4t1 CELL CULTURE

基于MDCK悬浮细胞生产禽流感疫苗的放大工艺开发代为俊;刘旭平;周燕【摘要】为放大流感疫苗生产工艺至1500 L反应器规模,通过冷模实验研究了不同体积反应器条件下的混合时间、流体剪切力、体积氧传递系数和二氧化碳传递系数的区别.在1500 L反应器中进行培养时,转速为60 r/min,深层通气速率控制在22.5 L/min能够较好的满足供氧需求和提高CO2的移除效果,同时也避免了剪切力对细胞的损伤.在1500 L反应器中病毒感染细胞60 h后,病毒滴度为211 HA units/25 μL,单位细胞病毒产量(Svy)为13145.05 virions/cell,2 L反应器的Svy 为13298.70 virions/cell,两者仅相差1.16％.%In order to scale up the flu vaccine production to 1500 L animal cell culture bioreactor, cold form experiment was carried out in 1500 L bioreactor, including mixing time, liquid shear force, volumetric oxygen transfer coefficient and volumetric carbon dioxide transfer coefficient.When cultured in a 1500 L bioreactor, agitation speed and aeration rate was 60 r/min, and 22.5 L/min, respectively, which could meet the oxygen requirement, improve the effect of CO2 remove and reduce the shear force on cells.Virus-infected cells after 60 h in a 1500 L bioreactor, the virus titer was 211 HA units/25 μL, the specific virus yield (Svy) was 13298.70 virions/cell, which is the difference of 1.16％ in 2 L bioreactor.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2017(051)008【总页数】6页(P46-51)【关键词】流感疫苗;MDCK细胞;生物反应器;冷模实验;放大【作者】代为俊;刘旭平;周燕【作者单位】华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237【正文语种】中文【中图分类】S852.5传统的流感疫苗是基于鸡胚工艺生产，然而由于其成本高、产量有限、生产周期长等缺点，已慢慢被淘汰[1]。

BW-Guidelines-Rev-10 Bioware® Brite Cell Culture GuidelinesCaution: For Research Use. This product is intended for animal research only and not for use in humans. Not for human or animaltherapeutic or diagnostic use.Important NotesWe strongly recommend Hyclone Fetal Bovine Serum (GE Healthcare Cat. No. SH300071) •Please thaw only one vial for use to prepare your working stock. Freeze a backup stock of additional vials from the first few passage(s).•Please see the specified growth medium composition as shown in Table 1 for each cell line.•Each cell line grows at a different rate. Please refer to average doubling times in Table 1, and set culture conditions and expectations accordingly.•Previous guides may have recommended heat inactivation of serum. Please note that heat inactivation is not required to achieve optimal growth of these cell lines.•Do not use ANY antibiotic with GFP-expressing cell lines BW128090 and BW133416 as they do not have ANY antibiotic selection resistance.•Successive passages of non-GFP expressing cell lines can be achieved with or without antibiotic. Antibiotic in the medium is not required for optimal performance of the cells. However, it is recommended to add antibiotic if potential bacterial contamination while growing cells is a concern in your lab. If antibiotic is to be added, please note that only Puromycin at the correct final concentration should be added (as noted on TDS). Do not use any other antibiotic.•Please note that only % cell density and % confluence but not % viability can be determined by microscopic visualization of cell lines. A viable cell count must be performed for all cell lines to assess true viability.•BW124735 is a suspension cell line and does not require trypsinization for passage. When cells reach 80-90% cell density/confluency in suspension, depending on doubling time obtained, simply dilute the culture 1:2 to 1:10 by plating in a bigger vessel containing fresh, warm media.•BW124317 and BW119267 is a mixture of adherent and suspended cells. When % suspended cell density/confluency is high and the plate looks full of cells, collect the culture media first to obtain the suspension cells. If adherent cells are loosely attached, directly add trypsin without rinsing with PBS as cells maybe lost with the PBS rinse. If adherent cells are tightly attached, a quick rinse with PBS followed by trypsin treatment is recommended. Neutralize with 2x media. Pool all cells together, do a cell count and proceed to plate in a bigger vessel with additional fresh media.Table 1.Product Product Description Media Composition* Average Doubling Time (DT)***BW124087 Bioware Brite 4T1-Red-FLuc RPMI+10% Hyclone FBS14BW128090 Bioware Brite 4T1-Red-FLuc-GFP** RPMI+10% Hyclone FBS 14BW124734 Bioware Brite B16F10-Red-FLuc RPMI+10% Hyclone FBS 15BW128444 Bioware Brite PC3-Red-FLuc EMEM+10% Hyclone FBS 24BW133416 Bioware Brite PC3-Red-FLuc-GFP** EMEM+10% Hyclone FBS 24BW124316 Bioware Brite NCI-H460-Red-FLuc RPMI+10% Hyclone FBS 16BW125055 Bioware Brite LNCaP-Red-FLuc RPMI+10% Hyclone FBS 60BW134280 Bioware Brite HepG2-Red-FLuc EMEM+10% Hyclone FBS 30BW124577 Bioware Brite U87MG-Red-FLuc EMEM+10% Hyclone FBS 34BW134246 Bioware Brite GL261-Red-FLuc DMEM+10% Hyclone FBS 26BW128092 Bioware Brite HT1080-Red-FLuc EMEM+10% Hyclone FBS 22BW125058 Bioware Brite BxPC3-Red-FLuc RPMI+10% Hyclone FBS 36BW124353 Bioware Brite HT-29-Red-FLuc McCoy’s 5a +10% Hyclone FBS 24BW124318 Bioware Brite HCT-116-Red-FLuc McCoy’s 5a +10% Hyclone FBS 16BW124735 Bioware Brite K562-Red-FLuc**** RPMI+10% Hyclone FBS 15BW124317 Bioware Brite Colo205-Red-FLuc**** RPMI+10% Hyclone FBS 28BW119262 Bioware Brite MCF7-Red-FLuc EMEM+10% Hyclone FBS 40BW119267 Bioware Brite LL/2-Red-FLuc**** DMEM+10% Hyclone FBS 24BW119276 Bioware Brite SKOV3-Red-FLuc McCoy’s 5a +10% Hyclone FBS 35BW119266 Bioware Brite A549-Red-FLuc RPMI+10% Hyclone FBS 22* Optional: Puromycin at a final concentration of 2 ug/mL for all cell lines listed above except for BW124087 which is at 5ug/mL. ** GFP cell lines (BW128090 and BW133416 do not have any antibiotic selection resistance).*** Doubling time is an average. Actual doubling times will vary based on culture conditions and handling.**** Suspension cell linesThawing a Frozen Cell Vial1. Thaw the vial rapidly by gentle shaking in 37°C water bath by hand. Be careful to keep the cap out of the water.Wipe vial dry.2. Spray the vial and your gloved hands with disinfectant (70% isopropyl alcohol) and wipe dry. Immediately after,open the vial in the hood and transfer contents to 4mL of warm, sterile growth media with serum but no antibiotics. Mix gently. DO NOT CENTRIFUGE.3. Count 1ml of the total cells and immediately plate the remaining cell suspension into a T25 flask. Incubate at37°C, 5-6% CO2, 100% humidity overnight.4. Next day, examine the cells under the microscope. If the cells are confluent, continue to instructions below forpassaging cell lines.If the cells are not confluent:a. Aseptically remove the media and replace with 5mL of the same media warmed to 25ºC-37ºC.b. Continue to incubate the plate(s) for an additional 1-7 days with minimal disturbance. Changemedia every 3-4 days until the cells reach 80-90% confluency; only then proceed to passage thecells.Passaging Cell Lines1. For in vivo use we recommend less than 10 in vitro passages from original vial. However, split cells at leastone time before injecting in vivo.2. When cells are approximately 80-90% confluent, passage cells to vessels with a 1:3 to 1:4 split withoutantibiotic medium.3. To passage the cells, remove media and add 5ml of sterile, room temperature 1X PBS. Gently swirl theadded PBS once over the cells and remove the PBS immediately.4. Next, Add 1ml of 0.05% sterile, warm Trypsin (approximately 1mL for T25; 2ml for T75; 4ml for T150 and 5mlfor T175) to the flask containing cells and gently swirl to allow trypsin to coat the plate. Incubate at 37°C for 1-5 mins to allow cells to dissociate from the plate.5. Examine the flask under a microscope to confirm dissociation. Neutralize with 2x medium, and gentlyre-suspend the cells by pipetting up and down 1-2 times.6. Transfer cells into a bigger flask (T75, T150, T175) at a 1:3-1:7 surface area ratio. Continue to incubate theplate(s) for 1-7 days with minimal disturbance. Change media every 3-4 days until the cells reach 80-90%confluency; only then proceed to passage the cells.Creating Cell Stocks1. When cells have reached 80% confluence, freeze aliquots for 24 hours in -80ºC in 5% DMSO/95% FBS withoutantibiotics. Transfer frozen vials to LN2 tank after 24 hours.2. We recommend that you thaw one test vial to check and confirm viability by cell counting and/or culturing.。

