第三章 发酵液的预处理
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发酵液的处理
影响絮凝效果的因素：
1) 絮凝剂浓度
2) 絮凝剂分子量
3) 絮凝剂类型
4) 溶液的pH
5) 搅拌速度和时间
6) 助凝剂
A. 絮凝剂浓度
浓度增加有助于架桥充分，但是过多的加量会引起吸 附饱和，在胶粒上形成覆盖层而产生再次稳定现象。
B. 高分子絮凝剂分子量
分子量提高、链增长，可使架桥效果明显，但分子量 不能超过一定的限度，因为随分子量提高，高分子絮凝剂
发酵液的预处理和固液分离方法
山东农业大学 孙中涛
预处理和固液分离的目的：
1、分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒(细胞碎片、核酸 和蛋白质的沉淀物)。
2、除去部分可溶性杂质。
3、改变滤液的性质（降低粘度等），以利于后继操作。
总策略： 1、胞外产物：应尽可能转移到液相中，常 用调pH至酸性或碱性的方法来达到。 2、胞内产物：首先收集细胞、破壁，生化物 质释放到液相，再分离细胞碎片。 3、通常，以含生化物质的液相为出发点，进 行后继操作。
使蛋白质变性的其它办法：
大幅度改变pH，加酒精、丙酮等有机溶剂 或表面活性剂等。
在抗生素生产中，常将发酵液pH调至偏酸性 范围(pH2—3)或较碱性范围(pH 8—9）使蛋白质 凝固，一般以酸性下除去的蛋白质较多。
加有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数 量较少的场合。
利用吸附作用除去蛋白质：
举例：
3、采用酶制剂分解黏性物质
如果发酵液中有不溶解的多糖存在，则最好用酶将它转化
为单糖，以提高过滤速度。 例如：万古霉素用淀粉作培养基，加入淀粉酶后，能使过 滤速度加快。
4、染菌发酵液的处理方法
混凝：
阳离子型高分子絮凝剂对带负电菌体或蛋白质来说，同时 具有降低粒子排斥电位和产生吸附架桥的双重机理，所以可以 单独使用， 非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，主要通过分子间引力 和氢键产生吸附架桥，常与无机电解质凝聚剂搭配使用。 首先加入无机电解质，使悬浮粒子脱稳而凝聚，然后，再 加入絮凝剂。凝聚作用为絮凝剂的架桥创造了良好的条件，从 而，提高了絮凝效果。 这种包括凝聚和絮凝机理的过程，常称为混凝。
发酵液预处理及固液分离方法
51
转筒下部浸入滤浆槽中，浸没角约90°-130°，圆筒缓 慢旋转时(转速约0.5-2r／min)，筒内每一空间相继与分 配头中的3个室相通，可顺序进行过滤、洗涤、吸干、吹松、 卸饼等项操作。即整个圆筒分为过滤区、洗涤及脱水区， 卸渣及再生区3个区域。
52
转筒真空过滤机
主要适用霉菌发酵液，对菌体 细小、黏度大铺助滤剂。
29
（一） 过 滤 filtration
借助于过滤介质，在一定的压力差作用下， 使 悬浮液中的液体通过介质的孔道，而固体颗粒被 截留在介质上，从而实现固液分离的单元操作。
30
1、滤饼过滤： 介质：滤布，滤饼达到一定厚度起过滤作用。 适用于：固体含量>0.1g/100ml
31
过滤推动力：
• 悬浮液自身压强差、重力 • 悬浮液表面加压 • 过滤介质下方抽真空 • 离心力
18
发酵液的预处理和固液分离技术
二 预处理-降低发酵液粘度
方法
提高温度 －确保目的产物稳定性
加水稀释－过滤速度需提高稀释 数倍以上
三 预处理-调节pH
