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生化实验教案

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1 / 12 实验七、氨基酸的纸上电泳

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2 / 12 徐 州 工 程 学 院 教 案 纸

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3 / 12 六、实验结果

氨基酸纸层析图谱并分析结果。

七、思考题

如何采用氨基酸纸层析法分离多种氨基酸？ 希望对大家有所帮助，多谢您的浏览！

4 / 12 实验八 动物肝脏中DNA的提取

一、目的

学习和掌握用浓盐法从动物组织中提取DNA的原理和技术

二、原理

核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形式存在，其中DNA主要存在于细胞核中，RNA主要存在于核仁及胞质中，在制备核酸时应防止过酸、过碱及其它能引起核酸降解的因素的作用。全部操作过程应在低温下（4℃）进行，必要时还要加入酶抑制剂。如柠檬酸、氰化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸（EDTA）等可以抑制DNA酶活性，皂土可抑制RNA酶活性，同时SDS或苯酚等蛋白变性剂也可使核酸降解酶破坏。 动植物的DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液（如1mol/L NaCl），但在0.14mol/L 的盐溶液中溶解度降低，而RNA核蛋白则溶于0.14mol/L 盐溶液，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖蛋白和核糖蛋白从样品中分别抽提出来。 将抽提得到的脱氧核糖蛋白用SDS（十二烷基硫酸钠）处理，DNA即与蛋白质分开，可用氯仿－异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向含有DNA的水相中加入冷乙醇，DNA即呈纤维状沉淀出来。

三、实验器材

1． 猪肝。 2． 722型（或7220型）分光光度计。 3． 匀浆器 4． 量筒50ml（×1）、10ml（×1）。 5． 离心机（5000r/min）。 6． 离心管。 7． 试管及试管架。 8． 吸管0.50ml（×2）、1.0ml（×2）、2.0ml（×2）、5.0ml（×1）。

四、实验试剂

1．0.1mol/L NaCl－0.05mol/L柠檬酸钠（pH6.8）。 2．0.015mol/L

NaCl－0.0015mol/L 柠檬酸三钠溶液：氯化钠0.828g 及柠檬酸三钠0.341g溶于蒸馏水，稀释至1000ml。 3．95％乙醇（A．Ｒ．）。 4．NaCl固体（A．Ｒ．）。 5．5％SDS溶液：5g SDS溶于100ml 水中。 6．氯仿（A．Ｒ．）。 7．V（氯仿）：V（异戊醇）混合液20：1。

五、操作

1． 称取猪肝8g，用匀浆器磨碎（冰浴），加入相当于2倍肝重的0.1mol/L NaCl－0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液，研磨三次，然后倒出匀浆物，匀浆物在4000r/min 下离心10min；沉淀中再加入25ml缓冲液，于4000r/min 离心20min；取沉淀。

2． 在上述沉淀中加入40ml 0.1mol/L NaCl－0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液、20mlCHCl3－异戊醇混合液、4ml 5％ SDS使其终浓度为0.41％，振摇30min，然后缓慢加固体NaCl，使其浓度为1mol/L（约3.6g）。将上述混合液在3500r/min离心20min，取上清水相。

3． 在上述水相溶液中加入等体积冷95％乙醇，边加边用玻璃棒慢慢搅动，将缠绕在玻棒上的凝胶状物用滤纸吸去多余的乙醇，即得DNA粗品。用蒸馏水溶解并定容至50ml，用二苯胺法测定DNA含量。

4． 提纯将上述所得的DNA粗品置于20ml 0.015mol/L NaCl－0.0015mol/L 柠檬酸三钠溶液中，加入1倍体积的氯仿－异戊醇混合液，振摇10min，离心（4000r/min，10min），倾出上层液（沉淀弃去），加入1.5 倍体积95％乙醇，DNA即沉淀析出。离心，弃去上清液，沉淀（粗DNA）按 希望对大家有所帮助，多谢您的浏览！

5 / 12 本操作步骤重复一次。最后所得沉淀用无水乙醇洗涤2次，真空干燥。 希望对大家有所帮助，多谢您的浏览！

5 / 12 四、实验结果

是否可见DNA？颜色如何？有无断裂现象？

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6 / 12 实验九 酵母RNA的提取和定性检测

【实验目的】

1．学习稀碱法提取RNA的原理和操作方法

2. 掌握RNA组分的鉴定方法

【实验原理】

酵母中含有丰富的RNA(可达酵母干重的2.62％～10％)，是工业上大规模制备核酸和核苷酸的原料。稀碱法是工业上常用的RNA提取方法，是用稀碱溶液使细胞裂解，使RNA释放到碱液中，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA；或用酸调整pH至2.5，利用等电点沉淀RNA。

