提高农杆菌基因转化率方法的研究_刘艳军

从表 1 可以看出用农杆菌原液处理番茄子叶外 植体所获得的再生芽和稀释 10 倍液的处理相同 ;两 者均明显高于农杆菌稀释 20 倍液的处理 。 由此可以
看出 , 通过稀释农杆菌侵染外植体的方法无法有效的
提高基因转化率 , 而且还费时 、易使培养的材料污染 。
所以应采用农杆菌原液侵染外植体 。 2 .2 乙酰丁香酮处理农杆菌对番茄基因转化率的影
第 25 卷第 2 期 2003 年 4 月
西 南 农 业 大 学 学 报 Journal of Southwest Agricultural University
Vol .25, No .2 Apr.2003
文章编号 :1000 -2642(2003)02-0144 -03
提高农杆菌基因转化率方法的研究①
1 材料和方法
1 .1 材料 本研究中所用农杆菌菌株为 LBA 4404, 表达载体
为 pBI 121 , 并与所要转化的 NR 基因构建的 pBI —NR (见图 1)。所用植物材料为丽春番茄 。以上材料均为 中国农业大学食品学院采后生物技术实验室提供 。
① 收稿日期:2002 -11 -01 基金项目:国家杰出青年基因资助项目(39825118), 天津市教委资助项目(2001) 作者简介:刘艳军(1973 -), 男 , 天津人 , 天津农学院实验师 , 硕士研究生 , 从事生物技术研究 。
激素浓度/ mg·L -1 图 4 生长素处理对番茄基因转化率的影响
□ 芽分化块数 ◆ 芽分化率
图 4 显示 1 mg/ L IAA 预处理的效果较好 , 平均 转化率达 11 %, 最高 的达 27 %, 高于对 照 。 总 体上 看 , 激素处理的效果不太稳定 , 同一浓度的处理 、转化 率变化较大 。 这可能与诱导的其他条件有关 , 还需 进一步验证 。但总的来说生长素的使用有利于转化 率的提高 , 尤其对于转化率较低的植物材料 , 这一方 法的使用能收到较好的效果 。 2 .6 预培养对番茄转化率的影响
AN INVESTIGATION OF THE APPROACHES TO ENHANCE GENE TRANSFORMATION RATE WITH AGROBACTERIUM
LIU Yan -jun, YANG Jing-hui , YANG En -qin , LIU Yu -dong, LIU Shu -wu (Horticulture Department , Tianjin Agricultural College , Tianjin 300384, China)
在利用农杆菌进行转基因研究中遇到的主要问 题是如何提高转化率 。影响转化率的因素主要有转 化所用的农杆菌的株型[ 1 ～ 2] 、Ti 质粒的构建[ 3～ 8] 、外 植体的再生率[ 1] 、筛选标记的可靠性[ 9] , 以及转化过 程中外部环境的控制 。其中前几个因素在转化研究
确立后很难有大的调整和改变 , 而转化的外部环境可
表 3 预培养对番茄转化率的影响
预培养天数
0(直接侵染)
2
接种块数
225
375
愈伤组织块数
83
43
愈伤组织块数/ %
37
11
抗性芽块数
35
22
抗性芽块数/ %
16
6
从表 3 中可以看出不经过预培养的叶片形成抗 性愈伤 组 织的 百 分率 37 %, 抗性 芽 块数 百 分率 为 16 %, 高于经过预培养 2 d 的愈伤组织百分率 11 %, 和抗性芽块数百分率 6 %。这些说 明番茄子叶不经 过预培养比经过预培养的转化效果好 , 因此认为经过 预培养不利于遗传转化 , 这可能是由于预培养会使伤 口细胞(受伤细胞)的数量减少 , 从而降低了转化细胞 的数量即降低了转化率 。 但在利用生活力较弱的外
图 3 显示 , 用马铃薯浸提液处理的效果较好 , 其
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西 南 农 业 大 平 均转化率可达 9 %, 显著 高于对照(0 .05 水平下显著), 最高的转化率达 19 %。
浸提液稀释倍数 图 3 马铃薯植株浸提液处理对番茄基因转化率的影响
Abstract :In the experiment methods to increase transformation rate of genes in tomato were tried by adjusting Agrobacterium consistence and pre -culture time and treating Agrobacterium and explants by acetosyringone , plant hormones and extractive sap from plants.The results showed that transformation rate was enhanced when the explants were soaked in Agrobacterium , which had been cultured overnight , or in its 10-fold diluent or when Agrobacterium and the explants were immersed in the extractive sap from the tomato plants and IAA (1 mg/ L).Acetosyringone and extractive sap from the tomato plants had no significant effect on transformation rate .Potato cotyledons without preculture , as explants, showed a higher transformation rate than non -pre -culture coty ledons . Key words:gene transformation ;Agrobacterium ;extractive sap from plant ;hormone
