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兔角膜上皮细胞体外原代培养方法的研究【摘要】目的:建立体外原代培养兔角膜上皮细胞简单经济实用的方法,并观察其体外生长的生物学特性。
方法:采用消化法、组织块培养法培养兔角膜上皮细胞并进行传代培养,分别测定细胞分裂指数及细胞贴壁率,MTT比色法测定细胞生长曲线。
结果:两种方法培养的细胞在原代、第1代形态相似，消化法培养的细胞代数维持低于组织块法；对数生长期时，组织块培养法的细胞具有更好的活力且分裂旺盛；在16 h后，消化法培养的细胞贴壁率低于组织块培养法。
结论:选择组织块培养法培养兔角膜上皮细胞可获得状态良好的连续传代扩增的细胞，且具有经济实用性；角膜上皮细胞符合一般有限细胞系的生长规律。
【关键词】角膜；上皮细胞；原代细胞培养；兔角膜细胞成分培养是现代角膜病研究和治疗的基础，近年来，随着研究深入，对角膜细胞成分培养提出了更高要求。
在此，我们探索了体外原代培养兔角膜上皮细胞的两种方法，以期建立一种简单、经济、实用的兔角膜上皮细胞培养方法，现将实验结果报告如下。
1 材料和方法实验材料实验动物健康新西兰白兔6只，雌雄不限，体重～ kg,由东南大学实验动物中心提供与饲养。
眼部经裂隙灯显微镜检查显示屈光间质透明，无眼前节病变。
主要试剂和仪器DMEM/F12，胰蛋白酶，EDTA，MTT，CO2培养箱，倒置相差显微镜，酶标仪。
培养液的制备采用DMEM/F12=1∶1的混合液，内含10 mmo1·L-1HEPES、20%胎牛血清、100×103 U·L-1青霉素和100×103 U·L-1链霉素，pH值～。
实验方法取材取新西兰白兔6只，共12眼，以空气栓塞法处死兔，无菌条件下迅速摘取眼球，用PBS 反复冲洗后浸泡于含青、链霉素1 000×103 U·L-1 4 ℃ PBS中10 min,待用。
消化法原代培养角膜上皮细胞在超净工作台上将眼球用PBS冲洗2～3次，沿角膜缘取下完整角膜，用DMEM/F12培养液冲洗1～2次；在50 mm培养皿中加%胰蛋白酶或％胰蛋白酶－％EDTA混合消化液约1 ml，将上述处理过的兔眼角膜上皮面朝下置于消化液中，培养箱中消化20～30 min后翻转角膜片，轻轻冲洗上皮面，将冲洗液移至加有适量胎牛血清的离心管终止消化；在培养皿中再次加入消化液，置培养箱中消化10 min后终止消化；将两次消化的细胞悬液离心6～8 min(1 000 r·min-1)，弃上清，加入全培养液，吹打混匀。
第50卷第6期Vol．50No．6山东大学学报（医学版）JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY （HEALTH SCIENCES ）2012年6月Jun．2012收稿日期：2012-03-12基金项目：国家高技术研究发展863计划（2006AA02A132）。
作者简介：王瑞鑫（1986－），男，硕士研究生，主要研究方向为角膜组织工程。
E-mail ：wrxshtc@126．com 通讯作者：樊廷俊（1964－），男，理学博士，教授，博士生导师，主要研究方向为角膜组织工程。
E-mail ：tjfan@ouc．edu．cn 文章编号：1671－7554（2012）06－0031－07DOI ：10．6040/j．issn．1671-7554．2012．06．007·基础医学·角膜上皮细胞体外培养技术的研究进展王瑞鑫，樊廷俊（中国海洋大学海洋生命学院角膜组织工程实验室，山东青岛266003）摘要：体外重建组织工程角膜并将其用于角膜移植是使角膜盲患者复明的惟一有效途径，其中角膜上皮种子细胞的来源成为急需解决的关键问题。
由于体外生长的角膜上皮细胞生命周期短，因此通过改进体外培养技术来获得增殖能力强的细胞成为解决角膜上皮种子细胞来源问题的首要任务。
本研究从角膜上皮细胞的体外培养技术包括培养方法和培养条件这两方面进行了综述。
关键词：组织工程角膜；角膜上皮细胞；种子细胞；体外培养中图分类号：R318文献标志码：AResearch advances on in vitro culture techniques of corneal epithelial cellsWANG Rui-xin ，FAN Ting-jun（Laboratory of Corneal Tissue-engineering ，College of Marine Life Sciences ，Ocean University of China ，Qingdao 266003，Shandong ，China ）Abstract ：In vitro reconstruction of tissue-engineered corneas for transplantation is an effective way to cure corneal blindness ，and the key issue is the source of corneal epithelial seed cells．Due to the short life-span of corneal epithelial cells in vitro ，improvement of culture techniques to obtain the cells with strong proliferation ability is believed to solve the seed cells source problem．In this present paper ，we reviewed the in vitro culture techniques of corneal epithelial cells including culture methods and conditions．Key words ：Tissue-engineering cornea ；Corneal epithelial cells ；Seed cells ；In vitro culture角膜病盲是仅排白内障之后的第二大致盲眼病，角膜移植是目前角膜盲治愈的惟一有效手段。