RNA用H2SO4水解时，可以生成磷酸、戊糖和碱基，各种成分以下列反应鉴定：①磷酸：用强酸使RNA中的有机磷消化成无机磷，后者与定磷试剂中的钼酸铵结合成磷钼酸铵（黄色沉淀），当有还原剂存在时磷钼酸铵立即转变成蓝色的还原产物—钼蓝。②核糖：RNA与浓盐酸共热时，发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与苔黑酚反应，在Fe3+或Cu2+催化下生成鲜绿色复合物。③嘌呤碱与AgNO3能产生白色的嘌呤银化合物沉淀。

【器材与试剂、】

(一) 器材

1. 150ml锥形瓶

2. 沸水浴

3. 量筒

4. 移液管

5. 吸管及滴管

6. 布氏漏斗和抽滤装置

7. 试管、试管夹及试管架

8. 离心机

9. 滤纸

10. pH试纸 希望对大家有所帮助，多谢您的浏览！

7 / 12 11. 烧杯

12. 天平

13. 酵母粉

(二) 试剂

1. 0.2% NaOH溶液

2. 95％乙醇

3. 冰乙酸

4. 无水乙醚

5. 1.5mol/L H2SO4

6. 浓氨水

7. 5％AgNO3溶液

8. 苔黑酚乙醇溶液

称取苔黑酚6g，溶解于95％乙醇100ml (冰箱中可保存1个月)。

9. FeCl3的浓盐酸溶液

取10％FeCl3 2ml，与浓盐酸400ml混合。

10. 定磷试剂

（1）17％H2SO4溶液

（2）2.5％钼酸铵溶液

（3）10％抗坏血酸溶液(贮存于棕色瓶中，溶液在冰箱放置可用1个月。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄色或棕色则已失效。)

临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合(限当天使用)：

17%H2SO4:2.5％钼酸铵:水:10％抗坏血酸=1:1:2:1（V:V）

【实验步骤】

（一） RNA的粗提取

1. 取酵母粉5g，置于100ml烧杯中，加入0.2％NaOH溶液20ml，搅拌成悬浮液。

2. 将悬浮液在沸水浴中加热30min，冷却至室温，分两管4000rpm离心10min。

3. 将上清液缓缓倾入95%乙醇30ml中，注意边搅拌边缓缓倾入,用冰乙 希望对大家有所帮助，多谢您的浏览！

8 / 12 酸调pH值至2.5。静置，待RNA沉淀完全后，3000rpm离心3min。 希望对大家有所帮助，多谢您的浏览！

8 / 12 4. 弃上清，以95％乙醇10ml洗涤沉淀，3000rpm离心3min。再用95％乙醇10ml洗涤沉淀，并移入布氏漏斗中抽滤。

5. 用无水乙醚洗涤沉淀2次，每次20ml，于布氏漏斗中抽滤至沉淀干燥。

(二) 水解RNA

将提取的RNA加入5ml 10% H2SO4中，沸水浴加热10min,使RNA水解。

(三) RNA组分鉴定

1. 嘌呤碱：取试管1支，加入水解液1ml，浓氨水2ml，5％的AgNO3 1ml，观察是否产生白色絮状嘌呤银化物沉淀（放置后可能变为棕黑色）。

2. 戊糖：取试管1支，加入水解液1ml，苔黑酚-FeCI3溶液1ml，在沸水浴中加热，观察试管中颜色变化。

3. 磷酸：取试管1支，加入水解液1ml和定磷试剂1ml，在沸水浴中加热，观察试管中颜色变化。

【要点提示】

1.苔黑酚(又名地衣酚,3,5­甲苯二酚) 鉴定戊糖时特异性较差，凡属戊糖均有此反应。微量DNA无影响，较多DNA存在时有干扰作用，在试剂中加入适量CUCl2·2H2O可减少DNA的干扰，甚至某些戊糖持续加热后生成的羟甲基糠醛也能与地衣酚反应，产生显色复合物。