4t1细胞
4T1（4T1.2）细胞是一种一直被广泛研究的小鼠乳腺癌细胞株。

这种细胞株最
初来自Balb/c小鼠的乳腺实体瘤。

它具有高度的异质性不仅在细胞形态学上，在
生长速率、转移特性和抗药性等方面也表现出明显的异质性。

这使得4T1细胞成
为研究乳腺癌的良好模型。

1. 细胞特性
4T1细胞具有多种特性，包括但不限于： - 高度异质性 - 能够在小鼠体内形成
高度侵袭性的实体瘤 - 显示高转移性，可在体内形成肺转移 - 耐受药物治疗 - 能够
在体内复制多个人乳腺癌的特点，例如HER2过表达和雌激素受体阴性等
2. 应用领域
4T1细胞在乳腺癌研究领域有着广泛的应用。

研究人员通常利用这种模型来研
究乳腺癌的生长、转移机制，以及筛选抗癌药物等。

由于其高度转移性的特点，
4T1细胞也被广泛用于研究抗转移治疗方法。

此外，4T1细胞还被用于评估潜在
的免疫治疗策略，例如免疫检查点抑制剂的疗效评估。

3. 研究现状
目前，许多研究团队正在利用4T1细胞模型开展多项研究。

他们希望通过深入了解4T1细胞的特性和行为，探索乳腺癌生长和转移的机制，以及寻找更有效的
治疗方法。

一些最新的研究还试图通过基因编辑技术修改4T1细胞，以便更好地
模拟人类乳腺癌的特点，并推动相关治疗方法的发展。

4. 结语
总的来说，4T1细胞是一个重要的乳腺癌研究模型，具有高度转移性和异质性。

通过对这种细胞的研究，科学家们可以更好地理解乳腺癌的发展机制，并寻找更有效的治疗方法，为乳腺癌患者带来希望。

Decorin提升小鼠脾脏细胞对乳腺癌细胞系4T1的免疫响应性赵慧强; 刘超; 胡泽斌; 戴诗云; 王华【期刊名称】《《中国医药生物技术》》【年(卷),期】2019(014)006【总页数】6页(P481-486)【关键词】核心蛋白聚糖; 乳腺肿瘤; 基因;MHCII类; 脾细胞; 4T1细胞系【作者】赵慧强; 刘超; 胡泽斌; 戴诗云; 王华【作者单位】100850 北京军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所; 100048北京中国人民解放军总医院第六医学中心干部保健科; 264003 山东滨州医学院临床医学院; 100050 北京中国食品药品检定研究院体外诊断试剂所【正文语种】中文目的评价高表达核心蛋白聚糖（Decorin）的小鼠乳腺癌细胞系 4T1 对正常小鼠脾细胞的免疫激活效应，明确 Decorin 对抗肿瘤免疫的调节作用。

方法采用携带Decorin 基因的复制缺陷型重组腺病毒 Ad.DCN 感染小鼠乳腺癌细胞系 4T1。

与小鼠脾细胞共培养 3 d 后，通过流式细胞术检测小鼠脾细胞的CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、T 记忆细胞（Tm）和T 调节细胞（Treg）的百分比；利用实时定量 PCR（qPCR）技术检测 Th1 类细胞因子IL-2、IL-12、TNF-α和IFN-γ 的表达，Th2 类细胞因子IL-4、IL-6、IL-10 和转化生长因子β（TGF-β）的表达，以及与杀伤相关基因穿孔素与颗粒酶 B 的表达。

结果与小鼠乳腺癌细胞系 4T1 共培养后，小鼠脾细胞 CD4+T 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞、Treg 细胞比例无明显改变，但Tm 细胞比例显著升高；同时，细胞因子、穿孔素和颗粒酶 B 表达下调。