基础研究以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜的构建及移植+徐婉欣，凌玲，查琴，钟姝，姚玲，柯慧敏，陈敬旺，陈磊，詹桃，周文天么南昌大学附属眼科医院角膜屈光科（江西南昌330006)【摘要】目的进行体外分离和培养兔角膜缘干细胞，使之成为一种上皮组织，以便进行角膜移植方法组织块法体外培养兔角膜缘干细胞：角膜缘组织块作为外植体，在脱细胞猪角膜基质上培养；获得的复合角膜上皮组织移植于兔眼，观察并记录兔角膜组织生长情况，待角膜组织生长良好后做免疫组织化学鉴定。
结果兔角膜缘组织应用组织块法在脱细胞角膜基质上生长9 ~ 10 d后达到80%汇合状态，显微镋下动态观察细胞生长良好，增殖能力较高，将组织工程化角膜上皮作异体板层角膜移植于兔眼后，4 ~5 d角膜上皮光滑，20~2丨（_1角膜变为透明，荧光素染色只见缝线处少许着色，期间未见角膜移植排斥反应。
术后30 c lHE染色显示角膜组织与宿主角膜组织结合良好，上皮细胞可见4 ~5层结构，可见角膜缘干细胞多呈卵圆形；免疫荧光染色可见培养的细胞P63、CK3单克隆抗体呈阳性表达。
结论以组织块法生长的以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜可在角膜缘干细胞缺乏的兔眼上生长良好..【关键词】兔角膜缘干细胞；组织工程；组织块培养法；脱细胞角膜基质【中图分类号】R338.7;R779.65 【文献标志码】ADOI：10. 13820/j. cnki. gdyx. 20203179Construction and transplantation of tissue engineered rabbit cornea with acellular corneal stroma as carrier. X U W an - x in , L IN G L in g, Z H A Q in, Z H O N G S h u, YAO L in g, K E H u i -m i n, C H E N J in g-w a n g, C H E N L e i, Z H A N T a o, Z H O U W en -d a n.D ep a rtm en t o f C o rn ea l R efra ctio n^E y e H o sp ita l A ffilia te d to N a n c h a n g U n iversity^ N a n c h a n g330006, J ia n g x i^C h in a.C o rresp o n d in g a u th o r ：Z H O U W en - tia n. E-m a i l：2424917422@co m.【Abstract】Objective T o isolate an d cu ltu re ra b b it corn eal lim b al stem cells in to a n epithelial tissue fo r com eal transplantation in v itro. Methods R ab b it corn eal lim b al stem cells w ere cultured in v itro expland culture m ethods. T he corneal lim b al tissue m ass w as cultured o n th e decellularized p orcine corn eal strom a. Results T he lim b al tissue of ra b b it g rew o n th e acellular corn eal strom a using th e exp lan t cu ltu re m eth od fo r 9-10 d ays a n d reached 80%confluence state. T he dynam ic ob servation u n d er the m icroscope show ed th a t th e cells g rew w ell w ith h igh p roliferative ability. A fter th e tissue — engineered com eal epithelium w as used as th e allogeneic lam ellar k eratoplasty in th e ra b b it eye, th e u p p er com eal skin w a s sm oothed 4-5c la y s later, an d the cornea becam e tran sp aren t 20 -21 d ays later. O n ly a little staining w as fou n d a t th e su tu re d u rin g the fluorescein staining. N o com eal tran sp lan t rejection w as observed. O n the 30th d ay after operation, the staining show ed th a t the cornea an d h ost cornea w ere w ell com bined, th e epithelial cells show ed 4 - 5 layers of structure，L S C s w ere m ostly oval, an d im m unofluorescence staining show ed th a t [^63an d C K3m onoclonal antibodies of cu ltu red c ells w ere positive. Conclusion T h e tissue engineered ra b b it cornea g ro w n b y explant culture m eth od w ith acellular com eal stro m a can g ro w w ell in th e eyes of rab b its lacking corneal lim bal stem cells.