2. 苔黑酚鉴定戊糖时也可用下列配方：

(1)苔黑酚试剂：FeCI3 0.1g溶于浓盐酸100ml，摇匀，贮存备用。使用前加入苔黑酚0.476g。

(2)苔黑酚试剂：苔黑酚0.1g溶于浓盐酸100ml中，再加FeCI3 0.1g（临用前配制）。

3．RNA中磷酸的鉴定方法有两种，原理如下：

（1）钼酸铵试剂鉴定：

钼酸铵试剂：钼酸铵2g溶解于10％的硫酸100ml。 希望对大家有所帮助，多谢您的浏览！

9 / 12 强酸使RNA分子中的有机磷消化成无机磷，使与钼酸铵试剂中的钼酸铵结合成磷钼酸铵（NH4）3PO4·12MoO3（黄色沉淀）。

PO43-+3NH4++12MOO42-+24H+=(NH4)3 PO4·12MOO3·6H2O↓+6H2O

(2)定磷试剂鉴定：上述反应当有还原剂存在时，MO6+被还原成MO4+，此Mo4+再与试剂中的其它MO42-结合成MO（MOO4）2或MO3O8,呈蓝色，称为钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅和磷含量成正比，因此也可用分光光度法定量测定RNA。

4.用乙醇沉淀RNA时，需用酸中和稀碱，可以加冰乙酸至pH2.5，也可以直接用酸性乙醇（浓盐酸1ml加入乙醇100ml中）至溶液pH至2.5。

5.用AgNO3鉴定RNA中的嘌呤碱时，除了产生嘌呤银化物沉淀外，还会产生磷酸银沉淀，磷酸银沉淀可溶于氨水，而嘌呤银化物沉淀在浓氨水中溶解度很低，加入浓氨水可消除PO43+的干扰。

【思考题】

1.用苔黑酚鉴定RNA时加入Cu2+或Fe3+的目的是什么？

2.用AgNO3鉴定嘌呤碱基时加入浓氨水的目的是什么？

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生化实验5

生化实验5

氨基转化作用

一、实验目的

1. 了解转氨酶在代谢过程中的重要作用；

2. 学习应用纸层析法鉴定氨基转换反应；

二、实验原理

1. 体内α-氨基酸的α-氨基在氨基转换酶的作用下，转换至α-酮酸的过程，称为氨基转换作用。

2. 本实验将谷氨酸和丙酮酸在肌肉糜中谷氨酸-丙氨酸氨基转换酶的作用下进行氨基转化反应，然后用纸层析法检查反应体系中丙氨酸的生成。反应为L-谷氨酸+丙酮酸=α-酮戊二酸+L-丙氨酸，由于谷氨酸、丙氨酸在肌肉糜中可循其他代谢途径分解转化，因此在反应体系中添加溴乙酸抑制其他代谢过程。

三、实验仪器和试剂

１.试剂

1%谷氨酸溶液、1%丙酮酸钠溶液、0.1%KHCO3溶液、0.025%溴乙酸溶液、2%Hac溶液、0.1%标准谷氨酸溶液、0.1%标准丙氨酸溶液、1%KOH溶液、酚饱和溶液、0.1%茚三酮正丁醇溶液。

２.器材

兔子肉、研钵、毛细管、圆形滤纸、喉头喷雾剂

四、实验步骤

实验操作 实验现象

制备肌肉糜提取液：取1g兔肉于研钵，加入0.9%的NaCl溶液3mL，在低温下研磨成细浆，离心2min（8000rad/min），弃去沉淀，取上清液。 兔肉大量溶解，少量形成乳白色悬浊液；离心后上层为取色透明清液，下层为肉色沉淀。

取3支试管编号，1、2号试管各加入0.5mL1%谷氨酸溶液，0.5mL1%丙酮酸钠溶液，0.5mL0.1%KHCO3溶液，0.025mL0.025%溴乙酸溶液，混匀。然后分别加入肌肉糜提取液0.5mL，混匀。2号试管立即放入沸水中加热2-3min。3号试管先加入肌肉糜提取液0.5mL，放入沸水中加热2-3min，然后在按照1、2试管的配比加入各试剂。 1号试管透明澄清，2号试管上层漂浮着乳白色不溶物，下层为无色透明清液，3号试管有乳白色絮状沉淀。

用塞子塞住试管放入45℃恒温水浴中加热30min。 无明显现象。

保温完毕，取出试管，向每支试管中各加入4滴2%Hac溶液，再离心前，三支试管内容物与恒温水浴前无异；离心后，得无色透放入沸水浴中加热2min，使蛋白质完全沉淀，离心1min（12000rad/min），弃去沉淀，取上清液。 明上清液，下层有少量肉色沉淀。

生化实验报告

生化实验报告

生化实验报告

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实验1.多酚氧化酶（PPO）的分离提取

一、实验原理与目的

植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。但是PPO的存在是水果、蔬菜褐变的主要原因之一，影响一些经济植物产品的质量。多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标之一。

本实验将采用马铃薯为主要材料，通过细胞组织破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离的系统技术。