调节发酵液的pH到蛋白质的等电点是除去蛋 白质的有效方法。
影响离子型絮凝剂的电离度。
20
六 预处理-加入助滤剂
例硅藻土、淀粉、活性 炭、石英砂、石棉粉、 纤维素、白土等。
对于滤饼阻力较大的物料适应 能力较差。
53
带式真空过滤机
• 带式真空过滤机（是自动连续运转、并能按工 艺要求进行无级调速以及操作方便和动力消耗 低的一种新型高效的脱水设备。
54
带式真空过滤机流程
• 1、进料→过滤→滤饼洗涤→吸干→卸料→滤布清洗连 续进行。 2、真空过滤盘分段设计，可满足不同物料过滤、洗涤 、吸干的工艺要求，滤带运行速度采用变频无级调速， 对不同物料有广泛的适应性。
转筒下部浸入滤浆槽中，浸没角约90°-130°，圆筒缓 慢旋转时(转速约0.5-2r／min)，筒内每一空间相继与分 配头中的3个室相通，可顺序进行过滤、洗涤、吸干、吹松、 卸饼等项操作。即整个圆筒分为过滤区、洗涤及脱水区， 卸渣及再生区3个区域。
52
转筒真空过滤机
主要适用霉菌发酵液，对菌体 细小、黏度大铺助滤剂。
29
（一） 过 滤 filtration
借助于过滤介质，在一定的压力差作用下， 使 悬浮液中的液体通过介质的孔道，而固体颗粒被 截留在介质上，从而实现固液分离的单元操作。
30
1、滤饼过滤： 介质：滤布，滤饼达到一定厚度起过滤作用。 适用于：固体含量>0.1g/100ml
31
过滤推动力：
• 悬浮液自身压强差、重力 • 悬浮液表面加压 • 过滤介质下方抽真空 • 离心力
18
发酵液的预处理和固液分离技术
二 预处理-降低发酵液粘度
方法
提高温度 －确保目的产物稳定性
加水稀释－过滤速度需提高稀释 数倍以上
三 预处理-调节pH
调节发酵液的pH到蛋白质的等电点是除去蛋 白质的有效方法。
影响离子型絮凝剂的电离度。
20
六 预处理-加入助滤剂
例硅藻土、淀粉、活性 炭、石英砂、石棉粉、 纤维素、白土等。
对于滤饼阻力较大的物料适应 能力较差。
53
带式真空过滤机
• 带式真空过滤机（是自动连续运转、并能按工 艺要求进行无级调速以及操作方便和动力消耗 低的一种新型高效的脱水设备。
54
带式真空过滤机流程
• 1、进料→过滤→滤饼洗涤→吸干→卸料→滤布清洗连 续进行。 2、真空过滤盘分段设计，可满足不同物料过滤、洗涤 、吸干的工艺要求，滤带运行速度采用变频无级调速， 对不同物料有广泛的适应性。
发酵液预处理与固液分离
发酵液的预处理和固液分离方法综述摘要：从微生物发酵液或细胞培养液中提取生化物质的第一个重要步骤，就是预处理和固液分离。
其目的不仅在于分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒，还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于后续的各步操作。
关键字：预处理固液分离正文：一、发酵液预处理微生物发酵和细胞培养的目标产物主要有菌体、胞内产物和胞外产物三类物质。
从发酵液和细胞培养液中提取所需的生化物质，第一步就需进行预处理，以便于固液分离，使代谢产物后续的分离纯化工序顺利进行。
其原因有三个方面：首先，发酵液多为悬浮液，粘度大，为非牛顿型流体，不易过滤，而所需的生化物质往往只有分布在液相，才能有效地提纯。
并且，在有些发酵液中，菌体自溶，核酸、蛋白质及其他有机粘性物质这三类物质会造成滤液混浊、滤速极慢，必须设法增大悬浮物的颗粒直径，提高沉降速度，以利于过滤；其次，目标产物在发酵液中的浓度通常较低；此外，发酵液的成分复杂，大量的菌丝体、菌种代谢物和剩余培养基会对提取造成很大的影响。