但是，病毒感染的 4T1 细胞，特别是Ad.DCN 感染的 4T1 细胞可显著抑制 Treg 细胞，并部分逆转细胞因子表达的下调。

结论 Decorin 高表达可增强正常小鼠脾脏细胞对乳腺癌细胞系 4T1 的免疫响应性，从而激活抗肿瘤免疫反应。

[J ].F r o n t P e d i a t r ,2021,9:659164.[10]WY L I E K M ,WY L I E T N ,B U L L E R R ,e t a l .D e t e c t i o no f v i r u s e s i n c l i n i c a l s a m p l e s b y u s e o f m e t a ge n o m i c s e -q u e n c i n g a n d t a r g e t e d s e q u e n c e c a p t u r e [J ].J C l i n M i c r o -b i o l ,2018,56(12):e 01123.[11]D O Y L E R M ,B U R G E S S C ,W I L L I AM S R ,e t a l .D i r e c tw h o l e -g e n o m e s e q u e n c i n g o f s p u t u m a c c u r a t e l y id e n t i f i e s d r u g -r e s i s t a n t M yc o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s f a s t e r t h a n MG I T c u l t u r e s e q u e n c i n g [J ].J C l i n M i c r o b i o l ,2018,56(8):e 00666.[12]Y A N G Y ,WA L L S S D ,G R O S S S M ,e t a l .T a r ge t e d s e -q u e n c i n g of r e s p i r a t o r y v i r u s e s i n c l i n i c a l s pe c i m e n sf o r p a t h og e n i d e n t i f i c a t i o n a n d g e n o m e -w i d e a n a l ys i s [J ].M e t h o d s M o l B i o l ,2018,1838:125-140.[13]WU X C ,L I A N G R B ,X I A O Y Q ,e t a l .A p pl i c a t i o n o f t a r g e t e d n e x t g e n e r a t i o n s e q u e n c i n g t e c h n o l o g yi n t h e d i -a g n o s i s o f M yc o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s a nd f i r s t l i ne d r u g s r e s i s t a n c e d i r e c t l y fr o m c e l l -f r e e D N A o f b r o n -c h o a l v e o l a r l a v a ge f l u i d [J ].J I n f e c t ,2023,86(4):399-401.[14]R I G O U T S L ,M I O T T O P ,S C HA T S M ,e t a l .F l u o r o -q u i n o l o n e h e t e r o r e s i s t a n c e i n M yc o b a c t e r i u m t u b e r c u l o -s i s :de t e c t i o n b y g e n o t y p i c a n d p h e n o t y p i c a s s a y i n e x pe r -i m e n t a l l y m i x e d p o p u l a t i o n s [J ].S c i R e p,2019,9(1):11760.[15]WU S H ,X I A O Y X ,H S I A O H C ,e t a l .D e v e l o pm e n t a n d a s s e s s m e n t o f a n o v e l w h o l e -g e n e -b a s e d t a r ge t e d n e x t -g e n e r a t i o n s e q u e n c i n g a s s a yf o r d e t e c t i ng th e s u s -c e p t i b i l i t y o f M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s t o 14d r u gs [J ].M i c r o b i o l S pe c t r ,2022,10(6):e 0260522.[16]C HA E H ,HA N S J ,K I M S Y ,e t a l .D e v e l o pm e n t o f a o n e -s t e p m u l t i p l e x P C R a s s a yf o r d i f f e r e n t i a l d e t e c t i o n o f m a j o r M y c o b a c t e r i u m s pe c i e s [J ].J C l i n M i c r o b i o l ,2017,55(9):2736-2751.[17]姚璐.M.a r u n d i n i s 引起播散性暗色丝孢霉病1例报道并文献复习[D ].南宁:广西医科大学,2018.[18]郑凯文.基于多重P C R 与第二代高通量测序技术的下呼吸道病原检测方法研究[D ].广州:华南理工大学,2019.[19]D U N L A P D G ,MA R S HA L L C W ,F I T C H A ,e t a l .I m -p r o v e d d e t e c t i o n o f c u l p r i t p a t h o g e n s b y ba c t e r i a l D N A s e q u e n c i n g a f f e c t s a n t ib i o t ic m a n a ge m e n t d e c i s i o n s i n s e -v e r e p n e u m o n i a [J ].A m J C a s e R e p,2018,19:1405-1409.[20]吴秀秀,胡嘉艺,龙剑海,等.5例鹦鹉热衣原体肺炎的临床特征及诊治特点[J ].临床内科杂志,2022,39(9):630-631.[21]祝青,张彬.鹦鹉热衣原体肺炎12例临床分析[J ].南通大学学报(医学版),2022,42(2):183-185.[22]D OMA Z E T O V S K A A ,J E N S E N S O ,G R A Y M ,e t a l .C u l t u r e -f r e e p h y l o g e n e t i c a n a l y s i s o f l e gi o n e l l a p n e u m o -n i a u s i n g t a r g e t e d C R I S P R /C a s 9n e x t g e n e r a t i o n s e qu e n -c i n g [J ].M i c r o b i o l S pe c t r ,2022,10(4):e 0035922.[23]O 'F L A H E R T Y B M ,L I Y ,T A O Y ,e t a l .C o m pr e h e n s i v e v i r a l e n r i c h m e n t e n a b l e s s e n s i t i v e r e s p i r a t o r y vi r u s g e -n o m i c i d e n t i f i c a t i o n a n d a n a l y s i s b y ne x t g e n e r a t i o n s e -q u e n c i n g[J ].G e n o m e R e s ,2018,28(6):869-877.[24]C HU N G H Y ,J I A N M J ,C HA N G C K ,e t a l .N o v e l d u a lm u l t i p l e x r e a l -t i m e P C R a s s a y s f o r t h e r a pi d d e t e c t i o n o f S A R S -C O V -2,i n f l u e n z a A /B ,a n d r e s p i r a t o r y s y n c yt i a l v i r u s u s i n g t h e B D MA X o p e n s y s t e m [J ].E m e r g Mi -c r o b e s I n f e c t ,2021,10(1):161-166.(收稿日期:2022-12-29 修回日期:2023-05-11)ә通信作者,E -m a i l :z e n gt @s m u .e d u .c n ㊂㊃综 述㊃D O I :10.3969/j.i s s n .1672-9455.2023.20.030宫颈癌血清肿瘤标志物的研究进展钟学进1综述,曾 涛2ә审校1.广东医科大学附属第二医院检验科,广东湛江524003;2.