RNA干扰技术在抗癌研究中的应用

第２１卷　２００６　第６期　１２月　云南农业大学学报　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｙｕｎｎａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｖｏ１．２１　Ｎｏ．６　Ｉ）ｃｅ．２００６　

ＲＮＡ干扰技术及其在水稻基因功能研究中的应用米　刘维振　，吴茂森　，范静华　，何晨阳　（１．中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京１０００９４；　２．　南农业大学，农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室，云南昆明６５０２０１）　摘要：随着水稻全基因组测序的完成，探究水稻巾许多未知基因的功能成了当前的研究重点之一。ＲＮＡ干扰技　术（ＲＮＡｉ）作为新发展起来的基　功能研究方法正在被广泛采用。以农杆菌介导转化水稻技术也逐渐成熟　简　要综述了ＲＮＡｉ作用机制及其在水稻基因功能研究中的应用的最新进展。　关键词：ＲＮＡｉ；水稻；农杆菌介导；功能基因组学　中图分类号：Ｓ　５１１．０３２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００４—３９０Ｘ（２００６）０６—０７１１—０４　ＲＮＡ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｒｉｃｅ　Ｇｅｎｅｓ　ＬＩＵ　Ｗｅｉ—ｚｈｅｎ　ｔ　，ＷＵ　Ｍａｏ—ｓｅｎ　，ＦＡＮ　Ｊｉｎｇ—ｈｕａ　，ＨＥ　Ｃｈｅｎ—ｙａｎｇ　（１．Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　ｌａｂ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　ａｎｄ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｐｅｓｔｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ＣＡＡＳ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１　０００９４，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｋｅｙ　Ｌａｔ￣）ｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｃｒｏｐｓ　Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　ａｎｄ　Ｐｅｓｔｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｙ　Ａ　Ｕ，Ｋｕｎｍｉｎｇ　６５０２０１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｉｃｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｌｏｔ　ｏｆ　ｉｔｓ　ＨＨ—　ｋｎｏｗｎ　ｇｅｎｅｓ　ｈａｓ　ｂｅｃｏｍｅ　ｏｎｅ　ｏｆ　ｍｏｓｔ　ｆｏｃｕｓｅｄ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｒｅａｓ．ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ），ａ　ｎｅｗｌｙ　ｄｅ—　ｖｅｌｏｐｅｄ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｈａｓ　ｂｅｅｎ　ｗｉｄｅｌｙ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ—ｍｅｄｉａ—　ｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｉｃｅ　ｈａｓ　ｓｕｃｃｅｅｄｅｄ．］＇ｈｉｓ　ｒｅｖｉｅｗ　ｓｕｍｍａｒｉｚｅｓ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ＲＮＡｉ　ａｎｄ　ｐｒｏ—　ｇｒｅｓｓ　ｉｎ　ＲＮＡｉ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒｉｃｅ　ｇｅｎｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＲＮＡｉ；ｒｉｃｅ；Ａｇｒｏｂａｔｅｒｉｕｍ—ｍｅｄｉａｔｅｄ；ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｇｅｎｏｍｉｃｓ　水稻是世界上最重要的粮食作物之一，和其它　作物相比，它的基因组较小，易进行体外操作，而且　组织细胞具有较强的再生分化能力，所以被研究者　们用来作为探究基　功能的模式植物之…。１９９１　年水稻基因组计划首先由日本启动，并在１９９８年　水稻全序＃ｌＪｉ￣０定被列为国家资助研究项目，其目　标是充分利用水稻资源、揭示新基因及其表达的奥　秘、促进水稻育种。随着拟南芥和水稻这两个分别　代表双子叶和单子叶模式植物的基因组测序　。　的完成，拉开丁植物功能基因组研究的帷幕。功能　基因组学以揭示基凶组功能及调控机制为主要目　标，又被称为“后基因组时代”。。　。水稻基因组序　列的研究和功能基因的揭示不仅可为定性禾本科　植物及其它物种的基因创造一定的条件，而且也为　基因及其调控区和机体的精密调控网络研究提供　了更加准确信息。植物重要基因功能的鉴定己成　为当前研究的主要内容，为发掘具备重要农艺性状　基因提供了宝贵信息。　然而，如何确定大量基因序列的功能，并进行　高通量的基因功能分析，进而了解基因之间如何通　过产物调节来控制机体代谢和发育机理，成为功能　基凶组学研究的核心问题。当前基因功能研究方　法很多，如使用遗传突变体就是其重要手段之一　利用激活标签技术，Ｔ—ＤＮＡ插入失活，化学诱变　和物理等方法已获得了大量的水稻突变体，但这些　方法具备较大的随机性，工作量大。而基于对已知　收稿日期：２００６—０３—１６　基金项目：中国农业科学院“杰出人／ｊ．计划”资助项目。　通讯作者　作者简介：刘维振（１

