TNF-α在慢性阻塞性肺疾病中的表达及意义

TNF-α在慢性阻塞性肺疾病中的表达及意义

王文秀;马超;杜文才

【摘 要】目的 观察TNF-α在COPD患者血清中的表达水平,并探讨其与COPD发生发展的关系.方法 实时荧光相对定量PCR(RQ-PCR)方法检测40例COPD患者组及40例正常对照组血清中TNF-α mRNA表达水平,通过SPSS15.0软件进行配对t检验.结果 采用2-△△Ct方法计算出正常组TNF-α mRNA表达比值为2.39,COPD组TNF-α mRNA表达比值为4.01.COPD病变组中TNF-α mRNA的表达量显著高于正常对照组,P＜0.05.结论 TNF-α参与COPD的病理过程.%Objective To study the expression of TNF - αin patients with chronic

obstructive pulmonary disease ( COPD) , and the relationship between TNF

- αexpression and COPD. Methods The TNF - α mRNA levels in serums of

COPD patients (40 cases) and control group (40 cases) were analyzed by

real -time quantitative reverse transcription - polymerase chain

reaction( RQ - PCR). Results The expression ratio of control group was 2.

39 and COPD group was 4. 01. The data were analyzed by t test P <0. 05.

Conclusion The study suggests that involvement of TNF - α in the

pathomechanism of COPD.

【期刊名称】《大连医科大学学报》

【年(卷),期】2013(035)002

【总页数】3页(P143-145)

【关键词】TNF-α;COPD;炎症;细胞因子;逆转录聚合酶链反应 【作 者】王文秀;马超;杜文才

【作者单位】天津市西青医院呼吸科,天津300380

【正文语种】中 文

【中图分类】R563.1

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是呼吸系统的常见病和多发病，是一种长期、慢性、反复发作且逐渐加重的疾病，给社会和患者家庭带来沉重的经济负担。随着对COPD研究的深入，其发病机制复杂，主要病理特征为气道慢性炎症［1-2］。气道慢性炎症的发病机制是IL-8、GM-CSF及ICAM-1等蛋白因子介导中性粒细胞在肺气道组织粘附、跨血管内皮转移、趋化等过程最终引起慢性炎症［3-4］。研究证实TNF-α能诱导成纤维细胞释放IL-6、IL-8、前列腺素E2(PGE2)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF);刺激巨噬细胞产生 IL -1β、IL -17［5-6］;并且增强细胞内ICAM-1的表达［7］。本研究主要采用实时荧光相对定量 PCR(RQ-PCR)，从基因水平观察TNF-α在COPD中的表达情况，并探讨其在COPD发生发展中的意义。

根据2007年中华医学会制定的慢性阻塞性肺疾病(COPD)诊治规范诊断标准［8］，收集2011年6月—12月在天津市西青医院门诊就诊和住院治疗的COPD患者40例，30例男性和10例女性患者，年龄51～77岁，平均年龄(61±10)岁，平均病程(8±7)年。另外选择40例来自天津市西青医院的健康体检者作为正常对照组，其中男19例，女21例，平均年龄(59±10)岁。排除标准:合并有严重心、脑、肝、肾疾病或合并肿瘤者，患有免疫系统疾病者，近期使用过激素等影响免疫系统药物者。

所有研究对象均于晨起空腹采集肘静脉血4 mL，将血注入加有100 g/L的依地酸二钠钙(EDTA)50 μL和抑肽酶800 U的试管中混匀抗凝离心15 min，取上清置于-80℃冰箱保存待检。

1.2.1 总RNA的抽提:取血清标本约1 mL，加入1 mL TRIzol(美国Invitrogen公司)吹打匀浆，按照试剂盒说明书操作，收集组织总 RNA溶于20 μL DEPC处理水，-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 cDNA的合成和荧光定量PCR检测TNF-α mRNA的表达:采用ReverTra

Ace Qpcr RT kit试剂盒(日本 TOYOBO公司)，按照试剂盒说明书将mRNA反转录成cDNA，所得cDNA保存于-20℃ 冰箱备用。取5 μL反应产物做模板，用特异性引物进行PCR反应。所有引物均由上海生工生物技术公司合成。引物序列见表1。

使用 SYBR Green Real-timePCR MAster MiX试剂盒(TOYOBO公司)，按照试剂盒说明书配成50 μL反应体系，每个样本做个复孔，同时设不加模板cDNA的阴性对照。在 ABI PRISM 7000荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司)上进行基因扩增:50℃2 min，95℃10 min，循环40次。结果采用2-ΔΔCt的方法分析 TNF-α mRNA的相对表达量。

采用SPSS 15.0软件进行统计学分析。每个标本平行重复检测PCR 3次取均值，采用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

用1.2%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度仪检测抽提RNA的纯度和浓度，电泳显示RNA标本28S、18S和5S 3条带清晰，28S rRNA的亮度约为18S rRNA的2倍，说明抽提的 RNA纯度较好;选取260 nm和280 nm吸光度值(A)比值(A260/A280)为1.8～2.2的标本为合格标本进行下一步实验。

