术的原理及其应用

192018年11月总第301期ISSN1672-1438CN11-4994/T

作者简介：安钢力，医学硕士，实验师。聚合酶链反应(polymerasechain reaction PCR)技

术是20世纪80年代中期发展起来的一项基因检测即一

种体外核酸扩增技术。它具有许多优点：特异性、

易重复、高效性等，可以在几个小时完成过去几天

或者更长时间完成的实验，因此这项技术在生物医

学领域具有划时代的意义。但是，传统PCR技术有它

的缺点，它通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性

分析而不能对起始模板准确定量，同时也无法对扩增

反应实时检测且在实验过程中易污染而出现假阳性。

人们为了寻找更为灵敏、快速、简便、高特异性的方

法进行了许多探索研究，直到1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出了一种新的定量试验技术—荧

光定量PCR(Flurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR；real-time quantitative PCR, RT-

qPCR or qPCR)，它是通过荧光染料或荧光标记的特异

性探针，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用

与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品模

板的初始浓度，实现了PCR从定性到定量质的跨越，

具有里程碑意义。目前，此项技术已应用于干细胞研

究、肿瘤学和遗传疾病研究、病原体检测和传染病研

究、药物分析、药物基因组学、植物学研究和农业生

物科技等多领域研究中[1]。本文对实时荧光定量PCR

的原理、分类和应用进行阐述。

1 实时荧光定量PCR技术的原理

real-time quantitative PCR技术是指在PCR反应体

系中加入荧光基团，通过荧光信号不断累积而实现实

时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进行

定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中有2个概念比

较重要。(1)荧光域值(threshold)的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值

的缺省设置是3～15个循环的荧光信号标准偏差的10

倍。(2)Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含

义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经

历的循环数[2]。在实时荧光定量PCR中，对全程PCR

扩增过程进行实时检测，根据反应时间和荧光信号的

变化可以绘制成一条曲线。一般来说，整条曲线可以

分3个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增

阶段和平台期[3]。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光

信号与背景无法区分，无法判断产物量的变化。在平

台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，所以反应终

产物量与起始模板量之间已经不存在线性关系，通过

反应终产物也算不出起始DNA拷贝数。只有在荧光产

生进入指数期， PCR产物量的对数值与起始模板量之

间存在线性关系，所以在PCR反应处于指数期的某一

点上来检测PCR产物的量，由此来推断模板最初的含

量而进行定量分析。研究表明，每个模板的Ct值与该

模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数

越多，Ct值越小[4,5]。通过已知起始拷贝数的标准品可

得到标准曲线，只要获得未知样品的Ct值，即可从标

准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

2 实时荧光定量PCR技术荧光化学分类和

定量方法

2.1 实时荧光定量PCR常用的荧光化学分类

实时荧光定量常用的荧光化学分类有SYBR Green I

法和Tag Man探针法。SYBR Green I是一种具有绿色激

发波长的染料，最大吸收波长约为497 nm，发射波长

最大约为520 nm，可以和所有的dsDNA双螺旋小沟区

域结合。因为在游离状态下SYBR Green I

发出的荧光实时荧光定量PCR技术的原理及其应用

安钢力

苏州大学唐仲英血液学研究中心 江苏苏州 215123

摘 要：实时荧光定量PCR技术是在定性PCR基础上发展起来的一项新兴技术。通过在PCR反应体系中加入荧光基团，在整个PCR过程中实时检测产物中荧光信号强度来达到定量的目的。此项技术具有定量准确、特异性强、灵敏度高、操作简便等优点，越来越受到人们的关注和广泛应用。对实时荧光定量PCR技术原理、分类和应用进行了阐述。关键词：实时荧光定量PCR；原理；分类；应用