所以，对发酵液进行适当的预处理，从而分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒（如细胞碎片、核酸以及蛋白质的沉淀物），并除去部分可溶性杂质和改变发酵液的过滤性能，是生化物质分离纯化过程中必不可少的首要步骤。
预处理方法要根据发酵产品、所用菌种和发酵液特性来选择。
大多数发酵产品存于发酵液中，少数存于菌体中，而发酵液和菌体中都有产物存在的情形也比较常见。
如果目的产物是胞外产物，则通过离心或过滤实现固液分离，使其转入液相；而对于胞内产物而言，收集细胞是预处理的首要一步。
细胞经破碎或整体细胞萃取使目的产物释放，转入液相，再进行细胞碎片的分离。
如果所需的产物为细胞，离心或过滤所得固相经干燥等过程就可得到菌体。
图1－1为生化产品分离纯化的一般步骤，图中虚线以上为预处理过程示意图。
图1－1 生化产品分离纯化的一般步骤【1】1.1 预处理简述发酵液经过预处理，一些物理性质会改变，从悬浮液中分离固形物的速度随之提高，过滤操作更易进行；在预处理过程中，产物大多转移进入易于后处理的相中（一般为液相）。
发酵液预处理
直接结晶：在2次乙酸丁酯萃取液 中加醋酸钠－乙醇溶液反应，得到 结晶钠盐。加醋酸钾－乙醇溶液， 得到青霉素钾盐。共沸蒸馏结晶： 萃取液，再用0.5 M NaOH萃取， pH6.4-4.8下得到钠盐水浓缩液。加 2.5倍体积丁醇，16－26℃，0.671.3KPa下蒸馏。水和丁醇形成共沸 物而蒸出。钠盐结晶析出。结晶经 过洗涤、干燥后，得到青霉素产品。
固液分离
过滤 发酵液在萃取之前需预处理，发酵液加 少量絮凝剂沉淀蛋白，然后经真空转鼓过 滤或板框过滤，除掉菌丝体及部分蛋白。 青霉素易降解，发酵液及滤液应冷至10 ℃以下，过滤收率一般90%左右。
（1）菌丝体粗长10µ m，采用鼓式真空过滤机过滤，滤渣 形成紧密饼状，容易从滤布上刮下。滤液pH6.27-7.2，蛋 白质含量0.05-0.2%。需要进一步除去蛋白质。 （2）改善过滤和除去蛋白质的措施：硫酸调节pH4.5-5.0， 加入0.07%溴代十五烷吡啶PPB，0.7%硅藻土为助滤剂。 再通过板框式过滤机。滤液澄清透明，进行萃取。
青霉素发酵液预 处理与固液分离
第三组：宫鹏利 孙晓盼 段玉兰
侯喆 孟佳 赵秀青 苗树峰
发酵液的基本特性
• 产物浓度低
• 具有极性
• 黏大
• 表面张力大
• 性质不稳定
预处理的目的
⑴改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分离 固形物的速度，提高固液分离器的效率； ⑵尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数 是液相）； ⑶去除发酵液中的部分杂质，以利于后续各步操 作。
加黄血盐及硫酸锌，则前者有利于去 除铁离子，后者有利于凝固蛋白质。 此外，两者还有协同作用。他们所产 生的复盐对蛋白质有吸附作用。 2K4Fe(CN)6 + 3ZnSO4 K2Zn[Fe(CN)6]2 + 2Na+ 为了有效的去除发酵液中的蛋白质， 需加入絮凝剂。絮凝剂是一种能溶于 水的高分子化合物。含有很多离子化 基团（如—NH2，—COOH，— OH）。
发酵液预处理
