中国畜牧兽医!!"#$!%%"&#$'K (!'''!"#$%&$#'%()*+,%$-./01232.#$%./42-#5#$2"#$$%&'%()*%%+',-.$'%(/%!/0*('0&%/'&*'&&(宏基因组技术在鸡肠道微生物中应用的研究进展杨天龙% 刘旭川0 廖!奇% 王淑玲% 张春勇% 0 葛长荣%" 冷!静%0""%'云南省动物营养与饲料科学重点实验室!昆明(2&0&%&0'云南农业大学动物科学技术学院!昆明(2&0&%#摘!要 鸡肠道中生存着丰富的微生物!这些微生物在宿主的营养代谢与免疫方面有重要作用'高通量测序技术的发展为肠道微生物的研究提供了新的思路!文章简要介绍了宏基因组学!阐述肠道微生物结构变化对宿主的影响及不同饲养条件(宿主生理特征改变对肠道微生的影响!并重点从宏基因组的层面透析鸡肠道微生物菌落结构(营养代谢特征(免疫功能与鸡的健康生长之间的关联性!以期为鸡肠道微生物的研究提供思路'关键词 鸡&肠道微生物&宏基因组&营养代谢&免疫功能中图分类号 >?*%文献标识码 5文章编号 %(/%!/0*("0&%/#&*!&(2B !&?收稿日期 0&%(!&B !&%基金项目 国家自然科学基金项目"*%(/0)20#&云南省自然科学基金重点项目"0&%)O 5&**#&云南省中青年学术和技术带头人后备人才项目"0&%%Q 8&02#作者简介 杨天龙"%B B *!#!男!贵州天柱人!硕士生!研究方向$动物肠道微生态!C !:9$D $%*???/B )2!Y Y ',#:"通信作者 葛长荣"%B (0!#!男!云南昆明人!教授!研究方向$家禽遗传育种!C !:9$D $I,U [9D !%0(',#:冷!静"%B /0!#!女!云南红河人!教授!研究方向$动物肠道微生态!C !:9$D $J 7-U F $!%B B /!V #G F ',#:,99.1)=A 1/0,>Y =0)64/<P 6A =260/@636)E 0/./2B 10Z 0A 64A 10=.P 1)://:2=014@4/<-E 1)N 60L 546T $9-!D #-I %!J K N _F !,G F 9-0!J K 5`f $%!d 546>G F !D $-I %!P Q 546=G F -!E #-I %!!6C=G 9-I !U #-I %"!J C 46c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鸡肠道寄生着复杂的微生物菌群!这些微生物在宿主的营养代谢(生理和免疫过程中起着重要的作用'长期以来!对鸡肠道微生物群落的研究大多采用纯培养技术*%+!由于培养条件的不确定性!导致大量微生物不能正常生长*0+'目前研究发现!在鸡的盲肠中!仅有0&b &(&b 的微生物是可培养的**+!存在大量未培养的微生物菌群!这些微生物与宿主之间有什么关联!传统纯培养的方法已不能全面解答'宏基因组技术是基于新一代测序技术的研究方法!能从群体水平上研究肠道微生物的菌落(功能基因的多样性特征!透析微生物与宿主之间的潜在关系!这是传统分子生物学技术所欠缺的'目前!Copyright ©博看网. All Rights Reserved.中!国!畜!牧!兽!医))卷!宏基因组技术在土壤*)+(海洋*2+(人体*(+(昆虫*/+及微生物研究领域得到了广泛的应用!但在鸡肠道微生物的研究领域应用较少!因此!