构建真核表达载体实现恶性疟原虫膜_省略_fs25在CHO细胞中的重组表达_陈勇

药物生物技术Pharmaceutical Biotechnology2013，20（1）：012 016·研究论文·构建真核表达载体实现恶性疟原虫膜蛋白ｐｆｓ２５在ＣＨＯ细胞中的重组表达陈勇，陆俭，李刚，雷清，蒋琳*（国药集团兰州生物制品研究所有限责任公司，甘肃兰州730046）摘要构建一种可实现外源基因高效的、适用于中华仓鼠卵巢细胞（CHO）细胞的质粒表达系统，并成功实现了恶性疟原虫膜蛋白pfs25基因在CHO细胞中的表达。

新构建的真核表达载体是在pBudCE4.1质粒载体上改造获得的，被命名为pCMV-WD，包含了人工合成的、完整的弱化SV40启动子与二氢叶酸还原酶（DHFR）基因组成的顺式表达元件和全新设计的多克隆位点，该载体属于CHO细胞通用载体，理论上可以实现任何外源基因在CHO细胞中的表达。

基于该载体，采用定向克隆策略插入了恶性疟原虫膜蛋白pfs25基因，构建的重组表达质粒为pfs25/pCMV-WD。

经zeocin抗生素和撤除H、T（次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷）双筛选，获得了DHFR+基因阳性的细胞克隆。

对表达量最高的克隆株进行亚克隆，并经MTX加压筛选以获得高表达pfs25蛋白的CHO细胞株。

ELISA和Western Blot结果表明，重组pfs25蛋白具有良好的免疫学反应性，且表达量为0.1mg/mL。

该研究首次获得了可分泌重组pfs25蛋白的CHO细胞株。

关键词真核表达载体；CHO细胞；二氢叶酸还原酶；弱化SV40启动子；pfs25中图分类号Q812文献标志码A文章编号1005-8915（2013）01-012-05随着DNA重组技术的日臻完善和普及化，国内外已经在中华仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary Cells，CHO）中表达了多种外源基因，但是，有工业生产价值的蛋白质并不多。

与大肠杆菌相比，CHO细胞具有获得高表达细胞株所需的时间长、细胞大规模培养的成本高等缺点，其中最重要的缺点是目的蛋白质在CHO细胞的表达量不高［1］。

此外，鉴于生物活性蛋白质用作药物时，巨大的商业价值，很多用于产生重组表达药用蛋白的真核表达系统和方法为国外大公司拥有，在生产实践领域均存在技术专利屏障。

所以，构建具备自主知识产权的真核表达系统，对于制药企业实现药用蛋白质的工业化生产具有明显的基础性技术支撑作用。

本文以商业化的真核表达质粒pBudCE4.1作为母本载体，利用基因重组技术对其进行了大量的改造。

首先，参考已有的研究，创新性地设计了弱化的SV40启动子与二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）基因构成的完整的外源基因顺式表达元件，并将该表达元件替换了母本载体中肽链延长因子基因启动子（EF-1α）及其多克隆位点。

其次，根据替换后的载体序列全新设计了新的多克隆位点序列，替代了母本载体巨细胞病毒早期启动子（CMV）下游的多克隆位点，从而形成了一种全新的基于CHO细胞的通用载体pCMV-WD。

疟疾是疟原虫引起的、严重危害人类健康的虫媒性传染病。

2008年全球有2.43亿临床病例，其中86.3万人因恶性疟疾死亡［2］。

在利用疫苗预防疟疾传播的策略中，传播阻断性恶性疟疾疫苗是当前研究的热点。

其中，子孢子囊表面膜蛋白pfs25是传播阻断型疟疾疫苗公认的侯选靶抗原。

美国NIH已经以pfs25蛋白质作为抗原制备的疫苗完成Ⅰ期临床试验［3］。

由于pfs25蛋白是结构复杂的糖蛋白质，已有的研究中多是通过酵母表达系统获得。

相对于酵母细胞，CHO细胞在蛋白质翻译后修饰，尤其是糖基化方面更接近天然状态，而相关的研究并未见报道。

本研究利用新构建的真核表达载体pCMV-WD成功克隆并在CHO 细胞中实现了pfs25基因的表达，该研究为以后研制基于pfs25蛋白质的恶性疟疾疫苗奠定了基础。

1材料和方法1.1材料真核表达质粒pBudCE4.1、Zeocin抗生素均购自Invitrogen公司；限制性核酸内切酶Xho I、Xba I、EcoR V、Pst I、BamH I、Nhe I、BstB I和pMD18-T Simple Vecter、T4DNA21*收稿日期：2012-10-01修回日期：2012-11-24作者简介：陈勇（1972-），男，副研究员，主要从事基因工程疫苗及分子生物学研究工作。

*通讯作者：蒋琳（1962-），女，研究员，主要从事分子生物学及疫苗研发，E-mail：Jianglin620@sohu．com陈勇等：构建真核表达载体实现恶性疟原虫膜蛋白pfs25在CHO细胞中的重组表达连接酶、1kb DNA marker、DL2000DNA marker均购自TaKaRa公司；Taqplus DNA聚合酶购自上海生工公司；质粒小量提取试剂盒购自北京道普生物公司；PCR产物纯化试剂盒和胶回收试剂盒购自QIAGEN公司；标准蛋白质分子质量购自GE公司。

抗pfs25单克隆抗体4B7和pfs25标准蛋白由美国MR4惠赠；HRP标记兔抗鼠IgG购自Sigma公司；二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞（CHO-DHFR－）购自ATCC（编号：CRL-9096）。