1.发酵液预处理过程:对发酵液加热到所需温度使杂蛋白质变性凝固而沉淀分别.也可以用分散或絮凝的方法是小菌体,细胞,细胞的碎片以及杂蛋白质等胶体离子沉降去除.2.发酵液的基本特性:产物浓度低.具有极性.粘度大.表面张力大.性质不稳定.3.预处理的目的:①.转变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分别固形物的速度,提高固液分别器的效率②.尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）③.去除发酵液中的部分杂质，以利于后续各步骤的操作.4.发酵液预处理的方法:①加热②调整PH值③分散和絮凝④使用惰性助滤剂⑤使用反应剂二固液分别1.方法:①重力沉降②浮透（通气产生气泡,使固体附着在气泡表面除去,用于固液比重差小,直径5-30um颗粒的分别,污水处理.③旋液分别（霉菌和放线菌为丝状菌,体形较大,发酵液采纳过滤的方法;细菌和酵母菌为单细胞,体形较小,其发酵液采纳高速离心分别，如对发酵液采纳预处理,也可用过滤进行固液分别.④介质过滤和离心,工业上比较常用.2.过滤①澄清过滤:过滤介质为硅藻土,砂,塑料颗粒等,适合于固体含量少于0.Ig/lOOml,颗粒直径在5-100um的悬浮液的过漉分别如:河水,麦芽汁,酒类,饮料的澄清.②滤饼过滤:过漉介质为滤布,包括自然或合成纤维织布,金属织布,玻璃纤维纸,合成纤维等无纺布,适合于固体含量大于0.lg∕100ml的悬浮液的过滤分别3常用过滤设施①转鼓真空过滤工艺转鼓真空过滤机的转鼓过滤外壁掩盖有金属丝网,网上掩盖有滤布等过滤介质.转鼓内部区域分了若干独立的扇形区,各有不同的操作功能.该设施主要适用范围:颗粒不太细,粘性不太大的液体.对于青霉素发酵老说,发酵液相对粘稠,因此发酵液质量的优劣,对转鼓处理速度有着明确的影响.转鼓过滤存在使用范围窄,处理力量低的问题.•希得艮空过廉根■作示索②板式过滤工艺原理:依靠过滤推动力与过滤介质两侧的压力差,致使固体积累在滤材上并架桥形成滤饼层,使滤液与不溶的杂质分别.板式过滤机的优点是:结构简洁,制造简洁,设施紧凑,过漉面积大而占地面积小,操作压力高,对各种物料适应力量强,缺点是间歇操作,劳动强度大,生产效率低,适用于间歇操作的场合.①装好过漉板框②检查料浆槽的进出口阀门是否关闭③调好料浆④打开料浆槽的进口和排气阀门,启动搅拌机,料浆槽装满料浆后,关闭料浆槽的进口和排气阀门⑤启动空压机待压力达到指定值后,即可打开进气阀进行测定⑥测定完后,清洗设施,关好电源.③其他预处理的工艺近期消失的超滤膜工艺,由于产生的滤液质量好不断被青霉素生产工艺所采纳,但是使用超滤膜会产生大量不宜处理的菌丝水,不宜进行环境处理,同时能耗较高,给生产成本带来较大的压力,在环保压力不断加大的现实状况下,超滤膜工艺被生产企业渐渐放弃,.而传统的板框处理,转鼓过滤工艺,由于受发酵液性质和发酵液影响,存在速度慢等问题,其生产力量受到了肯定的限制,需要改进生产工艺以适应生产的要求,全自动过滤机由于处理效率高,人工劳动强度小被生产企业所用.4 .其他过滤分别方法①切向流水过滤又称错流过滤交叉过滤和十字流过滤,是一种维持恒压下高速过滤的技术,其操作特点是使悬浮液在过滤介质表面作切向流淌,利于流淌的剪切作用将过滤介质表面的固体（滤饼）移走.②双水相萃取向水相中加入溶于水的某些高分子化合物（如:葡萄糖,聚乙二醉）后,形成密度不同的两相,轻相中富含某种高分子化合物,重相中富含盐类或另一种高分子化合物从而达到分别和提纯某种高分子化合物的目的.③吸附法向细胞碎片悬浮液中加入某种固体吸附剂,或者用细胞碎片悬浮液通过装有吸附剂的固定床,即可达到除去细胞碎片的目的,主要的目的是很难选择合适的吸附剂,以保证目的产物不被吸附而损失.5 .预处理及固液分别技术应用实例以链霉菌发酵液的预处理及固液分别技术为例,其工艺过程如下：1-2倍量水稀释发酵液,pH2∙8∙32加热70-75 酸化处理发酵液冷却,过滤, 板框过滤或离心分别 去提取。