作者主要就宏基因组技术在鸡肠道微生物的研究展开论述'#!宏基因组学宏基因组学研究是针对生境中微生物群落中所有345的分析'一般来说!宏基因组学研究主要分成两个层面$+分析环境中特定基因!即通过构建宏基因组文库!基于序列筛选或基于功能筛选分析某种功能基因!并进一步对筛选到的基因进行深度测序&,针对环境中所有345进行深度测序!分析该生境中微生物的组成与相关功能'在鸡肠道微生物研究中!宏基因组学一般的研究策略如下$首先!从鸡肠道微生物中提取总345!对达到测序要求的总345样品上机测序!获得序列信息!构建宏基因组文库'根据不同目的采取不同途径分析序列数据'其中!菌落多样性分析源于%(>U345基因和功能基因集层次!其序列长度较短&而功能基因的分析通常源于拼接后的=#-H$I( >,9R R#D"及非冗余基因集层次!序列较长'在基因集的基础上进行菌落特征"分类操作单元"#A7U9! H$#-9D H9X#-#:$,F-$H!`T N#(主成分分析"A U$-,$! A9D,#:A#-7-H9-9D E V$V!<=5#等#与功能"直系同源簇",D F V H7U#R#U H G#D#I#F V I U#F A!=`6#(京都百科全书".E#H#7-,E,D#A7"$9#R I7-7V9-"I7-#:7V! S C66#(基因本体"I7-7#-H#D#I E!6`#注释等#的分析'!!鸡肠道微生物!I#!肠道微生物的形成与发育在胚胎时期!鸡肠道几乎不含微生物!出雏%G 后!粪链球菌和大肠杆菌首先在雏鸡盲肠定植!在随后*"内遍布整个肠道*+'采食)G后!乳酸菌在嗉囊和盲肠定植!0)G内乳酸菌就能遍布十二指肠(回肠和盲肠!此时在日粮中添加适量益生菌!可减少病原菌的定植!还可促进小肠绒毛的发育*B+'出雏*"后!链球菌(乳酸菌(大肠杆菌和肠球菌等就可遍布整个肠道!肠道微生物群体初步涌现'随着日龄增加!肠道中的微生物结构会发生很大变化!大量微生物出现在鸡肠道!但很多只是暂时性的!会随着肠道发育而消失*%&+'雏鸡十二指肠和小肠在0周内即可建立稳定的微生物区系!粪链球菌和大肠杆菌类为主要微生物!之后随着日龄增长!乳杆菌逐渐成为优势菌'而盲肠微生物发育滞后于小肠!需2&/周才能建立稳定的微生物区系!主要为粪链球菌(梭菌属(肠杆菌等*%%+'鸡微生物区系会随着日龄的增长发生变化!如小肠链球菌和肠球菌数量随着日龄的增加而下降!在)&"后趋于稳定!此时在小肠中主要微生物是乳酸菌"/&'&b#!其余依次为梭菌"%%'&b#(链球菌"('2b#和肠球菌"('2b#'而盲肠微生物与小肠差别很大!梭菌最多"(2'&b#!其余依次为梭杆菌"%)'&b#(乳杆菌"?'&b#和拟杆菌"2'&b#*%0+'随着鸡肠道的成熟!肠道微生物从单一结构逐渐形成一个复杂的体系!对鸡的营养(代谢(免疫都起到非常重要的作用'!I!!肠道微生物平衡的影响因素0'0'%!日粮对肠道菌群的影响!!影响肠道微生物的因素多种多样!其中日粮是对微生物结构影响最大的因素'此外!短链脂肪酸等代谢产物也受到日粮配方的影响*+'在日粮中加入抗生素是中国较常见的预防和抗病手段!虽然效果较显著!但药物残留和耐药性的增加给人类健康和食品安全带来很大隐患*%*+'因此!在一些发达国家!抗生素禁止在日粮中使用'M9等*%)+收集人(猪(鸡的粪便!分别提取其345!利用K D D F:$-9测序构建基因组文库!