细胞生物学实验

动物细胞的转染与GFP的RNA干扰技术

一、实验目的

1、学习和掌握外源基因导入动物细胞的方法，观测外源基因的表达（绿色荧光蛋白），并了解细胞转染技术在细胞生物学相关领域的应用。

2、学习和掌握RNA干扰技术原理，学习观测利用化学合成的GFP-siRNA对GFP蛋白的抑制效果。

二、实验原理

（一）绿色荧光蛋白

1、GFP荧光蛋白的发现

1962年,下村修在这种水母的发光器官内发现天然绿色荧光蛋白。它之所以能够发光,是因在其包含238个氨基酸的序列中,第65至67个氨基酸(丝氨酸—酪氨酸—甘氨酸)残基,可自发地形成一种荧光发色团。

马丁•查尔非就考虑只用它的编码区域来表达。1993年，他用PCR的方法扩增了GFP的编码区，将它克隆到表达载体中，紫外光或者蓝光激发后，大肠杆菌和线虫细胞内均产生了很美妙的绿色荧光。 1994年在美国《科学》杂志上发表《作为基因标识的绿色荧光蛋白》一文，尽管正文只有一页，却标志绿色荧光蛋白投入实验室应用。

2、GFP荧光蛋白的应用

GFP已被广泛应用于：细胞内分子标记、药物筛选、融合抗体基因表达检测、分子间相互作用等。

GFP具有如下特性：GFP荧光极其稳定，在激发光照射下，GFP抗光漂白能力比荧光素（fluorescein）强，特别在450～490nm蓝光波长下更稳定. GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复.而一些弱还原剂并不影响GFP荧光.中度氧化剂对GFP荧光影响也不大，如生物材料的固定，脱水剂戊二酸或甲醛等.GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析.但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白.由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的.

核酸药物的药理学与应用

核酸药物被认为是未来治疗癌症和其他慢性疾病的重要治疗手段之一。与传统的药物相比，由于它们的作用机理及代谢特征不同，因此其副作用更低，更加精准有效。本文将重点介绍核酸药物的药理学与应用。

一、核酸药物的药理学

核酸药物根据其作用靶点分为两种类型：DNA药物和RNA药物。DNA药物通过作用于DNA水平来防止癌症细胞的增殖，而RNA药物则通过干扰基因表达来抑制细胞移动、侵袭和转移。它们的作用机理均涉及到目标基因的转录和翻译。

1. DNA药物

DNA药物能被细胞核吸收并与DNA相互作用，抑制DNA合成、DNA修复和DNA重组过程，进而影响细胞增殖和生物学效应。其中著名的比如环磷酰胺和环核酸。环磷酰胺是一种DNA交联剂，具有广谱的抗肿瘤活性，能够干扰DNA的转录和翻译。而环核酸则是一种DNA链断裂剂，能够引起DNA交叉及DNA损伤，同时还能抑制细胞的DNA重组过程。

2. RNA药物

RNA药物是一类新型的药物，由于其可专一性的作用机制，在治疗基因调控及疾病治疗等领域具有极为广泛的应用前景，其中知名的比如小分子抑制剂和siRNA等。siRNA是一种小分子RNA，通过与靶基因mRNA的互补作用、介导RNA干扰（RNAi）途径来抑制相应靶基因的转录，从而抑制癌细胞的生长、分化与侵袭。