收集PCR扩增产物，取10 μL在1.5%琼脂糖凝胶、1×TAE电泳缓冲液中电泳检测PCR扩增产物，结果如图1所示。电泳结果显示，PCR扩增产物呈单一亮带，片段大小为307 bp，扩增特异性良好。 所有标本均重复检测3次取均值，反应完成后读取阈值(Ct)。采用 2-ΔΔCt方法计算出正常组TNF-α mRNA表达比值为2.39，COPD组 TNF-α mRNA表达比值为4.01。结果显示COPD病变组中TNF-αmRNA的表达量均显著高于正常对照组(P ＜0.05)。

COPD是一种以进行性气流受限为特征的慢性肺通气功能障碍性疾病，其致病原因和发病机制非常复杂，可以逐渐形成肺动脉高压，并最终导致肺源性心脏病［9-10］。研究证实COPD的主要病理特征是气道、肺实质以及肺血管的慢性炎症［11］。其气道慢性炎症是通过肺泡巨噬细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞等免疫细胞产生的多种细胞因子介导的结果［12-13］。研究发现白细胞介素 -8、白细胞介素 -6、TNF-α以及IFN-γ在内的细胞因子是构成COPD气道慢性炎症的复杂的炎症细胞网络的重要组成部分，它们之间互相促进，促使局部炎症发生、发展，最终导致气道的重塑和气道的阻塞［14］。作为重要的促炎症因子，TNF-α在自身免疫和慢性炎症性疾病中发挥着重要的作用［15］。TNF-α可以增加成纤维母细胞黏附分子(ICAM-1)的表达;刺激上皮细胞、内皮细胞或成纤维细胞产生 IL-6、IL-8、基质金属蛋白酶(MMPs)和PGE2;诱导单核细胞趋化因子-1(MCP-1)的产生，从而促进中性粒细胞和单核细胞的募集和活化，促进炎症反应［16-17］。

本实验采用实时荧光相对定量PCR技术，检测了40个COPD患者血清中TNF-α的含量，从基因水平探讨了TNF-α在COPD中的表达变化。实验结果表明COPD病变组TNF-α mRNA的相对表达量显著高于对照组，说明 TNF-α的表达与COPD相关，TNF-α可能参与COPD病变的病理过程。

本研究结果显示COPD患者体内TNF-α的表达及其介导的炎症反应与COPD病变的发生发展存在一定相关性。但是TNF-α在COPD慢性炎症过程中究竟起到什么作用仍需要进一步研究探索。

【相关文献】

［1］Landbo C，Prescott E，Lange P，et al.Prognostic value of nutritional status in

chronic obstuctive pulmonary disease［J］.Am J Respir Crit Care Med，1999，160(6):1856

-1861.

［2］Alcolea Batres S，Villamor León J，Alvarez-Sala R.Nutritional status in COPD［J］.Arch Bronconeumol，2007，43(5):283-288.

［3］Creutzberg EC，Schols AM，Weling-Scheepers CA，et al.Characterization of

nonresponse to high caloric oral nutritional therapy in depleted patients with chronic

obstructive pulmonary disease［J］.Am J Respir Crit Care Med，2000，161(3Pt 1):745-752.

［4］Eker S，Ayaz L，Tamer L，et al.Leptin，visfatin，insulin resistance，and body

composition change in chronic obstructive pulmonary disease［J］.Scand J Clin Lab Invest，2010，70(1):40 -44.

［5］Hallin R，Gudmundsson G，Ulrik CS，et al.Nutritional status and long-term

mortality in hospitalised patients with chronic obstructive pulmonary disease(COPD)［J］.Respir Med，2007，101(9):1954-1960.

［6］Foley RJ，Zuwallack R.The impact of nutritional depletion in chronic obstructive

pulmonary disease［J］.J Cardiopulm Rehabil，2001，21(5):288 -295.

［7］Nguyen LT，Bedu M，Caillaud D，et al.Increased resting energy expenditure is

related to plasma TNF-α concentration in stable COPD patients［J］.Clin Nutr，1999，18(5):269-274.

［8］中华医学会呼吸病分会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性阻塞性肺疾病学诊治指南(2007年修订版)［S］.中华结核和呼吸病杂志，2007，30(1):8 -17.

［9］马朝辉，张晶，陈若华，等.慢性阻塞性肺病模型大鼠肺组织树突状细胞的数量变化及药物干预效果［J］.第二军医大学学报，2009，30(6):706-709.

［10］宋一平，崔德健，茅培英，等.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型气道重塑及生长因子的研究［J］.中华结核和呼吸杂志，2001，24(5):283-287.

［11］Lane N，Robins RA，Corne J，et al.Regulation in chronic obstructive pulmonary

disease:the role of regulatory T - cells and Th17 cells［J］.Clin Sci(Lond)，2010，119(2):75-86.

［12］Monk JM，Hou TY，Turk HF，et al.Dietary n-3 Polyunsaturated Fatty

Acids(PUFA)Decrease Obesity-Associated Th17 Cell-Mediated Inflammation during Colitis［J］.PLoS One，2012，7(11):383 -393.

［13］Mario Cazzola，Maria Gabriella.IL -17 in chronic obstructive pulmonary disease［J］.Expert Rev Respir Med，2012，6(2):135 -138.

［14］Pridgeon C，Bugeon L，Donnelly L.Regulation of IL-17 in chronic inflammation in