SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1

蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验目的1.掌握垂直电泳槽的基本操作过程。

2.熟悉SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。

实验原理SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以根据蛋白质分子所带电荷的差异和分子大小的不同产生的不同迁移率，从而将蛋白分离成若干条带。

在催化剂过硫酸铵（APS）和N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED）的作用下，丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N′-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）聚合交联形成具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。

SDS是一种阴离子表面活性剂，能与蛋白分子结合形成复合物，使蛋白所带的负电荷远远超过其原有的电荷，从而掩盖了各种蛋白分子间原本的电荷差异。

因此，电泳时的迁移率不再受蛋白原有电荷和分子形状的影响。

实验器材垂直电泳槽、电泳仪、移液器、移液器吸头、烧杯等。

实验试剂30%（29∶1）Arc-Bis溶液、分离胶缓冲液（pH8.8）、浓缩胶缓冲液（pH6.8）、TEMED、10%APS、5×蛋白电泳缓冲液、10×蛋白上样缓冲液、蛋白标准液、考马斯亮蓝R-250染色液、考马斯亮蓝脱色液等。

实验操作（1）配制SDS聚丙烯酰胺凝胶：将制胶的凹型玻璃与平玻璃固定在制胶夹板上，确保不漏水后按以下配方配制12%的分离胶。

30%（29∶1）Arc-Bis溶液3ml分离胶缓冲液（pH8.8） 1.95mlH2O 2.55ml10%APS 75μlTEMED 30μl（2）混匀分离胶后，尽快灌至两块玻璃板的间隙中，在距离较短玻璃板2～3cm处停止灌胶，同时加入1～2ml的去离子水覆盖凝胶，室温静置10～20min。

（3）分离胶聚合后倒去水层，用滤纸把剩余水分吸干，按以下配方配制4%的浓缩胶。

30%（29∶1）Arc-Bis溶液650μl浓缩胶缓冲液（pH6.8） 1.3mlH2O 3ml10%APS 50μlTEMED 18μl（4）混匀后将浓缩胶灌注至已聚合的分离胶上，当灌注至与较短玻璃板顶端相齐时，立即插入梳子，同时避免产生气泡。

7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。
8、转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。
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把膜置于第二抗体中，温和振荡2小时
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在TBST中洗膜1小时，中间更换4次
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显影，定影这一步骤为最重要的步骤之一，非常容易出现问题，必须小心仔细，我们在实验中采用的是上海康成公司生产的第二代化学超敏发光试剂盒，说明书另附PDF。在实验中发现有时发光很快减弱；肉眼可以看到发光，但是底片显不出来等问题。联系了康成公司的技术员，改动如下：膜与发光显色剂接触时间改为2分钟（不是说明书中的5min），底片压片时间2分钟。显影时有一些基本的原则，如严格的避光，压片前注意排除气泡，压片过程中底片不能接触液体等，按照一定的规则放置膜。将底片压片曝光结束后，将其中一角折起以助定位。定影后将膜贴于显出的条带，条带旁表明marker条带。底片注明实验日期、名称。
（2）分类
western显色的方法主要有以下几种：
i.放射自显影
ii.底物化学发光ECL
iii.底物荧光ECF
iv.底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
2.针对样品的常见问题
B.做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot（以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cruz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定方案步骤：（1)先把垂直平板电泳槽和两块玻璃板洗净，晾干，两边用夹子夹住，装好。

（2)琼脂的加入将1.5%的琼脂融化，趁热用吸管吸取热的1.5%琼脂沿电泳槽的两边条内测加入电泳槽的底槽中，封住缝隙，待琼脂凝固。

（3)分离胶的灌注将加入TEMED后制成的分离胶立即混合均匀，然后用滴管吸取分离胶，浇灌到电泳槽的量玻璃板之间，留出梳齿的齿高加上1—1.5cm的距离，高度大约达电泳槽高度的2/3左右，再用滴管小心地在其上面覆盖一层重蒸水，将电泳槽垂直静止于室温下约30—60min,待分离胶聚合完全后，用滤纸尽可能的吸去上面的水，尽可能的干净。

（4)浓缩胶的灌注将加入TEMED后制成的浓缩胶在试管中立即混合均匀，灌注在分离胶上，小心的插入梳尺，避免气泡，带浓缩胶凝聚完全后，将梳齿小心拔出，用电泳缓冲液立即冲洗孔格数次，待孔格凝固完全。

（5)用微量注射器按号向凝胶梳孔内加样,上面加20%甘油1滴，溴酚蓝指示剂1滴，再用滴管小心加入少量电极缓冲液，使充满梳孔。

（6)电泳将电极缓冲液分别接入上下电泳槽，接上电泳仪，上电极接负级，下电极接正极。

打开电泳仪开关，调节电压至300V，电流至20—30mA，并保持电流强度恒定。

待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距离凝胶下端约1cm时，停止电泳。

（7）染色和脱色小心将胶取出，置于一大培养皿中，在溴酚蓝条带的中心插一细钢丝作为标志。

加染色液染色1h，倾出染色液，加入脱色液，数小时更换一次脱色液，直至背景清晰。

（8）相对分子质量的计算用直尺分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带中心以及钢丝距分离胶顶端的距离，按下式计算相对迁移率：样品迁移率距离（cm）相对迁移率=----------------------染色迁移距离（cm）以标准蛋白质Mr的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线。

根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子质量。

并记录实验数据。

聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）一、目的要求（1）学习电泳原理和技术（2）学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质技术二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。

聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。

具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。

血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成12～25个组分。

因此适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。

聚丙烯酰胺凝胶作为电泳材料的特性人工合成聚丙烯酰胺凝胶的化学体系的组成及功能：Acr：丙烯酰胺Bis：甲叉双丙烯酰胺AP：过硫酸铵——化学催化剂TEMED：四甲基乙二胺——加速剂SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。

在含有强还原剂的SDS溶液中可形成SDS-蛋白质复合物。

由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。

从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。

三、实验材料（一）试剂1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis 为29:1）称取丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1.0g，用去离子水溶解并稀释至100ml，贮棕色瓶中于4℃保存，可用一个月。

2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液取1mol/L HCL溶液48ml、三羟甲基甲烷（Tris）36.6g，加双蒸馏水至80ml使其溶解，调pH至8.8，然后用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。

3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液取1mol/L HCL溶液48ml，Tris5.98g，加双蒸馏水至80ml，调pH6.8，用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。

4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液称取Tris 6g、甘氨酸28.8g，加蒸馏水850ml，调pH至8.3，加蒸馏水到1000ml，4℃贮存。