分析研究中发现较高浓度的抗生素耐药基因"9-H$@$! #H$,U7V$V H9-,7I7-7V!5;6#并构建了一个5;6标注通路!研究5;6相关基因和5;6宿主的关系!有助于评价5;6的环境风险'目前抗菌肽因其杀菌迅速(稳定性高(抗药性低等特点受到广大关注!是替代抗生素的潜在药物!但却存在成本高产量低的制约!有待进一步研究改善*%2+'益生菌与病原菌对肠道微生物结构的影响也非常大!益生菌能稳定和优化菌群结构!抑制病原菌生长*%(+'此外!益生元的添加能促进益生菌繁殖!对鸡健康也有益*%/+'枯草芽孢杆菌可减小应激反应!抑制产气荚膜梭菌繁殖!同时可产生协助宿主代谢的酶*%?+'齐博等*%B+在仔鸡日粮中添加枯草芽孢杆菌与硫酸黏杆菌素!发现能显著提高)0日龄仔鸡体重'研究结果表明!日粮中添加丁酸梭菌能显著降低肉仔鸡盲肠的大肠杆菌(沙门氏菌(产气荚膜梭菌的数量!同时显著增加乳杆菌和双歧杆菌数量*%?+'乳酸菌能产生有机酸降低肠道A Q!同时能产生抗菌素和酒精抑制病原菌的繁殖'Q F:7等*%(+和王沂蒙等*0&+将益生菌和感染艾美耳球菌的精油加入到肉仔鸡!发现艾美耳球菌能导致黏膜受损!影响性能!而饲喂益生菌的肉鸡受到的影响大大减小'在&((Copyright©博看网. All Rights Reserved.!*期杨天龙等$宏基因组技术在鸡肠道微生物中应用的研究进展肠道益生菌体外选育时!可把益生菌接种到培养的肠道细胞上!研究益生菌与其他菌的相互作用*0%+' 0'0'0!其他因素!不同鸡种与日龄的肠道微生物结构往往相差很大'K D$-9等*00+提取不同颜色的Q9+V7.V鸡种345进行分析!发现鸡的肠道微生物结构有很大差异'基于%(>U;45对不同日龄肉鸡的盲肠微生物结构进行分析发现!鸡刚出生时肠道基本无微生物!之后几周肠道内微生物变化较大!在)&"后逐渐趋于稳定*%&+'肠道微生物的组成甚至会随宿主基因型改变而改变'P G9#等*0*+在2(日龄体重相差%&倍的鸡双向选择家系中选择(&只!对其肠道微生物进行高通量测序!检测到%B&个微生物菌种!其中(?个菌种受不同家系和性别影响有明显差异'此外!不同饲养环境也会影响鸡肠道微生物的结构*0)+'&!宏基因组技术在鸡肠道微生物研究中的应用&I#!肠道微生物多样性与哺乳动物相比!鸡肠道较短'有研究发现!食物通过整个肠道的时间不超过*'2G!其中!在盲肠停留的时间较长!为盲肠微生物营造了一个良好的栖息场所!使得盲肠成为人们关注的焦点*02+'在早期的纯培养研究中发现大量细菌!其中链球菌"<3.2B3:5:55##(丙酸杆菌"K.:B#:$#,%532.#*'#(拟杆菌"H%532.:#-2+#(梭菌"!(:+3.#-#*'#是盲肠中的优势菌!在小肠中丰度较大的细菌是乳酸菌"O%53:E ,%5#((##和梭菌!但其丰度远低于盲肠*0+!与87"@F U E 等*0(+研究相同!在鸡肠道微生物中!革兰氏阴性杆菌占//b!远大于革兰氏阳性杆菌"%)b#和革兰氏阴性球菌"B b#'尽管以上研究不能从菌落整体层面阐述肠道微生物结构差异性!但这些成果为后续分子生物学研究提供了重要线索'目前!基于新一代测序平台的宏基因组学为鸡肠道微生物研究提供了新思路!尤其是在盲肠微生物多样性研究方面取得了重大成果*)+'有研究对家鸡和火鸡宏基因组数据分析!共发现%*个门的细菌!其中硬壁菌门"O$U:$,F H7V#(拟杆菌门"89,H7! U#$"7H7V#和蛋白菌门"<U#H7#@9,H7U$9#是优势菌!