广东医科大学附属医院检验科,广东湛江524003摘 要:尽管临床治疗宫颈癌的手段及技术不断增多,但晚期或复发宫颈癌患者的预后仍然很差,宫颈癌早发现㊁早治疗是保障女性生命健康的重大卫生问题㊂血清肿瘤标志物具有取材方便㊁检测操作简单㊁检测费用低廉等优势,是诊断恶性肿瘤的常见参考㊂该文分别对不同性质的宫颈癌血清肿瘤标志物(包括蛋白质㊁D N A 及R N A 三大种类)进行归纳总结,旨在为宫颈癌的诊断提供参考依据㊂关键词:宫颈癌; 血清肿瘤标志物; 蛋白质类标志物; D N A 类标志物; R N A 类标志物中图法分类号:R 737.33文献标志码:A 文章编号:1672-9455(2023)20-3072-04R e s e a r c h p r o gr e s s o f c e r v i c a l c a n c e r s e r u m t u m o r m a r k e r s *Z H O N G X u e ji n 1,Z E N G T a o 2ә1.D e p a r t m e n t o f C l i n i c a l L a b o r a t o r y ,T h e S e c o n d A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f G u a n g d o n g M e d i c a l U n i v e r s i t y ,Z h a n j i a n g ,G u a n g d o n g 524003,C h i n a ;2.D e p a r t m e n t o f C l i n i c a l L a b o r a t o r y ,A f f i l i a t e d H o s pi t a l o f G u a n g d o n g M e d i c a l U n i v e r s i t y ,Z h a n j i a n g ,G u a n g d o n g 524003,C h i n a A b s t r a c t :D e s p i t e t h e i n c r e a s i n g n u m b e r o f c l i n i c a l t r e a t m e n t m e t h o d s a n d t e c h n o l o gi e s f o r c e r v i c a l c a n c -㊃2703㊃检验医学与临床2023年10月第20卷第20期 L a b M e d C l i n ,O c t o b e r 2023,V o l .20,N o .20Copyright ©博看网. All Rights Reserved.e r,t h e p r o g n o s i s of p a t i e n t s w i t h a d v a n c e d o r r e c u r r e n t c e r v i c a l c a n c e r a r e s t i l l v e r y p o o r.E a r l y d e t e c t i o n a n d t r e a t m e n t o f c e r v i c a l c a n c e r i s a m a j o r h e a l t h p r o b l e m t o p r o t e c t w o m e n's l i f e a n d h e a l t h.S e r u m t u m o r m a r k-e r s h a v e t h e a d v a n t ag e s o f c o n v e n i e n t s a m p l i n g,s i m p l e d e t e c t i o n o p e r a t i o n a n d l o w d e t e c t i o n c o s t,whi c h a r e c o mm o n r e f e r e n c e s f o r t h e d i a g n o s i s o f m a l i g n a n t t u m o r s.I n t h i s p a p e r,s e r u m t u m o r m a r k e r s o f c e r v i c a l c a n c e r w i t h d i f f e r e n t p r o p e r t i e s w e r e s u mm a r i z e d,i n c l u d i n g p r o t e i n,D N A a n d R N A,i n o r d e r t o p r o v i d e r e f e r-e n c e f o r t h e d i a g n o s i s o f c e r v i c a l c a n c e r.K e y w o r d s:c e r v i c a l c a n c e r;s e r u m t u m o r m a r k e r;p r o t e i n m a r k e r; D N A m a r k e r; R N A m a r k e r宫颈癌是女性群体中常见的恶性肿瘤,是导致女性死亡的重要病因,特别是在发展中国家㊂宫颈癌的早期治愈率可达80%~90%,但随着宫颈癌病情不断进展,患者预后也越来越差[1]㊂故宫颈癌的早诊断㊁早治疗是改善患者预后的重要前提,但宫颈癌早期临床症状不明显,多数患者首次来院就诊时已发展为中晚期㊂宫颈癌的发病机制尚不清楚,随着分子生物学技术的不断发展,临床开始关注宫颈癌发生㊁发展的分子生物学机制㊂血清分子标志物在反映宫颈癌中的灵敏度更高,且取材及检测也较为方便,已成为临床诊断宫颈癌㊁判断患者病情严重程度的常见手段㊂根据宫颈癌血清标志物的生物性质,主要分为蛋白质类标志物㊁D N A类标志物㊁R N A类标志物三大类,本文对宫颈癌常见的血清标志物综述如下㊂1蛋白质类标志物1.1 T o l l样受体(T L R)9 T L R属于病原相关分析模式识别受体,T L R s可识别病原体,同时可激活机体产生固有免疫受体,触发T L R信号,导致癌症发生,其中T L R9是天然免疫中重要识别受体家族中的一员㊂有研究表明,T L R9能识别人乳头瘤病毒(H P V),参与H P V所引起的后续病理反应㊂P A R-R O C H E等[2]研究发现,T L R9能影响细胞周期,参与宫颈癌发病㊂P A N D E Y等[3]研究发现,T L R9基因多态性与宫颈癌发病风险相关㊂C A N N E L L A等[4]研究发现,T L R9与高危型-H P V(H R-H P V)密切相关,没有清除H P V的机体内T L R9水平升高会引发炎症反应,增加宫颈癌患病风险㊂1.2 C X C趋化因子配体14(C X C L14) C X C L14是近来新发现的趋化因子家族成员,其定位于人染色体5q31㊂有研究发现,C X C L14在肾脏㊁小肠㊁肝脏等正常组织中均有表达,但在许多肿瘤细胞系及肿瘤组织中缺失㊂有学者发现,结直肠癌内C X C L14表达水平升高会增加结直肠癌S W620细胞侵袭能力[5]㊂X U 等[6]研究发现,乳腺癌阳性淋巴结中C X C L14表达水平异常增高,可能是乳腺癌淋巴结转移的调节因子㊂C X C L14是一种肿瘤抑制因子,W E S T R I C H等[7]报道称,C X C L14在宫颈癌㊁子宫内膜癌㊁结直肠癌中的表达失调㊂C I C C H I N I等[8]研究发现,C X C L14在H P V阳性宫颈癌中的表达水平明显下调,且C X-C L14表达水平下调与H P V癌蛋白E7诱导的C X-C L14启动子高甲基化相关㊂1.3缺氧诱导因子-1α(H I F-1α) H I F-1α最初在人肝癌细胞细胞株的核内容物中被发现,H I F-1α与H I F-1β以异源二聚体的形式构成H I F-1α㊂低氧是肿瘤微环境改变的重要特征,也是肿瘤恶性转化及转移的始动因素[9]㊂H I F-1α是调节氧平衡的关键因子,是组织缺氧的固定生物学标志物㊂目前,已有研究表明,H I F-1α参与恶性肿瘤增殖㊁凋亡及血管生成等生理过程,并与肿瘤放疗㊁化疗的灵敏度相关[10]㊂郑芳等[11]研究显示,沉默端粒重复结合因子2的表达,可通过抑制H I F-1α介导的血管生成,从而抑制宫颈癌细胞的增殖㊁侵袭㊁转移及上皮-间质转化㊂Y A N 等[12]还发现,H I F-1α表达水平可预测宫颈癌患者新辅助化疗的预后㊂1.4人多梳蛋白2(H P C2)细胞周期失控是恶性肿瘤发病的重要机制,多梳蛋白(P c G)是维持同源异形基因稳定性,抑制基因同源转化的重要转录因子,与肿瘤发生密切相关[13]㊂H P C2是P c G家族中的重要成员,负责执行P c G功能,H P C2与其他P c G相互作用可介导多梳蛋白抑制性复合体2(P R C2)与特异性D N A序列相互结合,对靶基因产生抑制作用㊂有研究认为,H P C2基因突变或表达水平异常与肿瘤发生密切相关[14]㊂有学者研究发现,宫颈癌细胞中H P C2表达异常,其编码的氨基酸改变[15]㊂1.5糖类抗原242(C A242) C A242是常见的肿瘤标志物,属于唾液酸化鞘糖脂类抗原㊂C A242表达于黏蛋白上,健康人外周血中C A242水平极低,但恶性肿瘤患者血清中C A242水平异常升高,并且其血清水平与肿瘤恶性程度㊁浸润深度㊁分期等病理特征均有关[16]㊂目前,C A242多用于胃肠道肿瘤的诊断,其被证实与大肠癌㊁结直肠癌㊁胃癌等密切相关,特别在胰腺癌及结直肠癌中的诊断价值较高[17-18]㊂近年来, C A242也被应用于肺腺癌㊁宫颈癌的诊断,D O U 等[19]研究发现,宫颈癌患者血清C A242中位数水平较高,可作为诊断宫颈癌的血清标志物㊂2 D N A类标志物2.1 H P V D N A H R-H P V长期感染是宫颈癌的重要致病原因,与细胞学检查比较,H P V D N A检测的灵敏度更高㊂此外,H P V D N A荧光聚合酶链反应(P C R)检测方便简单,易被大众所接受,是宫颈癌的常见筛查手段之一㊂但H P V感染的普遍性及一过性导致了H P V D N A检测的特异度较低,假阳性率较㊃3703㊃检验医学与临床2023年10月第20卷第20期 L a b M e d C l i n,O c t o b e r2023,V o l.20,N o.20Copyright©博看网. All Rights Reserved.