发酵液预处理和固液分离
1.2.3 常用的凝聚剂与絮凝剂
➢ 凝聚剂
• 铝盐，铁盐，钙盐，锌盐
➢ 絮凝剂
• 阳离子型：阳离子聚丙烯酰胺，聚丙烯酸二烷基胺乙酯 ，聚二烯丙基四胺盐。
• 阴离子型：聚丙烯酸钠，聚苯乙烯磺酸，木质素磺酸盐 • 非离子型：聚氧乙烯 • 无机高分子类：聚合铝盐，聚合铁盐 • 天然类：壳聚糖，葡聚糖 • 微生物类
➢ 预处理的目的 • 改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固 液分离器的效率 • 尽可能使物质转入便于后续处理的某一相中 • 去除发酵液中杂质，利于后续各步操作
➢ 预处理的方法 • 加热-加速聚集，去除某些蛋白质 • 调pH-促进聚集作用 • 凝聚和絮凝-增大颗粒有效尺寸，加快沉降速率
2.3.1 板框压滤机
➢ 自动板框过滤机：
是一种较新型的压滤设备，板框的拆装，滤渣的脱落卸出和滤布 的清洗等操作都能自动进行，大大缩短了非生产的辅助时间和减 轻了劳动强度。
板框操作实例-进料
板框操作实例-卸料
2.3.2 鼓式真空过滤机
鼓式真空过滤机能连续操作，并能实现自动化控制，但是压差较 小，主要适用于霉菌发酵液的过滤。而对菌体较细或粘稠的发酵 液不太适用。
螺旋式
卧式
• 含固量较多 发酵液的主要 分离方式 • 操作温度可 达300度 • 胰岛素，细 胞色素，胰酶
发酵液的预处理
1 发酵液的预处理
➢主要杂质预处理 ➢凝聚与絮凝
2 发酵液固液分离
➢影响固液分离的因素 ➢过滤 ➢固液分离器
3 全发酵液提取
3 全发酵液提取
扩张床技术
两水相技术
膜技术
• 相当于过滤、浓缩和吸附的综合效果 • 连接的配基容量需求大 • 膜污染问题严重
发酵液的预处理
发酵液的预处理1 加水稀释法和加热法加水稀释法能降低液体粘度，但会增加悬浮液的体积，加大后继过程的处理任务。
而且，单从过滤操作看，稀释后过滤速率提高的百分比必须大于加水比才能认为有效，即若加水一倍，则稀释后液体的粘度必须下降50％以上才能有效提高过滤速率。
加热是发酵液预处理最简单最常用的方法。
加热可有效降低液体粘度，提高过滤速率。
同时，在适当温度和受热时间下可使蛋白质凝聚，形成较大颗粒的凝聚物，进一步改善了发酵液的过滤特性。
对于粘度较高的发酵液，稀释或者加热可以降低发酵液黏度，有利于输送和过滤等后续操作。
2 离心法国内在这方面的报道,主要反映了高速离心能耗大、设备昂贵，因而得不到推广应用。
国内有些厂家仿效国外的做法, 采用高速蝶片式喷嘴离心机分离菌体, 虽对谷氨酸菌体的除去有一定效果, 但对菌丝较轻细的肌苷菌体至今未取得满意的结果且设备价格昂贵。
3 絮凝和凝聚及混凝方法絮凝预处理能显著加快发酵液中固体颗粒的沉降，提高过滤速度。
李凡锋等处理1，3-丙二醇发酵液后，其中絮凝样的滤饼湿基、干基重量分别比对照样增加了41.13%、51.88%。
江龙法等采用壳聚糖作为絮凝剂对L - 乳酸发酵液进行预处理,取得了较好的结果。
江龙法等用壳聚糖作絮凝剂处理谷氨酸发酵液，经处理后的发酵液菌体减少95 %以上,谷氨酸浓度没有降低。
周荣清等的研究证明:透明质酸发酵液经絮凝预处理后,不仅可以大大改善发酵液的固液分离效果,同时其滤清液的纯度亦有一定幅度的提高,在超滤过程中污染程度明显减少,渗透通量增加。
4 调节PH值调节pH值可以改善发酵液吸附性质和使蛋白变性。