刘艳军 , 杨静慧 , 杨恩芹 , 刘玉冬 , 柳树梧
(天津农学院 园艺系 , 天津 300384)
摘要 :通过番茄转化过程中农杆菌侵染浓度 、预 培养时间 、乙 酰丁香 酮 、植 物激素 和植物 组织浸 提液对 农杆菌 和外植 体的处理 , 研究了提高番茄基因转化率的方法 。 试验结果 为 :用过 夜培养的农 杆菌和稀 释 10 倍的农杆 菌侵染 外植体 以及 用 1 倍马铃薯伤流液和 1 mg/ L 低浓度的植物生长素处理外植体和农杆菌可以明显地提高番茄的 转化率 ;乙酰丁 香酮和番茄组织浸提液对转化率无显著影响 ;番 茄子叶不经过预培养比预培养的转化率高 。 关 键 词 :基因转化 ;农杆菌 ;伤流液 ;激素 中图分类号 :S 641 .201 文 献标识码 :A
第 25 卷第 2 期 刘艳军等 提高农杆菌基因转化率方法的研究
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1 .2 方法 1 .2 .1 农杆菌侵染时有效浓度的筛选 将用于转化 的农杆菌单菌落接种到含抗性标记的 YEB 液体培养 基中 , 28 ℃于摇床上过夜培养 , 待其 OD 值为 0 .6 时 , 分别以其稀释 0 倍 , 10 倍 , 20 倍液处理侵染番茄子叶 外植体 。将处理后的外植体分别放在含有卡那霉素 的分化培养基上进行转化芽的筛选 。每处理约 20 片 外植体 , 10 次重复 。
□ 芽分化块数 ◆ 芽分化率
2 .5 生长素处理对番茄基因转化率的影响
植体作为转化材料时 , 预培养可以降低外植体的死亡 率 , 这样可以抵偿预培养造成的转化率下降 。 2 .7 DNA 检测
通过卡那霉素筛选的转化植株 , 均生长到开花前 进行 DNA 分子杂交 。 本文仅显示 4 株的杂交结果 。 CK1 为阳性对照(35 S 启动子 DNA), CK2 为阴性对照 (未转化番茄植株基因组 DNA), NR1 , NR2 , NR3 , NR4 为经过卡那 霉素筛 选得 到的转 化植株 基因组 DNA (见图 5)。图中表明 , 阳性对照 35 S 启动子的 DNA 杂交带明显 , 阴性对照 ———未转化 番茄植株的 DNA 无杂交带 , 而转化植株中 NR1 和 NR2 号有杂交带的 出现 , 转化株 3 有少量杂交带 , 4 号株无杂交带出现 。 所以 , 1 , 2 号株是转基因植株 。
响
表 2 乙酰丁香酮处理农杆菌对番茄基因转化率的影响
编 号
乙酰丁香酮浓度 /(μ·mol -1)
处理块数
芽分化 块 数 分化率/ %
CK
0
1
10
2
20
3
30
85
4
5
87
1
1＊
270
11
4
101
3
3
从表 2 中可以看出乙酰丁香酮的使用与对照相 比转化率均有所下降 , 说明它的使用对于提高丽春番
以按照操作者根据实际情况和主观需要作出较大调
整 。 这些调整在提高转化率上往往收效显著 , 其中有 报道的主要有改变农杆菌侵染的浓度[ 1] 、预培养的时 间[ 10] 、用化学试剂对农 杆菌[ 11] 和外 植体[ 12 ～ 13] 进行
处理等 。本研究旨在通过在番茄转化过程中这些外 部环境的改变 , 找出提高转化率的有效方法和措施 , 从而建立一套标准的转化体系 。
图 1 pBI -N R 载体
1 .2 .2 乙酰丁香酮预处理农杆菌 取乙酰丁香酮母 液加入农杆菌菌液中 , 使其终浓度分别为 10 , 20 , 30 μ mol/ L , 再用处理后的菌液处理番茄外植体 , 并在筛选 培养基上诱导转化芽的再生 , 同时以不用乙酰丁香酮 处理的一组为对照 , 比较它们在转化率上的不同 。 每 处理约 20 片外植体 , 10 次重复 。 1 .2 .3 番茄植株浸提液预处理 取番茄幼嫩组织浸 提液经抽滤灭菌后分别稀释 1 , 2 , 5 倍 , 与培养过夜的 农杆菌一起侵染番茄子叶外植体 , 同时以不加伤流液 的处理为对照 , 放在抗性培养基上诱导再生芽 , 并比 较它们之间的转化率 。 每处理约 20 片外植体 , 10 次 重复 。 1 .2 .4 马铃薯浸提液预处理(方法同上) 1 .2 .5 生长素预处理 用不同浓度的 IAA , IBA 分别 与农杆菌一起侵染番茄子叶外植体 , 比较其与对照之 间在转化率上的不同 。 每处理约 20 片外植体 , 10 次 重复 。 1 .2 .6 预培养 在对番茄子 叶外植体进行 转化之 前 , 先将叶片放在不含卡那霉素的分化培养 基上于 黑暗处预培养 48 h 。 另作不处理的为对照 , 比较它们 之间在转化率上的差异 。 每处理约 20 片外植体 , 10 次重复 。 1 .2 .7 DNA 分子杂交 以单链的 35 S 启动子 DNA 片段为模板 , 按 Promega 公司的 Primw -a -Gene Labelling System Kit 说明 , 采用随机引物标记法 , 用 α-3P2 标记探针 。 提取由卡那霉素筛选得到的番茄转化植 株及 对照 植 株 (未 转 化 番 茄 植 株)叶 的 基 因 组 总 DNA , 在点样仪中点样 , 然后与探针杂交[ 14] 。