高[20]㊂为提高判断准确度,患者需定期进行反复H P V D N A检测,当反复检测结果均为阳性时,才可认定为H P V持续感染㊂但反复检测对患者带来的经济负担及心理压力较大,目前,临床正在寻找特异度更高的生物标志物,弥补H P V D N A检测的不足㊂2.2循环肿瘤D N A(c t D N A)循环游离D N A(c f D-N A)是一种具有D N A双螺旋结构的核苷酸片段,健康人体内的c f D N A多来源于血细胞,由于吞噬细胞的吞噬作用,其外周血水平极低,除正常血细胞会产生c f D N A外,肿瘤细胞也会释放出游离D N A片段,即c t D N A,故恶性肿瘤患者血浆中c f D N A水平明显增高[21]㊂c t D N A来自肿瘤原发灶㊁转移灶及转移灶中肿瘤细胞坏死㊁凋亡及溶解c t D N A与肿瘤细胞分泌的外泌体,其携带肿瘤组织的分子遗传学信息,并且可反映肿瘤负荷㊂在不同类型的恶性肿瘤患者中,其血浆c t D N A阳性检出率不一致,如肺癌患者血浆c t D N A阳性检出率为90%,乳腺癌血浆c t D N A阳性检出率为50%~70%,肝癌患者c t D N A阳性检出率为75%以上[22-24]㊂相对于其他恶性肿瘤,宫颈癌患者血浆c t D N A阳性检出率较低,有学者表示宫颈癌患者血浆c t D N A阳性检出率不高[24]㊂这与宫颈癌转移途径相关,不同于其他肿瘤,宫颈癌主要通过直接蔓延及淋巴转移的方式进行转移,血行转移并不多见,故其外周血中所释放的D N A水平较低㊂此外,c t D-N A水平或阳性检出率与宫颈癌的体积㊁临床分期㊁组织学分级等临床病理特征有关,其在诊断宫颈癌㊁反映其病情严重程度中具有良好价值㊂3 R N A类标志物3.1 H R-H P V E6/E7m R N A 大多数宫颈癌的发生与H R-H P V感染密切相关㊂美国阴道镜和宫颈病理协会强调H R-H P V检测的重要性,并建议根据H R-H P V检测结果进行下一步分流处理[25]㊂H P V属于小型无包膜长双链环状D N A病毒,其编码基因E6㊁E7在宿主中的表达是宫颈癌发生的关键,H P V E6/ E7D N A荧光P C R检测在诊断宫颈癌中的灵敏度优于液基薄层细胞学检查,常用于H P V感染的早期筛查及分型,与H P V D N A比较,H R-H P V m R N A检测更有助于判断宫颈病变发展的程度㊂在高级别鳞状上皮内病变中,H P V E6/E7m R N A检测方法比H P V D N A更具优势[26],其联合细胞学筛查可提高H P V感染的早期宫颈癌癌前病变筛查效果,降低因一过性感染导致的过度诊疗㊂3.2长链非编码R N A(L n c R N A s) L n c R N A s是指长度超过200个核苷酸但无蛋白质编码功能的转录物,其可参与细胞凋亡㊁周期调控,以及R N A转录㊁翻译㊁调控等多种生物功能㊂目前,与宫颈癌相关的L n-c R N A s较多㊂(1)HO X转录反义R N A(HO T A I R): HO T A I R是L n c R N A中的一种,主要功能是识别HO X D基因座中基因表达的反式调节作用,可与P R C2㊁组蛋白去甲基化酶1相互作用,参与肿瘤细胞增殖㊁凋亡㊁转移等基因调控㊂有研究发现,宫颈癌癌病灶内HO T A I R m R N A水平明显高于癌旁组织,且与宫颈癌侵袭㊁转移㊁增殖等病理行为密切相关[27]㊂(2)人肺腺癌转移相关转录本1基因(MA L A T1): MA L A T1定位于染色体11q13,转录本序列全长8078b p,其在宫颈癌细胞系中呈高表达㊂T I E等[28]研究发现,MA L A T1可能是宫颈癌H P V16阳性患者的治疗靶点㊂(3)人类母系表达基因3(M E G3): M E G3定位于染色体14q32,长度为1.6k b,M E G3启动子区域甲基化水平高于癌旁组织,M E G3启动子甲基化水平有望成为诊断宫颈癌的分子标志物[29]㊂(4)小核仁R N A宿主基因16(S N H G16):S N H G16是一种新型l n R N A,在宫颈癌组织中呈高表达, S N H G16可上调R A R P9表达,促进宫颈癌细胞增殖及侵袭[30]㊂3.3环状R N A s(c i r c R N A s) c i r c R N A s是一种无游离5'端及3'端的单链共价闭合非编码R N A,具有稳定㊁丰富及特异性结构特点,参与宫颈癌侵袭转移㊂有研究显示,c i r c R N A s可促进宫颈癌细胞增殖与侵袭,还可调节天然免疫基因,与H P V相互作用,参与宫颈癌癌前病变[31]㊂4总结与展望宫颈癌的血清肿瘤标志物种类较多,对辅助临床诊断宫颈癌㊁判断患者病情严重程度均具有一定的应用价值,可为宫颈癌的早诊断㊁早治疗提供依据,帮助临床更为准确地判断宫颈癌的临床分期㊁淋巴转移等病理情况,降低宫颈癌的病死率㊂但不同血清肿瘤标志物水平也会受多种其他因素的干扰,故目前尚无公认的针对宫颈癌的特定肿瘤标志物,可采用多种肿瘤标志物联合检测的形式,提高其临床应用价值㊂关于宫颈癌血清肿瘤标志物的研究还需要更多的科研探索及更长时间的临床验证,寻找灵敏度高及特异性强的分子标志物,是优化宫颈癌筛查策略的可靠途径㊂参考文献[1]L I N S,G A O K,G U S,e t a l.W o r l d w i d e t r e n d s i n c e r v i c a lc a n c e r i n c ide n c e a n d m o r t a l i t y,w i t h p r e d i c t i o n sf o r t h en e x t15y e a r s[J].C a n c e r,2021,127(21):4030-4039.[2]P A R R O C H E P,R O B L O T G,L E C A L V E Z-K E L M F,e ta l.T L R9r e-e x p r e s s i o n i n c a n c e r c e l l s e x t e n d s t h e S-p h a s ea n d s t ab i l i z e s p16(I N K4a)p r o t e i n e x p r e s s i o n[J].O nc o-g e n e s i s,2016,5(7):244-250.[3]P A N D E Y N O,C HA UHA N A V,R A I T HA T HA N S,e ta l.A s s o c i a t i o n o f T L R4a n d T L R9p o l y m o r p h i s m s a n dh a p l o t y p e s w i t h c e r v i c a l c a n c e r s u s c e p t i b i l i t y[J].S c i R e p,2019,9(1):729-735.[4]C A N N E L L A F,P I E R A N G E L I A,S C A G N O L A R I C,e ta l.T L R9i s e x p r e s s e d i n h u m a n p a p i l l o m a v i r u s-p o s i t i v ec e r v i c a l c e l l s a nd i s o ve r e x p r e s s e d i n p e r s i s t e n t i nf e c t i o n s㊃4703㊃检验医学与临床2023年10月第20卷第20期 L a b M e d C l i n,O c t o b e r2023,V o l.20,N o.20Copyright©博看网. All Rights Reserved.[J].I mm u n o b i o l o g y,2015,220(3):363-368.[5]Z E N G J,Y A N G X,C H E N G L,e t a l.C h e m o k i n e C X C L14i s a s s o c i a t e d w i t h p r o g n o s i s i n p a t i e n t s w i t h c o l o r e c t a l c a r c i n o m a a f t e r c u r a t i v e r e s e c t i o n[J].J T r a n s l M e d, 2013,11(7):6-12.[6]X U K,Z HA N G W,WA N G C,e t a l.I n t e g r a t i v e a n a l y s e s o f s c R N A-s e q a n d s c A T A C-s e q r e v e a l C X C L14a s a k e y r e g u l a t o r o f l y m p h n o d e m e t a s t a s i s i n b r e a s t c a n c e r[J].H u m M o l G e n e t,2021,30(5):370-380.[7]W E S T R I C H J A,V E R M E E R D W,C O L B E R T P L,e ta l.T h e m u l t i f a r i o u s r o l e s o f t h e c h e m o k i n e C X C L14i n c a n c e r p r o g r e s s i o n a n d i mm u n e r e s p o n s e s[J].M o l C a r-c i n o g,2020,59(7):794-806.[8]C I C C H I N I L,W E S T R I C H J A,X U T,e t a l.S u p p r e s s i o n o f a n t i t u m o r i mm u n e r e s p o n s e s b y h u m a n p a p i l l o m a v i r u s t h r o u g h e p i g e n e t i c d o w n r e g u l a t i o n o f C X C L14[J].m B i o, 2016,7(3):270-286.[9]R A S H I D M,Z A D E H L R,B A R A D A R A N B,e t a l.U p-d o w n re g u l a t i o n of H I F-1αi n c a n c e r p r og r e s s i o n[J].G e n e,2021,25(798):769-782.[10]A L B A D A R I N,D E N G S,L I W.T h e t r a n s c r i p t i o n a l f a c-t o r s H I F-1a n d H I F-2a n d t h e i r n o v e l i n h i b i t o r s i n c a n c e r t h e r a p y[J].E x p e r t O p i n D r u g D i s c o v,2019,14(7):667-682.[11]郑芳,肖新益.T R F2通过调节H I F-1α介导的血管生成对宫颈癌细胞上皮-间质转化的影响[J].中国计划生育和妇产科,2021,13(11):42-47.[12]Y A N B,MA Q F,T A N W F,e t a l.E x p r e s s i o n o f H I F-1αi s a p r e d i c t i v e m a r k e r o f t h e e f f i c a c y o f n e o a d j u v a n t c h e m o t h e r a p y f o r l o c a l l y a d v a n c e d c e r v i c a l c a n c e r[J].O n c o l L e t t,2020,20(1):841-849.[13]B A R B O U R H,D A O U S,H E N D Z E L M,e t a l.P o l y c o m bg r o u p-m e d i a t e d h i s t o n e H2A m o n o u b i q u i t i n a t i o n i n e p i g-e n o m e r e g u l a t i o n a n d n u c l e a r p r o c e s s e s[J].N a t C o m-m u n,2020,11(1):5947-5952.