【Key words】ra b b it corn eal lim bal stem cells; tissue engineering; tissue m ass culture; decellular com eal stro m a近十年的研究表明，干细胞是多能的、缓慢循环再生的细胞[1]。
《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research文章编号:2095-4344(2020)25-04012-064012 www.CRTER .org·研究原著·许中中，男，1982年生，河南省郑州市人，汉族，2013年郑州大学第一附属医院毕业，博士，主治医师，主要从事角膜上皮干细胞的体外分离及培养、组织工程技术构建角膜缘上皮片及眼表重建方面的研究。
通讯作者：王丽娅，医学博士后，主任医师，河南省人民医院眼科，河南省郑州市 450003文献标识码:B投稿日期：2019-11-25 送审日期：2019-12-05 采用日期：2020-02-19 在线日期：2020-04-07Xu Zhongzhong, PhD, Attending physician, Department ofOphthalmology, People’s Hospital of Zhengzhou, Zhengzhou 450003, Henan Province, ChinaCorresponding author: Wang Liya, PhD, Chief physician, Department of Ophthalmology, Henan Provincial People’s Hospital, Zhengzhou 450003, Henan Province, China改良组织块培养法体外培养人角膜上皮干细胞许中中1，余晓菲2，王丽娅2 (1郑州人民医院眼科，河南省郑州市 450003；2河南省人民医院眼科，河南省郑州市 450003)DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2097 ORCID: 0000-0001-8370-174X(许中中)文章快速阅读：文题释义：角膜上皮干细胞：属于单能干细胞，具有细胞周期长、低分化状态、增殖潜力大、不对称分裂等特点，定位于角膜缘基底细胞层，又称之为角膜缘干细胞，对角膜上皮细胞更新及维持角膜透明起着重要作用。
羊膜培养液体外抑制兔角膜上皮细胞血管内皮生长因子的表达李军;马翔【摘要】目的:探讨羊膜培养液对角膜上皮细胞中血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响.方法:刮除并收集新鲜兔角膜上皮细胞,传代培养接种于35mm培养皿及自制的羊膜培养皿上.实验分为4组,Ⅰ组(对照组):无血清的DMEM培养液,Ⅱ组:去上皮的羊膜培养液,Ⅲ组:未去上皮的羊膜培养液,Ⅳ组:将细胞直接接种于无上皮羊膜.作用48h后用Trizol法提取各组样本的总RNA,进行RT-PCR一步法反应检测各组VEGF mRNA表达并与β-actin比较.结果:正常角膜上皮细胞中有VEGF基因表达,在Ⅲ,Ⅳ组中表达受到明显抑制(P＜0.01,n=5).结论:羊膜培养液明显抑制VEGF mRNA在角膜上皮细胞中的表达.【期刊名称】《国际眼科杂志》【年(卷),期】2010(010)004【总页数】3页(P643-645)【关键词】羊膜;角膜新生血管;血管内皮生长因子;角膜上皮细胞【作者】李军;马翔【作者单位】116037,中国辽宁省大连市第三人民医院眼科;116011,中国辽宁省大连市,大连医科大学附属第一医院眼科【正文语种】中文0 引言正常的角膜无血管,角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)常由损伤及各种炎症刺激诱导产生。
严重的角膜新生血管化会导致视力下降甚至视力丧失;随着新生血管的长入,角膜的免疫赦免地位丧失。
虽然目前有多种方法用于治疗角膜新生血管,但均未获得满意疗效。
临床上羊膜角膜移植及羊膜移植眼表重建,均显示其有抑制角膜新生血管的作用[1],虽然已知羊膜的细胞外基质及可溶性细胞因子可能参与这一作用机制[2,3],然而具体作用机制仍不明。
最近研究表明,羊膜培养液可明显地抑制角膜新生血管化[4],为进一步理解这一作用机制,我们应用可能释放多种细胞因子的羊膜培养液,对角膜上皮细胞中血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影响进行研究。
兔角膜缘干细胞体外培养方法的研究肖莉;苏敏;石清明【摘要】目的探讨兔角膜缘干细胞培养方法,并获得兔角膜缘干细胞.方法采用组织块培养法,对兔角膜缘干细胞行体外培养;对原代培养第7 d的细胞进行p63、AE5免疫组织化学鉴定.结果原代培养的细胞通常在7 d左右即可达到80%～90%的融合,细胞呈椭圆形或多边形,核质比例大,表现出较强的增生能力.结论采用组织块培养法对兔角膜缘组织进行体外培养,可获得较纯、未分化、有增生能力的角膜缘干细胞.【期刊名称】《西南国防医药》【年(卷),期】2010(020)003【总页数】3页(P246-248)【关键词】角膜缘干细胞;细胞培养;免疫组织化学法;兔【作者】肖莉;苏敏;石清明【作者单位】610083,成都医学院人体解剖学教研室;贵阳医学院组织胚胎学教研室;成都军区疾病预防控制中心【正文语种】中文【中图分类】Q813.11角膜缘干细胞( limbal stem cells， LSCs)是位于角膜缘基底层的一种特殊类型的上皮细胞，在角膜上皮更新、角膜表面完整性平衡的维持和创伤愈合中起重要作用。