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较弱，但是当它与双链DNA结合后，荧光就会大大

增强，而且荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全

同步。此法的优点是它可以监测任何dsDNA序列的扩

增，检测方法较为简单，成本较低，但也正是由于荧

光染料能和任何dsDNA结合，如非特异性扩增产物和

引物二聚体也能与染料结合而产生荧光信号，使实验

产生假阳性结果，因此其特异性不如探针法[6]。因为

非特异性产物和引物二聚体的变性温度要比目标产物

的低，所以可以在熔解曲线(melting curve)反应过程中

利用软件分析仪器收集到信号进行鉴别。TaqMan探针法是具有高度特异性的定量PCR技

术。它的工作原理是在PCR反应体系中存在一对PCR引

物和一条探针，探针的5′端标记有报告基团，3′端标

记有荧光淬灭基团，探针只与模板特异结合，其结合位

点在两条引物之间。当探针完整的时候，报告基团的荧

光能量被淬灭基团吸收，所以仪器搜集不到信号，随着

反应的进展，Taq酶遇到探针，利用3′→5′外切核酸

酶的活性把探针切断，导致报告基团的荧光能量不能被

淬灭基团吸收，产生了荧光信号，因此信号的强度就代

表了模板DNA的拷贝数。2.2 实时荧光定量PCR技术定量方法

在实时荧光定量PCR中模板定量有两种：绝对定量

和相对定量。绝对定量指的是用已知的标准曲线来推算

未知的样本的量。绝对定量的标准样品一般是指含有和

待测样品相同扩增片段的克隆质粒、含有和待测样品相

同扩增片段的cDNA，PCR的产物，把它们分别稀释为

不同的浓度作为模板进行反应。横坐标为标准品拷贝数

的对数值， 纵坐标为得到的CT值，可做出标准曲线，

根据未知样本的CT值，可在标准曲线中得到样本的拷

贝数进而对未知样本进行定量。相对定量是在一定样本

中靶序列相对于另一参照样本的量的变化，也就是比较

经过处理的样本和未经处理的样本之间的相对基因表达

差异。常用方法有标准曲线法和2－△△CT法，后者是分析

基因表达相对变化的一种简便方法。

3 实时荧光定量PCR技术的应用

实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性高和精

确性高的优点，此项技术已被应用于分子生物学、医

学、食品检测和环境监测等多个领域。3.1 在分子生物学领域的研究应用

3.1.1 定量核酸浓度

传统方法是用琼脂糖凝胶电泳或者分光光度计测定核酸浓度，其结果不准确而且易污染，实时荧光定

量PCR可以解决这些问题，它准确性、灵敏度高且无

污染，对一些传染性疾病进行定量分析、病原微生物

和病毒含量检测，此项技术都是首选。3.1.2 研究基因表达

应用实时定量PCR技术可以对基因时间、空间表

达水平差异进行比较。例如，对特定基因用物理、化

学、药物等不同方法处理后的差异进行比较，为人们

的科学研究提供依据。3.1.3 用于单核苷酸多态性(SNP)检测分析

人们对疾病的易感性和对同一种药物治疗同一种

疾病的效果是有差异性的，遗传物质DNA的多态性RELP，STR，ABO血型和SNP是个体差异的遗传基

础。SNP在人类基因组中广泛存在，是人类可遗传变

异中最常见的一种，在遗传性疾病的研究中具有重要

意义。3.1.4 DNA甲基化检测

DNA甲基化是表观遗传学重要的标记信息，通过

实时荧光定量PCR技术获得基因组甲基化水平数据对

表观遗传学的时空特异性研究具有重要意义。3.2 在医学领域的研究应用

3.2.1 用于病原体检测

常规PCR不能定量，在操作中易污染导致出现假

阳性结果，应用实时荧光定量PCR技术可以解决这些

问题。目前，此项技术已应用于检测丙肝病毒、宫颈

癌及其癌前病变有关的人类乳头瘤病毒、抗结核药物

治疗后定量检测病人痰样本病原体DNA含量，为疾病

的诊断和治疗提供依据。用此项技术还可以一次性检

测大量大肠杆菌样本，简便准确，是食品检测方面的

一个突破。3.2.2 肿瘤基因检测

肿瘤发生机制非常复杂，发病机理尚未清楚，随着

基因分子水平研究不断发展，肿瘤基因发生突变等遗传

学改变是致癌性发生的根本原因已被广泛接受。癌基因

表达异常和突变在多种肿瘤早期和良性阶段就已出现，

通过实时荧光定量PCR检测可检测到基因突变，准确测

定其表达量，为肿瘤早发现、早诊断、早治疗及疗效和

预后的判断提供依据[7]。3.2.3 用于药物选择和疗效判断

化疗过程中主要问题是病人对化疗药物的耐药，

检测肿瘤耐药基因的表达水平是选择化疗药物的依

据。检测微小残留病变的变化情况对于调整治疗策略

和对病人进行个体化治疗非常重要。

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3.2.4 用于优生优育诊断

唐氏综合征是由染色体异常所导致的，在产前通

过实时荧光定量PCR技术做染色体核型分析，可以最

大限度地防止患儿的出生，是防止此病的有效措施。

此项技术还可以对孕产妇进行叶酸利用能力检测，为

孕产妇提供叶酸补充具有指导意义。此项技术对于降

低严重缺陷儿出生率、提高人口素质起到了积极的推

动作用。3.3 在食品检测方面的应用

食品安全是与人民群众生活息息相关的问题。食

品在生产、储藏、运输、销售等一系列过程中不可避

免地存在受到微生物污染的可能性，检测食品中的致

病菌至关重要。

例如，对2007～2008年上半年丽水地区的生畜

肉、熟肉、蔬菜等172份样本进行7个微生物项目的检

测，沙门菌的检出率最高，生畜肉中的微生物污染最

为严重，可以有效地提醒人们要对沙门菌污染高度重

视，进而采取预防措施防控食源性疾病的发生[8]。3.4 在环境监测方面的应用

实时荧光定量PCR技术已经被国内外应用在环境

监测中，提高了监测水平。此项技术可以检测河流中

环境微生物随着季节变化的情况[9]。还可以用来对地

表水和饮用水中致病菌进行检测以便及时预告地表水

污染情况以及采取相应有效措施避免大范围污染。水

体中即使有少量沙门氏菌污染也会危害健康，此项

技术可以帮助人们找到其污染源，便于及时安排沙

门氏菌接种[10]。应用此技术，以炭疽芽孢杆菌特异的pagA，rpoB2cap 引物探针检测比较4种被炭疽疫苗株

污染的土壤中炭疽的量，检测出底限为2.5 万拷贝/g土

壤(pagA)，这样可以直接从环境样品中检测炭疽菌，

对炭疽防治具有重要意义[11]。4 结语

实时荧光定量PCR技术自问世以来，由于具有定

量准确、快速、特异性强、灵敏度高、操作简便等优

点而受到人们的青睐。广泛应用于基础研究、医学诊

断、食品检测和环境监测等领域，应用价值很高，解

决了许多难题，产生了许多社会效益和经济效益。随

着科学技术的不断进步，此项技术将得到更进一步的发展和完善，也必将存在更加广阔的应用空间。

参考文献

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