[14]Q I N H,D U D,Z HU Y,e t a l.T h e P c G p r o t e i n H P C2i n-h i b i t s R B P-J-m e d i a t e d t r a n s c r i p t i o n b y i n t e r a c t i n g w i t hL I M p r o t e i n K y o T2[J].F E B S L e t t,2005,79(5):1220-1226.[15]G U I J C,Y A N W L,L I U X D.C A19-9a n d C A242a s t u m o r m a r k e r s f o r t h e d i a g n o s i s o f p a n c r e a t i c c a n c e r:a m e t a-a n a l y s i s[J].C l i n E x p M e d,2014,14(2):225-233.[16]G E L,P A N B,S O N G F,e t a l.C o m p a r i n g t h e d i a g n o s t i ca c c u r a c y o f f i v e c o mm o n t u m o u rb i o m a r k e r s a n d C A19-9 f o r p a nc r e a t i c c a n c e r:a p r o t o c o l f o r a n e t w o r k m e t a-a n a l-y s i s o f d i a g n o s t i c t e s t a c c u r a c y[J].B M J O p e n,2017,7(12):e018175.[17]B JÖR KMA N K,MU S T O N E N H,K A P R I O T,e t a l.C A125:a s u p e r i o r p r o g n o s t i c b i o m a r k e r f o r c o l o r e c t a lc a n c e r c o m p a r ed t o C E A,C A19-9o r C A242[J].T u m o u rB i o l,2021,43(1):57-70.[18]L U O H,S H E N K,L I B,e t a l.C l i n i c a l s i g n i f i c a n c e a n d d i-a g n o s t i c v a l u e o f s e r u m N S E,C E A,C A19-9,C A125a n dC A242l e v e l s i n c o l o r e c t a l c a n c e r[J].O n c o l L e t t,2020,20(1):742-750.[19]D O U H,S U N G,Z HA N G L.C A242a s a b i o m a r k e r f o rp a n c r e a t i c c a n c e r a n d o t h e r d i s e a s e s[J].P r o g M o l B i o l T r a n s l S c i,2019,162(7):229-239.[20]HU Z,MA D.T h e p r e c i s i o n p r e v e n t i o n a n d t h e r a p y o fH P V-r e l a t e d c e r v i c a l c a n c e r:n e w c o n c e p t s a n d c l i n i c a li m p l i c a t i o n s[J].C a n c e r M e d,2018,7(10):5217-5236.[21]Z V I R A N A,S C HU L MA N R C,S HA H M,e t a l.G e-n o m e-w i d e c e l l-f r e e D N A m u t a t i o n a l i n t e g r a t i o n e n a b l e s u l t r a-s e n s i t i v e c a n c e r m o n i t o r i n g[J].N a t M e d,2020,26(7):1114-1124.[22]I G N A T I A D I S M,S L E D G E G W,J E F F R E Y S S.L i q u i db i o p s y e n t e r s t h ec l i n i c-i m p l e m e n t a t i o n i s s u e s a nd f u t u r ec h a l l e n g e s[J].N a t R e v C l i n O n c o l,2021,18(5):297-312.[23]WA N G Y F,WA N G X J,L U Z,e t a l.O v e r e x p r e s s i o n o fS t a t3i n c r e a s e s c i r c u l a t i n g c f D N A i n b r e a s t c a n c e r[J].B r e a s tC a n c e r R e s T r e a t,2021,187(1):69-80.[24]S I V A R S L,P A L S D O T T I R K,C R O N A G U T E R S T AMY,e t a l.T h e c u r r e n t s t a t u s o f c e l l-f r e e h u m a n p a p i l l o m a-v i r u s D N A a s a b i o m a r k e r i n c e r v i c a l c a n c e r a n d o t h e rH P V-a s s o c i a t e d t u m o r s:a r e v i e w[J].I n t J C a n c e r,2022,24(10):16-20.[25]L I U T Y,X I E R,L U O L,e t a l.D i a g n o s t i c v a l i d i t y o f h u-m a n p a p i l l o m a v i r u s E6/E7m R N A t e s t i n c e r v i c a l c y t o-l o g i c a l s a m p l e s[J].J V i r o l M e t h o d s,2014,196(8):120-125.[26]HU C,L I U T,HA N C,e t a l.H P V E6/E7p r o m o t e s a e r-o b i c g l y c o l y s i s i n c e r v i c a l c a n c e r b y r e g u l a t i n g I G F2B P2 t o s t a b i l i z e m6A-MY C e x p r e s s i o n[J].I n t J B i o l S c i, 2022,18(2):507-521.[27]F A N C N,MA L,L I U N.S y s t e m a t i c a n a l y s i s o f l n c R N A-m i R N A-m R N A c o m p e t i n g e n d o g e n o u s R N A n e t w o r k i-d e n t i f i e s f o u r-l n c R N A s i g n a t u r e a s a p r o g n o s t i c b i o m a r k-e rf o r b r e a s t c a n c e r[J].J T r a n s l M e d,2018,16(1):264-270.[28]T I E W,G E F.MA L A T1i n h i b i t s p r o l i f e r a t i o n o f H P V16-p o s i t i v e c e r v i c a l c a n c e r b y s p o n g i n g m i R-485-5p t o p r o-m o t e e x p r e s s i o n o f MA T2A[J].D N A C e l l B i o l,2021,40(11):1407-1417.[29]Z H U J,H A N S.L i d o c a i n e i n h i b i t s c e r v i c a l c a n c e r c e l l p r o l i f-e r a t i o n a n d i n d u c e s c e l l a p o p t o s i s b y m o d u l a t i n g t h e l n c R N A-M E G3/m i R-421/B T G1p a t h w a y[J].A m J T r a n s l R e s, 2019,11(9):5404-5416.[30]WU W,G U O L,L I A N G Z,e t a l.L n c-S N H G16/m i R-128a x i s m o d u l a t e s m a l i g n a n t p h e n o t y p e t h r o u g h WN T/β-c a t e n i n p a t h w a y i n c e r v i c a l c a n c e r c e l l s[J].J C a n c e r, 2020,11(8):2201-2212.[31]C HA I C H I A N S,S HA F A B A K H S H R,M I R HA S H E M IS M,e t a l.C i r c u l a r R N A s:a n o v e l b i o m a r k e r f o r c e r v i c a lc a n c e r[J].J C e l l P h y s i o l,2020,235(2):718-724.(收稿日期:2023-01-16修回日期:2023-06-08)㊃5703㊃检验医学与临床2023年10月第20卷第20期 L a b M e d C l i n,O c t o b e r2023,V o l.20,N o.20Copyright©博看网. All Rights Reserved.。

