MTT法

MTT法（四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）检测细胞增殖曲线，研究对细胞存活的影响：取对数生长期的细胞，经0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液计数，(共36－40ml培养液)→调整细胞浓度为5×103个细胞／ml，反复吹打使细胞均匀，接种于96孔培养板中，每孔100ul（细胞数为 500个培养箱孵育过夜后，36小时后弃原培养液，以细胞/孔）， 37℃，5%CO2无血清培养基清洗2遍，分组加药，加入不同浓度药液（0、10、100、1000、10000）培养液100ul(入无血清培养基中)，每种浓度设立8个平行对照（商），并设正常对照（无药对照）及空白对照（不加细胞只加培养液，其他步骤一样，最后比色调零用），置正常培养条件下培养。

→加药后的第24、48、72、96、120、144h分别取出一板，弃去培养液，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，继续培养4小时，→小心吸弃孔内上清培养液，每孔加入DMSO 100－200μl（白），振荡摇匀，10分钟充分溶解结晶物，→室温静置20－30分钟后选择490nm（570nm白、张），在酶联免疫检测仪（96孔酶标仪）上测定各孔吸光度（OD）值，并计算细胞存活率，即：细胞存活率=试验组吸光度值/对照组吸光度值×100%1．碘化丙啶（PI）：用PBS溶为1mg/ml，4℃避光保存。

2. MTT溶液(5mg/ml)：50mgMTT粉剂溶于10mlPBS中，以孔径为0.22um滤器过滤除菌。

呵呵以前做过的，大概的实验方法如下，不知道对你是否有用1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔180μl，3000-10000个/孔。

2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁，培养6-24小时。

3）加入待筛样品20μl，继续培养44小时。

4）小心吸去上清，加入80μl新鲜RPMI 1640培养液，再加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。

MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济。

由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。

这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。

配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。

因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的基培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。

在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

注意事项：MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。

在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。

MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。

mtt 法MTT法是一种常用的蛋白质组学技术，全称为多维液相色谱-串联质谱法（Multidimensional Protein Identification Technology）。

该技术利用多维液相色谱分离样品中的蛋白质，并通过串联质谱鉴定和定量这些蛋白质，从而实现对复杂混合物中蛋白质的高通量分析。

一、MTT法的原理MTT法主要包括两个步骤：样品前处理和多维液相色谱-串联质谱分析。

在样品前处理过程中，需要对样品进行裂解、消化和标记等处理，以便于后续的分离和鉴定。

在多维液相色谱-串联质谱分析过程中，则需要将裂解后的样品通过多次柱子分离，最终将样品中的蛋白质逐一鉴定并定量。

二、MTT法的优点1. 高通量：MTT法可以同时鉴定数千种不同的蛋白质，并且可以进行高通量筛选。

2. 灵敏度高：MTT法可以检测到低至femtomole级别的蛋白质。

3. 准确性高：MTT法可以精确鉴定样品中的蛋白质，并且可以进行定量分析。

4. 可重复性好：MTT法可以进行高度重复的实验，从而保证实验结果的可靠性。

5. 适用范围广：MTT法可以应用于多种生物样品，包括细胞、组织、血清等。

三、MTT法的应用1. 生物标记物发现：MTT法可以鉴定和筛选潜在的生物标记物，从而帮助诊断和治疗疾病。

2. 蛋白质互作研究：MTT法可以鉴定蛋白质之间的相互作用关系，从而揭示蛋白质网络中的关键节点。

3. 药效学研究：MTT法可以帮助评估药物对蛋白质组的影响，从而更好地理解药物作用机制。

4. 基因表达调控研究：MTT法可以帮助揭示基因表达调控网络中涉及到的蛋白质，并且可以评估不同条件下基因表达水平的变化情况。

四、MTT法存在的问题1. 样品前处理过程中存在的误差：由于样品前处理过程中存在很多环节，如裂解、消化和标记等，因此可能会引入一些误差。

2. 数据分析难度大：MTT法产生的数据量较大，数据分析难度较高。

3. 成本较高：MTT法需要使用复杂的仪器设备和试剂，因此成本较高。

一、MTT是什么MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。

是一种黄颜色的染料。

（可参考Sigma，货号M5655，Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide）二、MTT法用来做什么简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。

MTT主要有两个用途1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；2．细胞增殖及细胞活性测定。

三、为何MTT可以用来做上述工作检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。

四、实验所需材料1．MTT 溶液的配制通常MTT配成的终浓度为5mg/ml，须用PBS或生理盐水做溶剂。

市面上一般MTT的包装为100mg，250mg或1g。

1.1 对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。

具休做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。

可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。

将MTT完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。