占总微生物B&b以上!发现B&&个种水平的分类操作单元"`T N V#!包含%%/个属!其中火鸡为(B个!家鸡)?个!梭菌属"!(:+3.#-#*'#(瘤胃球菌属"G*'#E $:5:55*+#(乳酸菌属"O%53:,%5#((*+#和多形杆菌属"H%532.:#-2+#)个属共同存在于两种鸡中!但丰度差异较大!差异分析发现菌落相似性仅为%(b*0(+'由于火鸡和家鸡在品种上存在较大差异!在其进化过程中!可能会导致肠道微生物菌落结构与组成发生变化'39-[7$V7-等*0/+通过宏基因组研究发现!在鸡日粮中添加莫能霉素!回肠中氏菌属"G:+2E ,*.#%#(乳酸菌属"O%53:,%5#((*+#和肠球菌属"Q$E 32.:5:55*+#数量分别减少%B'%b(*'0b和0'*b!粪球菌属"!:B.:5:55*+#和硫酸盐还原菌属"&$%2.E :;#(*'#分别增加*')b和)'B b!但没有发现埃希氏菌属"Q+5"2.#5"#%5:(##!相反!在同时添加威里霉素或泰乐菌素对照组却出现大量埃希氏菌属"Q+5"E 2.#5"#%5:(##!可能是由于威里霉素或泰乐菌能激活莫能霉素相关的抗性基因所致'>9D9-$H U#等*0+分别对/(%)(0%和)0日龄的鸡肠道微生物宏基因组分析发现!随着年龄的增长!盲肠中的致病微生物梭菌"!(:+3.#-#*'#显著增加!相反!益生菌乳酸菌"O%53:,%5#((*+#的数量显著减少!在同一年龄的鸡盲肠微生物多样性显著大于回肠!年龄越大!5=C 和>G9--#-指数"多样性指数#越大!微生物丰富度与均匀度随着年龄的增长而增大'以上研究表明!不同环境(年龄和品种都会影响鸡肠道微生物菌群结构!若能将微生物与鸡的生长性能进行关联分析!构建微生物与生长性能之间的有效模型!对鸡的饲养管理有重要意义'&I!!营养代谢*'0'%!糖类代谢!!鸡肠道菌群与其宿主在信息传递中起着至关重要的作用!其主要能量物质来自碳水化合物!食物进入肠道后肠道微生物在碳水化合物的代谢中扮演着重要的角色!主要通过糖酵解途径"7:@"7-!:7E7U G#R!A9U-9V A9H G W9E!C M<#(磷酸戊糖途径"G7X#V7:#-#A G#A G9H7A9H G W9E! QM<#和厌氧分解途径"7-H-7U!"#F"#U#R R!C3#将大分子多糖分解成小分子葡萄糖!为宿主的生长发育提供充足的营养物质'盲肠是这些代谢途径的关键部位!盲肠微生物在多糖分解成单糖的过程中有重要的作用*0?+'早期研究发现!碳水化合物酶基因在鸡整个肠道微生物宏基因组中约占0&b*0B+!其中大部分基因在后续的宏转录组(宏蛋白组中被发现是碳水化合物酶活性基因及活性蛋白**&+'>7U I79-H 等**%+对%&只鸡盲肠宏基因组数据分析!共获得2B2%/?个编码序列",#"$-I V7Y F7-,7!=3>#!有%'20b的=3>注释到糖苷水解酶家族"I D E,#V$"7 G E"U#D9V7!6Q#!其中包含0&(个纤维素酶基因( 0%*个半纤维素酶基因和*()/个寡糖降解酶基因! <O5M QMM V分析发现!这些碳水化合物酶活性%((Copyright©博看网. All Rights Reserved.中!国!畜!牧!兽!医))卷!基因主要集中在放线菌"&53#$:,%532.#%#(梭菌"!(:+3.