体外培养细胞的种类和命名体外培养细胞的名称，随培养细胞技术的发展和细胞种类的增多而演变。

最早采用的名称为细胞株（Cell strain），以后又出现细胞系（Cell Line）一词，两者曾一度混用致概念不明确，导致文献中也很混乱。

我国也曾有类似情况，在我国尚未制定出统一名词前，本书用的名词基本参考Schaeffer，W.I.（1979）和国内有关会议、以及国内外杂志常用名词为准。

（一）初代培养初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。

一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。

（二）细胞系初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。

如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。

无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。

无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。

这两种不同性质的无限细胞系，在国内外文献中对这些名词的应用上也常不十分严格。

为概念上的明确，本书中对有恶性的无限细胞系采用“恶性转化细胞系”一词表示可能更妥。

而对那些只具永生性而无恶性的细胞系，则用无限细胞系或转化细胞系即可。

当前流传的NIH3T3、Rat-1、10T1/2等均属这类细胞系。

由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系（Subline）。

（三）克隆细胞株从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。

再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（Substrain）（四）二倍体细胞细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75％或80％以上）的细胞群，称二倍体细胞培养。

Chapter IVChapter IV Quantitative Research Quantitative ResearchTechniquesTechniquesin Proteomicsin ProteomicsNorthern blot of TgMTP1 expression in hyperaccumulatorh bl f i i h land nonaccumulator species.T t l i l t d f h t f th h l t T i d thTotal RNA was isolated from shoots of the hyperaccumulator T. goesingense and the nonaccumulators A. thaliana, T. arvense, and B. juncea after exposure to Ni for 48 h. Northern blots equally loaded with 30 mg of total RNA were probed with TgMTP1t1, stripped, and reprobed with TgMTP1t2 and finally stripped and reprobed with an A.pp,p g,y pp pthaliana actin probe as an RNA loading control.Persans et al, 2001, PNASQuantitative Proteomics(定量蛋白质组学)•定量蛋白质组学（Quantitative Proteomics），就是把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂的混合体把个基因组表达的全部蛋白质或个复杂的混合体系中的所有蛋白质进行精确的定量与鉴定的一门学科。

•基于研究手段的不同，定量蛋白质组学研究技术可分为三类：为三类荧光定量蛋白质分析技术蛋基于质谱的蛋白质组定量分析技术蛋白质芯片技术荧光定量蛋白质分析技术Fluorescence Quantitative Protein AnalysisTechniques•与蛋白质共价结合的荧光染料由于染料与蛋白质的结合是多位点的，对蛋白质的溶解度有一定影响。

体外培养细胞的种类和命名体外培养细胞的名称，随培养细胞技术的发展和细胞种类的增多而演变。

最早采用的名称为细胞株（Cell strain），以后又出现细胞系（Cell Line）一词，两者曾一度混用致概念不明确，导致文献中也很混乱。

我国也曾有类似情况，在我国尚未制定出统一名词前，本书用的名词基本参考Schaeffer，W.I.（1979）和国内有关会议、以及国内外杂志常用名词为准。

（一）初代培养初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。

一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。

（二）细胞系初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。

如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。

无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。

无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。

这两种不同性质的无限细胞系，在国内外文献中对这些名词的应用上也常不十分严格。

为概念上的明确，本书中对有恶性的无限细胞系采用“恶性转化细胞系”一词表示可能更妥。

而对那些只具永生性而无恶性的细胞系，则用无限细胞系或转化细胞系即可。

当前流传的NIH3T3、Rat-1、10T1/2等均属这类细胞系。

由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系（Subline）。

（三）克隆细胞株从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。

再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（Substrain）（四）二倍体细胞细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75％或80％以上）的细胞群，称二倍体细胞培养。

gating cell的分类
"Gating cell" 的分类通常是根据其在不同领域的应用或其功能来进行的。

以下是一些可能的分类：
1.在流式细胞术中的分类：
●正面散射gating cell：用于捕捉正面散射光信号，帮
助区分细胞和颗粒。

●侧向散射gating cell：用于捕捉侧向散射光信号，帮
助评估细胞的大小和复杂性。

2.在免疫学中的分类：
●CD4 gating cell：用于分析CD4阳性和CD4阴性淋巴细
胞。

●CD8 gating cell：用于分析CD8阳性和CD8阴性淋巴细
胞。

3.在细胞周期研究中的分类：
●G1 gating cell：用于分析处于G1期的细胞。

●S phase gating cell：用于分析处于S期的细胞。

●G2/M gating cell：用于分析处于G2/M期的细胞。

4.在细胞凋亡研究中的分类：
●早期凋亡gating cell：用于分析处于早期凋亡阶段的
细胞。

晚期凋亡gating cell：用于分析处于晚期凋亡阶段的细胞。

这些分类仅仅是一些例子，具体的"Gating cell" 分类会根据具体实验或研究的需要而有所不同。

在流式细胞术等领域，"gating" 是一个重要的步骤，用于选择或排除特定的细胞亚群，以便更精确地分析和研究。

石墨烯衍生物在口服给药和口腔生物学的研究进展周瑞静;廖敏;陈昭西;毛茜潆;聂敏【摘要】石墨烯及其衍生物是目前各领域研究最热门的碳材料之一.这种碳材料虽然研究的历史很短,但由于其非凡的物理化学性能以及生物相容性,已成为生物医学应用的潜力材料.本文概述了石墨烯的性质和制备,重点介绍了石墨烯衍生物在口腔生物学方面的最新进展.%Graphene and its derivatives have been attracting considerable interest worldwide due to its remarkable physical and chem?ical properties as well as alluring biocompatibility. As a new kind of carbon material,graphene has a number of potential medical appli?cations in many fields. In this review,efforts are made to expect in elucidating the synthesis and characterization of graphene deriva?tives,with emphasis on their latest developments in oral biology.【期刊名称】《口腔医学》【年(卷),期】2017(037)010【总页数】3页(P954-956)【关键词】石墨烯衍生物;生物检测;光热治疗;抑菌;药物传递系统【作者】周瑞静;廖敏;陈昭西;毛茜潆;聂敏【作者单位】武汉大学口腔医院牙体牙髓科一科,湖北武汉430079;武汉大学口腔医院牙体牙髓科一科,湖北武汉430079;武汉大学口腔医院牙体牙髓科一科,湖北武汉430079;武汉大学口腔医院牙体牙髓科一科,湖北武汉430079;武汉大学口腔医院牙体牙髓科一科,湖北武汉430079【正文语种】中文【中图分类】R78;R393石墨烯(graphene)，作为碳的一种同素异形体，在2004年首次被Geim和Novoselov等通过一种极为简单的胶带纸剥离方法成功制备[1]，因此获得了2010年诺贝尔物理学奖。

癌基因（oncogene）：通常表示原癌基因（proto oncogene）的突变体，这些基因编码的蛋白使细胞的生长失去控制，并转变成癌细胞，故称癌基因。

氨酰-tRNA合成酶（aminoacyl tRNA synthetase）：将氨基酸和对应的tRNA的3′端进行共价连接形成氨酰-tRNA的酶。

不同的氨基酸被不同的氨酰－tRNA合成酶所识别。

暗反应（light independent reaction）：光合作用中的另外一种反应，又称碳同化反应（carbon assimilation reaction)。

该反应利用光反应生成的ATP和NADPH中的能量，固定CO2生成糖类。

白介素-1β转换酶（interleukin-1β converting enzyme，ICE）：Caspase-1，Caspase家族成员之一，线虫Ced3在哺乳动物细胞中的同源蛋白，催化白介素-1β前体的剪切成熟过程。

半桥粒（hemidesmosome）：位于上皮细胞基底面的一种特化的黏着结构，将细胞黏附到基膜上。

胞间连丝（plasmodesma plasmodesma）：相邻植物细胞之间的联系通道，直接穿过两相邻细胞的细胞壁。

胞内体（endosome）：动物细胞内由膜包围的细胞器，其作用是转运由胞吞作用新摄取的物质到溶酶体被降解。

胞内体被认为是胞吞物质的主要分选站。

胞吐作用（exocytosis）：携带有内容物的膜泡与质膜融合，将内容物释放到胞外的过程。

胞吞作用（endocytosis）：通过质膜内陷形成膜泡，将细胞外或细胞质膜表面的物质包裹到膜泡内并转运到细胞内（胞饮和吞噬作用）。

胞外基质（extracellular matrix）：分布于细胞外空间、由细胞分泌的蛋白质和多糖所构成的网络结构，如胶原和蛋白聚糖等，在决定细胞形状和活性的过程中起着一种整合作用。

胞质动力蛋白（cytoplasmic dynein）：由多条肽链组成的巨型马达蛋白，利用ATP水解释放的能量将膜泡或膜性细胞器等沿微管朝负极转运。

当进行工艺放大时，“细胞”都在谈论什么？关键词：P/V；Mixing time；K L a；CO2 stripping细胞培养的小试工艺确定后，如何保证规模扩大后细胞生长、产品产量及质量的稳定性是一个新的考验。