二、实验材料与试剂

1.材料：马铃薯（大约每小组100-200g）

2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH6.（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5％甘油，1％的聚乙烯吡咯烷酮）配制时配×10倍的浓缩液1000ml； 固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）配制时配×10倍浓缩液100ml；0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）配制时配×10倍浓缩液1000ml； NaCl； 聚乙二醇： DEAE－纤维素 DE52； 葡聚糖凝胶Sephadex G-200:

三、 实验步骤

（1）粗酶提取： 马铃薯丁按1:1（W/V）比例与0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5％甘油，1％的聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆后4层纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。

（2）盐析分级沉淀：在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40％饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液再加入固体硫酸铵达到70％饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm离心20min，弃除上清液，收集粗酶沉淀；沉淀用0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）溶解，装入透析袋中用0.02M KCl溶液透析至无硫酸铵根离子，获得粗酶液供上柱使用。

生化实验整理

生化实验整理

1. 氨基酸的分离鉴定——纸层析法

一、实验目的

✓ 了解层析技术的一般原理

✓ 掌握纸层析的方法和原理，学会分析未知样品的氨基酸成分

二、实验原理

➢ 层析法亦称色谱法，是利用混合物中各组分的物理、化学及生物学特性的差异，使各组分以不同程度分布在两个相中，即固定相和流动相，当流动相流过加有样品的固定相时，各组分所受固定相的阻滞作用和受流动相的推动作用的影响各不相同，从而使各组分以不同速度移动而达到分离的目的

➢ 固定相：是由层析基质组成的，可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在纤维素或硅胶上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用

➢ 流动相：是在层析过程中，推动固定相上待分离的物质向一定方向移动的液体、气体或超临界体。柱层析中一般称为洗脱液，薄层层析时称为展层剂

➢ 分配系数：是指在一定的条件下，某一组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比例，常用K来表示，它是层析中分离纯化物质的重要依据

➢ 迁移率：是指在一定条件下，某一组分在相同的时间内，在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值，常用Rf来表示

分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件，差异越大，分离效果越理想

➢ 层析根据不同的标准可以分为多种类型：如按固定相基质的形式不同可分为纸层析、薄层层析和柱层析；按流动相的形式不同可分为液相层析、气相层析和超临界层析；按分离的原理不同可分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等

➢ 纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。有机相流经固定相支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示：

在一定条件下，某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关

生化实验教案

生化实验教案

实验七、氨基酸的纸上电泳

徐 州 工 程 学 院 教 案 纸

六、实验结果

氨基酸纸层析图谱并分析结果。

七、思考题

如何采用氨基酸纸层析法分离多种氨基酸？ 实验八 动物肝脏中DNA的提取

一、目的

学习和掌握用浓盐法从动物组织中提取DNA的原理和技术

二、原理

核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形式存在，其中DNA主要存在于细胞核中，RNA主要存在于核仁及胞质中，在制备核酸时应防止过酸、过碱及其它能引起核酸降解的因素的作用。全部操作过程应在低温下（4℃）进行，必要时还要加入酶抑制剂。如柠檬酸、氰化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸（EDTA）等可以抑制DNA酶活性，皂土可抑制RNA酶活性，同时SDS或苯酚等蛋白变性剂也可使核酸降解酶破坏。 动植物的DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液（如1mol/L NaCl），但在0.14mol/L 的盐溶液中溶解度降低，而RNA核蛋白则溶于0.14mol/L 盐溶液，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖蛋白和核糖蛋白从样品中分别抽提出来。 将抽提得到的脱氧核糖蛋白用SDS（十二烷基硫酸钠）处理，DNA即与蛋白质分开，可用氯仿－异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向含有DNA的水相中加入冷乙醇，DNA即呈纤维状沉淀出来。

三、实验器材

1． 猪肝。 2． 722型（或7220型）分光光度计。 3． 匀浆器 4． 量筒50ml（×1）、10ml（×1）。 5． 离心机（5000r/min）。 6． 离心管。 7． 试管及试管架。 8． 吸管0.50ml（×2）、1.0ml（×2）、2.0ml（×2）、5.0ml（×1）。

四、实验试剂

1．0.1mol/L NaCl－0.05mol/L柠檬酸钠（pH6.8）。 2．0.015mol/L NaCl－0.0015mol/L 柠檬酸三钠溶液：氯化钠0.828g 及柠檬酸三钠0.341g溶于蒸馏水，稀释至1000ml。 3．95％乙醇（A．Ｒ．）。 4．NaCl固体（A．Ｒ．）。 5．5％SDS溶液：5g SDS溶于100ml 水中。 6．氯仿（A．Ｒ．）。 7．V（氯仿）：V（异戊醇）混合液20：1。