随着细胞培养技术的发展，LSCs体外培养后移植，用于治疗由于LSCs缺乏或者功能不全引起的眼表疾病成为研究的热点。
本研究通过兔角膜缘干细胞的体外培养，为角膜缘干细胞的临床移植提供实验基础。
1 材料与方法1.1 实验动物健康新西兰白兔10只，体重2～2.5 kg，雌雄不限，眼部均无任何疾患，遵义医学院实验动物中心提供。
1.2 材料及试剂主要试剂DMEM/F12培养基，Sigma公司产品；胎牛血清(FCS)，GiBCO公司产品；噻唑蓝，Amresco公司产品；表皮生长因子(EGF)，Sigma公司产品；胰蛋白酶，Amresco公司产品；依地酸二钠(EDTA)，Sigma公司产品；鼠单克隆抗体AE5(特异性识别CK3)，Chemicon公司产品；鼠单克隆抗体p63，福州迈新生物工程公司产品。
作者简介:石 妍,女,1983年5月出生,黑龙江省哈尔滨市人,在读硕士研究生。
E-m a i l:s h i y a n y o y o@ 126.c o mA b o u tS H I Y a n:F e m a l e,b o r n i n M a y,1983.P o s t g r a d u a t e s t u d e n t.E-m a i l:s h i y a n y o y o@126.c o m收稿日期:2009-11-30修回日期:2010-04-08本文编辑:董建军■基金项目:黑龙江省科技攻关课题基金资助(编号:G C08C416);黑龙江省教育厅课题基金资助(编号: 11531177)作者单位:150001 黑龙江省哈尔滨市,哈尔滨医科大学第一临床医学院眼科医院通讯作者:刘 平,E-m a i l:l i u p i n g53 @163.c o mR e c e i v e dd a t e:N o v30,2009A c c e p t e dd a t e:A p r8,2010F o u n d a t i o n i t e m:K e y S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y P r o g r a m o fH e i l o n g j i a n g P r o v i n c e(N o:G C08C416);F o u n d a t i o n b yH e i l o n g j i a n gP r o v i n c i a lE d u c a t i o n D e p a r t m e n t(N o:11531177)F r o mt h eE y e H o s p i t a l,t h e F i r s t A f f i l-i a-t e d H o s p i t a l o f H a r b i nM e d i c a l U n i-v e r s i t y,H a r b i n150001,H e i l o n g j i a n g P r o v i n c e,C h i n aR e s p o n s i b l e a u t h o r:L I U P i n g,E-m a i l:l i u p i n g53@163.c o m【实验研究】改良兔角膜上皮细胞原代培养及纯化的方法■石 妍 杨 帆 葛红岩 刘 平I m p r o v e dm e t h o do fp r i m a r yc u l t u r ea n d p u r i f i c a t i o no f r a b b i t c o r n e a l e p i t h e l i a l c e l l s S H I Y a n,Y A N GF a n,G EH o n g-Y a n,L I UP i n g【Ke y wo r d s】 c o r n e a l e p i t h e l i a l c e l l s;e n t i r ec o r n e a;p r i m a r yc e l l c u l t u r e;p u r i f i c a-t i o n;r a b b i t【A b s t r a c t】 O b j e c t i v e T o i m p r o v e t h e m e t h o do f p r i m a r y c u l t u r e a n dp u r i f i c a t i o no f r a b b i t c o r n e a l e p i t h e l i a l c e l l s,a n dt oe n h a n c et h e s u c c e s s f u l r a t eo f p r i m a r yc u l t u r e. Me t h o d s T h er a b b i t c o r n e a l e p i t h e l i a l c e l l sw e r ec u l t u r e db yt h ee n t i r ec o r n e a l t i s-s u e-c u l t u r e,p u r i f i e da n d p a s s a g e d b y t h e m e t h o do f m e c h a n i c a l c u r e t t a g e