当前位置：文档之家 › 荧光定量pcr原理及应用

荧光定量pcr原理及应用

  • 格式：docx
  • 大小：11.45 KB
  • 文档页数：3

荧光定量PCR原理及应用

一、引言

荧光定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种广泛应用于生物学和医学领域的分子生物学技术，它能够在短时间内扩增DNA序列并定量测量样品中特定DNA的数量。本文将深入探讨荧光定量PCR的原理和应用。

二、荧光定量PCR原理

2.1 PCR基本原理回顾

在了解荧光定量PCR原理前，我们首先回顾一下PCR的基本原理。PCR是一种通过反复复制DNA片段的技术，它基于DNA复制的三个基本步骤：变性、引物结合和延伸。

1. 变性：将DNA加热到95℃，使其两个链分离成单链。

2. 引物结合：将温度降至适合引物结合的温度。引物是针对待扩增的DNA片段设计的短寡核苷酸序列，它们与待扩增片段的两端互补。引物结合到待扩增片段上。

3. 延伸：在适当的酶的作用下，延伸引物，合成互补链。通过重复这个循环，DNA片段会指数增加。

2.2 荧光定量PCR原理

荧光定量PCR在PCR的基础上进行了改进，引入荧光染料和荧光探针。荧光染料可以与DNA结合并发出荧光信号，荧光探针可以在PCR过程中实时检测DNA的扩增情况。

1. 引物设计：荧光定量PCR需要设计两个引物，一个用于扩增目标DNA，另一个用于扩增内参（house-keeping gene），作为对比和标准。

2. 荧光染料：在PCR反应体系中添加荧光染料，如SYBR Green。SYBR Green可以结合到PCR产物的DNA上，并发出荧光信号。 3. 荧光探针：荧光定量PCR还可以使用荧光探针，如TaqMan探针。TaqMan探针是一种特殊的寡核苷酸序列，它含有两个荧光染料（荧光报告染料和荧光阻断染料）和一个酶切位点。在PCR反应中，当探针与待扩增片段结合时，酶会切除探针，导致荧光信号的降低。

4. 实时检测：荧光定量PCR可以实时检测PCR反应体系中的荧光信号。荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，通过检测荧光信号的变化，可以定量测量待扩增片段的数量。

三、荧光定量PCR应用

3.1 基因表达研究

荧光定量PCR可以用于研究基因的表达水平。通过选择合适的引物和内参基因，可以定量测量目标基因在不同条件下的表达量，进而分析基因的转录水平变化。

3.2 病原体检测

荧光定量PCR在病原体检测中有广泛的应用。通过设计特异性引物和探针，可以检测样品中是否存在目标病原体，以及病原体的数量。这对于快速诊断疾病和疫情监测具有重要意义。

3.3 比较基因组学研究

荧光定量PCR可以用于比较基因组学研究。通过设计特异性引物和内参基因，可以定量测量不同物种或不同品系之间的基因差异。这有助于揭示物种间的遗传关系和进化过程。

3.4 定量检测DNA损伤

荧光定量PCR还可以用于定量检测DNA损伤。DNA损伤会导致DNA序列的变化和PCR扩增效率的降低。通过测量PCR产物的数量，可以评估样品中DNA损伤的程度。

四、总结

荧光定量PCR是一种强大的分子生物学技术，它通过引入荧光染料和荧光探针，实现了对PCR反应实时监测和定量测量。荧光定量PCR在基因表达研究、病原体检测、比较基因组学研究和DNA损伤检测等领域有广泛的应用。随着技术的不断创新和改进，荧光定量PCR在生物学和医学研究中的作用将会越来越重要。

合集下载

荧光定量PCR技术及应用

荧光定量PCR技术及应用

毕 业 论 文

题 目 荧光定量PCR技术及应用

专 业 生物技术系

班 级 10级

姓 名 chenchuangming

学 号 1

实习单位

指导教师 刘秋华

二〇一二年五月十五号

目录

摘要 ................................................................................................................................ 1

关键词.......................................................................................................................................1

一、荧光定量PCR原理..............................................................................................................................................1

1．1定量PCR的数学原理.

1．2定量PCR的化学原理.

1．3定量PCR仪构造.

二、绝对定量与相对定量.......................................................................................................6

实时荧光定量PCR原理

实时荧光定量PCR原理

实时荧光定量PCR原理

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

1. Ct 值的定义

在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 -- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。

2. 荧光域值（threshold）的设定

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-15

3. Ct值与起始模板的关系

研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

4. 荧光化学

荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下： 1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。 2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

实时荧光定量PCR原理 2

实时荧光定量PCR原理 2

实时荧光定量PCR原理

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

1. Ct 值的定义

在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 -- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。

2. 荧光域值（threshold）的设定

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-15

3. Ct值与起始模板的关系

研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

4. 荧光化学

荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下： 1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。 2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

荧光定量PCR：简介,原理,应用

荧光定量PCR：简介,原理,应用

荧光定量PCR简介

荧光定量PCR检测技术诞生至今已10多年的时间，而其应用一直都没广泛展开，究其原因，无外乎受制于相关仪器、试剂和技术的发展。近期，尤其是08年以来，仪器和试剂是遍地开花，这也使科研人员均跃跃欲试，都想借此技术使自己的研究能突飞猛进，发展势头通过查找每年所发表的文章数可一目了然。据有关统计，在 Medline 数据库中，用“Taqman” 或 ”real time PCR” 作为关键词检索，1996 年是19 篇，1999 年157 篇，到2003 年就高达2984 篇，2009年会是多少呢？我们不得而知。但其迅猛的发展势头却是不可更改的，本公司真诚希望能和众多研究人员共同努力，抓住这一大好时机，为科研事业的发展贡献自身的力量。基于这一目标，本公司长期以来对荧光定量PCR，无论是技术还是多年来的产品，均进行了深入地研究，并及时推出更加优异的荧光定量 PCR技术服务。

荧光定量PCR原理

荧光定量PCR最早称TaqMan PCR，后来也叫Real-Time PCR，是美国PE（Perkin

Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的。其原理：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR

的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT值（如下图所示）。