二、核酸药物的应用

核酸药物的主要途径是口服和静脉注射。这些药物可以用于肿瘤、传染性疾病、心血管疾病、风湿性疾病等领域的治疗和预防。下面以肿瘤作为例子，介绍核酸药物在临床上的应用。

1. 肿瘤治疗

核酸药物与传统的化疗药物类似，具有抗肿瘤及增强免疫的作用。核酸药物作用于癌细胞DNA和RNA，从而使其失去复制和自我修复的能力。根据对靶点的不同，分别有DNA和RNA两种药物。著名的核酸药物比如环磷酰胺、多柔比星、长春新碱等。

2. 变态反应性疾病

核酸药物的另一个应用领域是治疗变态反应性疾病，比如类风湿性关节炎等。影响类风湿性关节炎的因素是免疫系统中的细胞、信号分子和抗体。siRNA的作用是针对和下调IL-6 mRNA的表达水平，进而抑制和防止类风湿性关节炎的发生。

・２８・　里堕塑　兰垄查　！　月第３５卷第１期　Ｊ　Ｉｎｔ　Ｏｂｓｔｅｔ　Ｇｙｎｅｃｏｌ，Ｆｅｂ．２００８，Ｖｏ１．３５，Ｎｏ．１　ＲＮＡ干扰技术在宫颈癌治疗中的研究进展　郑州大学第一附属医院妇产科（４５００５２）王巍综述史惠蓉审校　摘　要ＲＮＡ干扰（ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）是由外源性双链ＲＮＡ诱发的转录后基因沉默机制（ｐｏｓｔ—　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｇｅｎｅ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＰＴＧＳ），能高效特异性抑制突变基因表达，恢复正常基因功能。综述ＲＮＡ干扰作用机制　以及ＲＮＡ干扰技术在官颈癌治疗研究中抑制人乳头状瘤病毒、抗凋亡基因、生长因子、酶和蛋白等方面现状、进展及　其应用前景。　关键词ＲＮＡ干扰小干扰ＲＮＡ短发夹ＲＮＡ宫颈癌基因治疗　宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。在全球女性　恶性肿瘤中其发病率仅次于乳腺癌。在发展中国家　则居首位，严重威胁妇女生命。近年来通过宫颈癌脱　落细胞学筛查的逐渐开展，有效提高了宫颈癌的检　出率和早期宫颈癌的手术治愈率，但对于进展期宫　颈癌（ＦＩＧＯ，１１Ｉ或Ⅳ期），由于手术切除率低，化疗和　放疗的毒副作用大，疗效仍难令人满意。近期研制的　预防宫颈癌的人乳头状瘤病毒（ＨＰＶ）疫苗也仅适用　于尚未感染ＨＰＶ病毒者，甚至尚无性生活经历的年　轻人群，因此，寻找一种新的治疗方法已成为目前宫　颈癌治疗中的一个重要课题。ＲＮＡ干扰（ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ。ＲＮＡｉ）是由外源性双链ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ—　ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＲＮＡ，ｄｓＲＮＡ）诱发的转录后基因沉默（ｐｏｓｔ—　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｇｅｎｅ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＰＴＧＳ）机制，能高效特　异性地抑制突变基因表达而对正常基因功能无影　响，有望为肿瘤基因治疗带来新希望。　ＲＮＡｉ作用机制　ＲＮＡｉ是一种在动植物中广泛存在的由外源性　双链ＲＮＡ分子（ｄｏｕｂｌｅ—ｓｔａｎｄｅｄ　ＲＮＡ。