#-#%#和拟杆菌"H%532.:#-#%#'除了可溶性多糖!自然界中存在大量膳食纤维!主要由木质纤维素和非淀粉性多糖组成**%+'肠道微生物通过糖酵解!将膳食纤维在结肠内消化产生短链脂肪酸"V G#U H!,G9$-R9H H E9,$"V!>=O5V#!主要包括乙酸(丙酸(异丁酸(丁酸等!其中乙酸(丙酸和丁酸含量最高!是肠道中主要的短链脂肪酸**&+!近年来!膳食纤维成为了广大科研学者的研究热点'*'0'0!氮代谢!!肠道微生物对宿主的氮代谢也有很大帮助'鸡肠道和泌尿生殖道相连于充满粪尿的泄殖腔!由于直肠的逆向蠕动粪尿会进入盲肠!在盲肠微生物的作用下可分解代谢尿酸生成氨类!可由宿主吸收用来合成一些氨基酸!如谷氨酸**0+'一些食物中氮源可被肠道中的微生物吸收!因此这些肠道微生物本身就可当作蛋白质来源!但大多数微生物蛋白都被浪费掉了!因为他们几乎都来自盲肠!而盲肠没有直接吸收蛋白质的能力**0+'f F等*0B+通过功能注释发现有肠道微生物基因参与的蛋白质代谢!其中参与蛋白质代谢的有B b&%&b!有%b参与氮素代谢'Q7等***+在日粮中添加精氨酸!通过代谢组学!分析精氨酸对血清蛋白代谢的影响!结果表明!在日粮中添加精氨酸会使肠道微生物结构发生变化!且体内的脂肪沉积也会降低'8F U U$-等**)+总结得出!0&b蛋氨酸由肠道代谢!主要代谢途径为通过转甲基作用形成同型半胱氨酸和转硫作用形成半胱氨酸!也能生成腺苷甲硫氨酸!可抑制甲基化和促癌基因的表达'T9-I等**&+通过宏蛋白组技术在鸡盲肠微生物中发现*(/*个活性蛋白!其中有*?&个来自乳酸菌属"O%53:,%5#((*+V A A'#!%22个来自梭菌属"!(:+3.#-#*'V A A'#!((个来自链球菌属"<3.2B3:5:55*+V A A'#!在这些蛋白中!发现大量注释到丙酮酸激酶和磷酸甘油酸酯激酶途径'宏基因组在氮代谢中的研究只能从基因功能上来入手!宏蛋白组学和代谢组学分析氮代谢特别是蛋白质代谢!可更直观也更加深入地探索其中的规律'*'0'*!脂类代谢!!肠道菌群可通过多种途径参与脂类及能量代谢!储存和代谢脂肪酸和甘油三酯'甘油三酯的储存(肝脏中脂肪的从头合成等影响机体能量储存!可能会引起肥胖(糖尿病等代谢疾病!且与肠道微生物结构有密切联系**2+'>7U I79-H等**%+对鸡盲肠宏基因组数据分析!发现了*&个编码乙酸激酶和磷酸转移酶"<T5!5=S#的基因!以及一个以=`0为底物生成草酰乙酸的途径"d##"!d7U.:9-#!这些基因主要来自硬壁菌门"O$U:$!,F H7V#(拟杆菌门"89,H7U#$"7H7V#和蛋白菌门"<U#!H7#@9,H7U$9#'宏基因组往往从基因的层次对其功能进行预测!但这些基因是否表达及这些蛋白是否有活性!需在后续宏蛋白组研究中进行验证'f F等*0B+发现在鸡肠道微生物基因组中只有%b&0b的基因参与脂肪酸和脂类的代谢!但却发挥着重要的作用'随着组学技术的兴起!在反刍动物瘤胃微生物**(+(土壤微生物**/+中发现大量与短链脂肪酸">=O5V#"乙酸(丙酸和丁酸#代谢相关的途径及这些途径中的核心酶!如乙酰磷酸转移酶]乙酸激酶"A G#V A G#H U9-V9,7H E D9V7!9,7H#.$-9V7!<T5!5=S#途径(乙酰辅酶5生成酶"9,7H E D,#7-[E:75V E-!H G9V7!5=>#途径(乙酰辅酶5水解酶"9,7H E D,#7-