a n dd i f f e r e n t i-a l a d h e s i o n,t h e m o r p h o l o g yo f t h ec u l t u r e dc e l l s w a s ob s e r v e db yi n v e r t e dp h a s ec o n-t r a c t m i c r o s c o p e,a n dt h ec u l t u r e dc e l l s w e r ei d e n t i f i e db yi m mu n o h i s t o c h e m i c a l m e t h-o d.Re s u l t s T h er a b b i te n t i r ec o r n e aa d h e r e di n24h o u r s,t h ec e l l sc o u l d b es e e nc l i m b i n g o u t f r o m t h ec o r n e a l l i m b u s f r o m48h o u r s l a t e r,a l a r g en u mb e r o f f i b r o b l a s t sa n de p i t h e l i a l c e l l sc o u l db es e e nc l i m b i n g o u ta nd c oe x i s t e d af t e r5d a y s,a n dt h eb o u n d a r i e s w e r ec l e a r;T h es t r a t i f i ede p i t h e l i a l c e l l sg r e w.T h ef i b r o b l a s t sb e f o r et h eb o u n d a r y f u s e dw e r ec u r e t t a g e d,t h e c o r n e a l e p i t h e l i a l c e l l s s e q u e n t i a l g r e w s t r o n g l ya n dr e a c h e dc o n f l u e n c e a f t e r10d a y s.A f t e r p a s s a g e dt ot h e4t hg e n e r a t i o n,t h ec e l l sw e r es i g n i f i c a n t l yl a r g e r a n da g i n g.T h ec u l t u r e dc e l l ss t a i n e dp o s i t i v e l yf o r m o n o c l o n a l a n t i-b o d yP C Kb yi m m u n o h i s t oc h e mi c a l m e t h o d.C o n c l u s i o n s T h ei m p r o v e dm e t h o do f p r i m a r y c u l t u r ea n dp u r i f i c a t i o no f c o r n e a l e p i t h e l i a l c e l l s i s s i m p l e,e c o n o m i c s a n de f-f e c t i v e,b yi t t h eb e t t e rb i o l og i cp r o p e r t yo f c o r n e a l e p i th e li a l c e l l sc a nb eo b t a i n e d,w h i c he s t a b l i s ht h ee x p e r i me n t a l b a s i s f o r s t u d y i n g t h ec o r n e a a n dc o r n e a l d i s e a s e s.[R e cA d v O p h t h a l mo l2010;30(7):612-615]【中图分类号】 R394.2 【文献标志码】 A【文章编号】 1003-5141(2010)07-0612-04【关键词】 角膜上皮细胞;全角膜;原代细胞培养;纯化;兔【摘要】 目的 改良原代培养及纯化兔角膜上皮细胞的方法,提高角膜上皮细胞原代培养的成功率。
方法 采用全角膜组织培养法培养兔角膜上皮细胞,利用机械刮除和差速贴壁法进行纯化并传代,通过倒置显微镜对细胞进行形态学观察并应用免疫组织化学的方法对细胞进行鉴定。
结果 兔全角膜24h贴壁,48h后即可见有细胞自角膜缘爬出,5d后细胞大量爬出可见成纤维细胞和角膜上皮细胞共存,界限明显;角膜上皮细胞复层生长。
在界限融合前刮除成纤维细胞,角膜上皮细胞继续旺盛生长,10d后达到融合。
兔角膜上皮细胞传至第4代后细胞体积明显变大,传至第5代,细胞衰老、凋亡。
兔角膜上皮细胞免疫组织化学显示P C K单克隆抗体阳性。
结论 改良原代培养及纯化兔角膜上皮细胞的方法简单、经济、有效,并可获得具有良好生物学特性的角膜上皮细胞,为角膜及角膜疾病的研究奠定实验基础。
[眼科新进展 2010;30(7):612-615] 角膜位于眼球的最前端,分为上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层,具有良好的透光性和屈光性。
角膜上皮是抵御病原微生物侵袭的第一道屏障,在一定程度上也能抵御化学物质的侵袭。
如果角膜上皮受损,其他各层则极易受损,导致角膜混浊甚至致盲。
因此,很多学者都致力于加快角膜上皮创伤愈合的研究[1]。
成功的角膜上皮细胞培养对于角膜上皮的基础研究、创伤愈合以及药物治疗等有重要价值。