简单的说，工艺放大主要是保证细胞所处的环境不变，那么工艺放大过程中“细胞”在意的主要有哪些参数？影响细胞环境的参数主要有：P/V、Mixing time、K L a和CO2 stripping。

工艺放大时常会根据这些参数进行放大，但有时不仅依靠单一因素进行放大，还会将两个或多个因素结合起来进行放大。

P/V单位体积功耗比（P/V，Power / V olume），一定程度表示混合程度，P/V值直接影响物料混合及传质。

P/V分为平均P/V和最大P/V，平均P/V可以测定反应器的总输入功率，最大局部P/V表现最高比能量耗散速率。

工艺放大时P/V可以单独使用，也可以与k L a、vvm一起使用。

P/V计算公式如下：其中，P o：功率指数；ρ：液体密度（kg/m3）；N：搅拌速率（s-1）；Di：搅不同规模反应器参考参数（图表来源：A-Mab Cass Study）Mixing time表征体系达到均质所需的时间，通过体系中添加一种标记物（如，盐、染料、放射性材料等）时，测定其达到95%均质状态所需的时间，即为混合时间。

为使测量模型更适应于细胞培养环境，推荐使用NaOH作为标记物，测量过程中采用两个pH电极测两个不同点的pH值，pH安装及NaOH添加位置如下图。

电极安装及NaOH添加位置（图表来源：Scale-Up Analysis for a CHO Cell CultureProcessin Large-Scale Bioreactors）下面图A表示标记物NaOH添加后，通过pH（上面和下面的探头）的变化表示体系从均质变为非均质，再变为均质的过程。

图B为混合时间的计算方法，t=(t1+t2)/2。

ATCC ® Number:CRL-2539™Price: $279.00 Designations:4T1 Depositors: BA Pulaski Biosafety Level:1 Shipped:frozen Medium & Serum:See Propagation GrowthProperties:adherent Organism: Mus musculus deposited as mouseMorphology: epithelialSource: Organ: mammary glandStrain: BALB/cfC3HDisease: tumor Permits/Forms: In addition to the MTA mentioned above, other ATCC and/or regulatory permits may be required for the transfer of this ATCC material. Anyone purchasing ATCCmaterial is ultimately responsible for obtaining the permits. Please click here forinformation regarding the specific requirements for shipment to your location.Tumorigenic: Yes Comments: 4T1 is a 6-thioguanine resistant cell line selected from the 410.4 tumor withoutmutagen treatment.When injected into BALB/c mice, 4T1 spontaneously produces highly metastatictumors that can metastasize to the lung, liver, lymph nodes and brain while theprimary tumor is growing in situ.The primary tumor does not have to be removed to induce metastatic growth.The tumor growth and metastatic spread of 4T1 cells in BALB/c mice veryclosely mimic human breast cancer. This tumor is an animal model for stage IV human breast cancer.4T1-induced tumors can be used as a post-operative model as well as a non-surgical model because the 4T1-induced tumor metastasizes spontaneously inboth models with similar kinetics.Because 4T1 is resistant to 6-thioquanine, micro-metastatic cells (as few as 1)can be detected in many distant site organs with better accuracy that mosttumor models. There is no need to count nodules or weight target organs.Propagation: ATCC complete growth medium: The base medium for this cell line is ATCC-formulated RPMI-1640 Medium, Catalog No. 30-2001. To make the completegrowth medium, add the following components to the base medium: fetal bovineserum to a final concentration of 10%. Temperature: 37.0°CAtmosphere: air, 95%; carbon dioxide (CO2), 5%Preservation: Freeze medium: Complete growth medium 95%; DMSO, 5%Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperatureReferences: 49687: Pulaski BA, et al. Immunotherapy with vaccines combining MHC class II/CD80+ tumor cells with interleukin-12 reduces established metastatic diseaseand stimulates immune effectors and monokine induced by interferon gamma.Cancer Immunol. Immunother. 49: 34-45, 2000. PubMed: 1078286449688: Pulaski BA, Ostrand-Rosenberg S. Reduction of established spontaneousmammary carcinoma metastases following immunotherapy with majorhistocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. CancerRes. 58: 1486-1493, 1998. PubMed: 953725249689: Pulaski BA, et al. Cooperativity of Staphylococcal aureus enterotoxin Bsuperantigen, major histocompatibility complex class II, and CD80 forimmunotherapy of advanced spontaneous metastases in a clinically relevantpostoperative mouse breast cancer model. Cancer Res. 60: 2710-2715, 2000.PubMed: 1082514549690: Aslakson CJ, Miller FR. Selective events in the metastatic processdefined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mousemammary tumor. Cancer Res. 52: 1399-1405, 1992. PubMed: 1540948ATCC®号码：CRL-2539™价格: $279.00名称：4T1储户：BA普拉斯基生物安全级别：1出货：冻结中等及血清：见传播生长特性：贴生物：小家鼠沉积鼠标形态：上皮资料来源：器官：乳腺株：BALB / cfC3H疾病：肿瘤证/表格：除了在MTA上面提到的，其它ATCC和/或可能需要此ATCC材料的传送管制许可证。

CCID50 (cell culture infective dose 50%) 细胞培养半数感染量。

主要用于检测病毒滴度。

将病毒按照倍比稀释或梯度稀释后接种细胞(每个稀释度接种4孔或6孔细胞)，观察细胞CPE,通过Reed-Muench法计算CCID50，得到病毒滴度。

这种方法主要用于测定病毒毒力滴度用.有了这个标准，就可以用100*CCID50或200*CCID50等,往下做一系列跟病毒有关的其他定量的实验,如中和实验中抗体效价测定等。

更具体的操作方法计算和分析,参见病毒学书本，动物病毒学(殷震,刘景华主编)第二版上也有的。

S.O.P.2: ESTIMATION OF VIABLE MYCOPLASMACONTENT OF CBPP VACCINES(Microtitration Method)The test for the determination of viable Mycoplasma content of CBPP vaccines should be carried out on at least three vials of each freeze-dried or three bottles of each liquid vaccine batch.针对于每批冻干或每批液体疫苗，CBPP疫苗中支原体活力测定实验应该至少测试三小瓶中。

The Test should be performed in parallel with a control vaccine preparation. For each test result to be valid the tire of the control vaccine preparation should not exceed 2 times the standard deviation of the calculated reference titre. Each titration shall be based on the use of ten-fold dilution series of the reconstituted vaccine and not less than 10 wells per dilution.测试应该与疫苗准备同时进行。

CCID50 (cell culture infective dose 50%) 细胞培养半数感染量。

主要用于检测病毒滴度。

将病毒按照倍比稀释或梯度稀释后接种细胞(每个稀释度接种4孔或6孔细胞)，观察细胞CPE,通过Reed-Muench法计算CCID50，得到病毒滴度。

这种方法主要用于测定病毒毒力滴度用.有了这个标准，就可以用100*CCID50或200*CCID50等,往下做一系列跟病毒有关的其他定量的实验,如中和实验中抗体效价测定等。

更具体的操作方法计算和分析,参见病毒学书本，动物病毒学(殷震,刘景华主编)第二版上也有的。

S.O.P.2: ESTIMATION OF VIABLE MYCOPLASMACONTENT OF CBPP VACCINES(Microtitration Method)The test for the determination of viable Mycoplasma content of CBPP vaccines should be carried out on at least three vials of each freeze-dried or three bottles of each liquid vaccine batch.针对于每批冻干或每批液体疫苗，CBPP疫苗中支原体活力测定实验应该至少测试三小瓶中。

The Test should be performed in parallel with a control vaccine preparation. For each test result to be valid the tire of the control vaccine preparation should not exceed 2 times the standard deviation of the calculated reference titre. Each titration shall be based on the use of ten-fold dilution series of the reconstituted vaccine and not less than 10 wells per dilution.测试应该与疫苗准备同时进行。