大肠杆菌Top10'由本室保存。

1.2方法1.2.1目的基因和引物合成根据参考文献对SV40启动子进行了弱化处理：将天然SV40启动子中所包含的两个重复的72bp的增强子序列，即：GGTGTGGAAAGTCCCCAG-GCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAA TTAGTCAGCAACCA，作者删除了第一个增强子序列。

同时，把第二个增强子序列中第5 7位的序列TGG突变为GTT［4］。

从ATCC购买pSV2-dhfr载体（编号：67110）查询其中的DHFR基因信息，连同若干碱基序列作为连接部分设计为弱化的SV40启动子与二氢叶酸还原酶（DHFR）基因表达元件。

该元件大小为973bp，上下游分别引入了BstB I和Nhe I的识别序列，委托上海生工生物工程有限公司合成，该元件被克隆到pUC57载体上，命名为DHFR/pUC57。

在先前的工作中，作者根据GenBank中公布的pfs25基因信息（GenBank locus：X07802），选取完整pfs25蛋白第23位至第193位氨基酸对应的DNA序列作为目的基因。

本研究中，利用引物合成软件Primer premier5.0设计引物，pfs25上游引物：GCAAgatatcACACCATG ggtgttaaggttcttttcgct cttatctgtatcgct gttgctgaggct AAAGTAACAGTCGATACTGTGTG-TAAGAGAGGC TTCCT（下划线为EcoR V酶切位点，斜体字序列对应信号肽：GVKVLFALICIAVAEA）；pfs25下游引物：TGATctcgagTTAAGTACATATTGATGA（下划线为Xho I酶切位点）。

目的基因及引物均委托上海生工生物工程有限公司合成。

PCR条件：95ħ、4min；95ħ、45s，55ħ、45s，72ħ、60s，30个循环；72ħ、7min。

1.2.2真核表达载体pCMV-WD的构建1.2.2.1在pBudCE4.1质粒中引入弱化的SV40启动子与二氢叶酸还原酶（DHFR）基因表达元件用限制性核酸限制性内切酶Nhe I和BstB I分别作用DHFR/pUC57质粒和pBudCE4.1质粒，分别得到：人工合成的弱化的SV40启动子与二氢叶酸还原酶（DHFR）基因表达元件、肽链延长因子基因启动子（EF-1αpromoter，P EF-1α）。

用前者替代后者克隆到母本pBudCE4.1质粒中，该质粒被命名为WD/ pBudCE4.1。

1.2.2.2在pBudCE4.1质粒中引入新的多克隆位点根据WD/pBudCE4.1的序列，设计新的多克隆位点（multiple cloning site，MCS），序列为：GATATCGCGGCCGCTCGAG-GTCGACGGATCC，对应的DNA限制性核酸内切酶依次是：EcoR V，Not I，Xho I，Sal I，BamH I。

选择一段330bp的DNA序列作为“工作DNA序列”，该序列不被新设计的多克隆位点中的DNA限制性内切酶识别。

根据“工作DNA序列”设计PCR引物，上游引物：CTGCA GATATCGCGGCCGCTCGAGGTCGACGGATCC TCCCT-GTCTG CCTCTCTGGGAG，其中，加边框部分为Pst I识别位点，斜体部分为新设计的MCS，下划线部分为“工作DNA序列”的5'端序列。

下游序列：TCTAGA ACGTTTGATTTC-CAG，其中，加边框部分为Xba I识别位点，其余部分为“工作DNA序列”的3'端序列。

PCR时，以“工作序列”作为模板，条件同1.2.1所述。

用Pst I和Xba I将包含了新设计的MCS的“工作DNA序列”克隆到母本载体中后，用BamH I酶切重组质粒，用T4DNA连接酶连接后，即可将WD/ pBudCE4.1质粒中巨细胞病毒早期启动子（CMV promoter，PCMV）下游的序列替换为新设计的MCS，新构建的载体命名为pCMV-WD。

1.2.3重组pfs25/pCMV-WD表达质粒的构建及鉴定pfs25基因的PCR产物直接克隆到pMD18-T Simple Vecter 中，经酶切和测序，对阳性克隆pfs25/pMD18-T用EcoR V、Xho I双酶切纯化后，与经同样酶切的质粒pCMV-WD连接，所构建质粒为pfs25/pCMV-WD，转化E.coli TOP10'，PCR、酶切鉴定阳性克隆。

1.2.4重组pfs25/pCMV-WD质粒转染CHO接种CHO-DHFR－细胞于40cm2培养瓶中，使用DMEM培养液，补加10%新生小牛血清，0.1mmol/L次黄嘌呤（H），0.016mmol/L 胸腺嘧啶脱氧核苷（T），5%CO2、37ħ培养。

采用电转染法将重组质粒pfs25/pCMV-WD转染CHO-DHFR-细胞，电转染条件：电容—75μF，电压—210V。

之后，2次电击，1min 间隔，电击前后及间隔时间内细胞处于冰浴环境中。

电转后，细胞加入DMEM培养液（10%FCS）培养于96孔板中。

3d后换液，并添加Zeocin至终浓度500μg/mL。

克隆形成后Zeocin降低至250μg/mL，双抗体夹心ELISA检测所有克隆。

挑选阳性细胞继续培养于混合培养液（10%FCS和200nmol/L MTX）。

克隆形成后ELISA检测，挑出分泌pfs25蛋白的高表达阳性株。