ｄｓＲＮＡ）诱导　同源序列ｍＲＮＡ的特异性降解，导致基因沉默（ｇｅｎｅ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）的现象。即ＰＴＧＳ。ＲＮＡｉ诱导基因沉默的机　制为：导人生物体内的ｄｓＲＮＡ在ＡＴＰ供能下被细胞　内的多结构的ＲＮａｓｅ　１１１蛋白（Ｄｉｃｅｒ　ｒｉｂｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ。　Ｄｉｃｅｒ　ＲＮａｓｅ）［１　切割成２１ｎｔ～２３ｎｔ的小干扰ＲＮＡ　（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）片段，转染至靶细胞　后与细胞内的一些蛋白和酶如ＭＵＴ一７。ＲＥＤ一１，ＰＡＺ　蛋白。ＤＮＡ和ＲＮＡ螺旋酶结合形成ＲＮＡ诱导沉默　复合体（ＲＮＡ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｉｌｌｅｎｃｉｎｇ　ｃｏｍｐｌｅｘ，ＲＩＳＣ）口］，　ＲＩＳＣ是一种核糖核蛋白。含有１个解旋酶和１个核　酸内切酶ｓｌｉｃｅｒ。受ＡＴＰ激活后。其中的解旋酶将　ｓｉＲＮＡ双链解开活化。以其负链为模版通过碱基互　补配对识别并结合至靶ｍＲＮＡ后。ＲＩＳＣ中的核酸内　收稿日期：２ｏ０７－０５—２９　修回日期：２００７－０７—１９　切酶￣ｉｃｅｒ从ｓｉＲＮＡ反义链３’末端结合部位开始降　解ｍＲＮＡ，从而阻止目的基因的表达。　ＲＮＡｉ技术在宫颈癌治疗中的研究　一、ＲＮＡｉ抑制ＨＰＶ　生殖道ＨＰＶ感染在宫颈癌病因中起着重要的　作用，是宫颈癌的主要危险因素。其中的高危型　ＨＰＶ一１６和一１８与宫颈癌发生密切相关。流行病学调　查显示，９０％以上宫颈癌肿瘤组织中存在ＨＰＶ一１６或　ＨＰＶ一１８的核酸序列。ＨＰＶ一１６和ＨＰＶ一１８的活性变化　依赖于Ｅ６和Ｅ７病毒基因的功能。在宫颈癌的发生　发展、维持肿瘤恶性表型中起重要作用，Ｅ６和Ｅ７基　因在ＨＰＶ感染所致宫颈癌细胞中过表达。导致Ｐ５３　及Ｒｂ蛋白持续失活，严重干扰Ｐ５３和Ｒｂ蛋白对细　胞周期激活一停滞状态的调控。使Ｐ５３蛋白介导的细　胞凋亡降低，细胞进入Ｓ期并活跃增殖。Ｙａｍａｔｏ等［　］　构建了以ＨＰＶ一１８　Ｅ６为靶点的ｓｉＲＮＡ。分别转染　ＨＰＶ一１８阳性宫颈癌ＨｅＬａ和ＳＷ７５６细胞系。使Ｅ６　基因表达抑制。诱导了肿瘤细胞凋亡。Ｆｕｊｉｉ等［４］在体　外将以ＨＰＶ一１８　Ｅ６和Ｅ７基因为靶点的ｓｉＲＮＡ转染　宫颈癌细胞，使Ｅ６和Ｅ７　ｍＲＮＡ表达水平降低，Ｒｂ　蛋白、Ｂ一半乳糖苷酶表达增加，肿瘤细胞生长抑制；　在体内将以靶向ＨＰＶ一１８　Ｅ６及Ｅ７基因的ＨＰＶ一１８　Ｅ６和Ｅ７　ｓｉＲＮＡ瘤内注射成功地抑制了肿瘤细胞的　生长。肿瘤体积明显缩小。Ｋｕｎｅｒ等　应用ＲＮＡｉ技　术沉默感染ＨＰＶ宫颈癌细胞中的ＨＰＶ　Ｅ６和Ｅ７基　因。在分子水平分析了参与宫颈癌细胞凋亡调控，纺　锤体构成，细胞周期调节等多个基因的功能。Ｖｏｇｔ　等＿６］用ＲＮＡｉ技术靶向作用于ＨＰＶ一１６阳性宫颈癌　细胞中的Ｅ６基因。抑制Ｅ６基因表达，可激活线粒　体膜表面促凋亡基因Ｂａｘ活性。使线粒体膜通透性　增加，释放细胞色素Ｃ（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ）人胞质，激活　ｃａｓｐａｓｅ　３。恢复肿瘤细胞凋亡表型。Ｌｅａ等［　构建了　针对ＨＰＶ一１８　Ｅ７基因的ｓｉ