对于加入离子型絮凝剂的发酵液，调节pH可改变絮凝剂的电离度，从而改变分子链的伸展状态。
郝健等[7]的研究表明，pH越低，相同操作电压下工作电流越大，脱盐操作时间也越短，发酵液初始pH 调至6 左右为宜。
李向平等以壳聚糖为絮凝剂进行了单因素絮凝实验，结果表明pH值和絮凝剂用量对絮凝效果影响很大。
第三章发酵液的预处理与菌体的回收
6
2 悬浮液的预处理
预处理的目的 促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率
改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，
降低液体黏度等；
尽可能使产物转入便于后处理的某一相中（多数为液相）； 相对纯化，去除发酵液中部分杂质（高价无机离子和杂蛋白 质）， 便于后续各部操作；
发酵产物浓度较低，大多为1-10%; 悬浮物颗粒小，细胞的相对密度与培养液相似; 可压缩性; 液相粘度大，大多为非牛顿型流体； 悬浮状态稳定：双电层、水化膜、布朗运动
5
为何要对发酵液进行预处理？
固液分离方法主要是过滤和离心。
对于细菌及某些放线菌，菌体细小，液体粘 度大，不能直接过滤;若用高速离心，能耗很 大，设备昂贵 ;若用膜分离技术 ( 如微滤 ) 易产 生膜污染，通量降低。 发酵液中由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其 它有机粘性物质的存在也会影响固液分离。
35
3.2 过滤的理论基础
要积分方程式(2-10), 就要建立压强、滤 层厚度与滤液体积之间的关系。 1、滤层厚度与滤液体积之间的关系 当悬浮液进入过滤机时，由于过滤介质 的筛分作用使悬浮液分开成两部分 —— 滤饼和滤液V。设所获得滤饼体积与滤液 体积之比为v，截面为A。则有 (2-11)
铁、氯化锌、硫酸锌、硫酸镁等 金属氧化物类 氢氧化铝、氢氧化铁、氢氧化钙或石灰 等 聚合无机盐类 聚合铝、聚合铁等
之一；微生物絮凝剂 阴离子型 聚丙烯酸纳、聚苯乙烯磺酸
常用絮凝剂 聚丙烯酰胺经不同改性可成为下述三种类型
阳离子型 聚丙烯酸二烷基胺乙酯、聚二烯丙基四胺盐 非离子型 聚氧化乙烯
第三章-发酵液的预处理2-3
通过电解质的加入促进原始溶液的凝聚和絮凝， 试剂有简单的电解质、酸、碱、合成的聚合电 解质。
2021/2/5
• 凝聚与絮凝处理过程就是将化学药剂预先投加到 悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子 的分散状态，破坏其稳定性，使其聚集起来,增大 体积以便固液分离。
• 凝聚和絮凝技术常用于菌体细小而且黏度大的发 酵液的预处理中。
2021/2/5
Filtrate Volume, cm3
pH 2.8
pH 3.8 600
pH 4.2 400 200 pH 4.6
0 0 6 12 18 Time,minutes
The effect on filtrate volume of pH
2021/2/5
4、加入助滤剂（filter aids）
如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025%的淀 粉酶，搅拌30min后，再加2.5%硅藻土助滤剂，可提高过滤 效率5倍。
2021/2/5
第二节 发酵液的相对纯化
一、发酵液中的杂质
1、高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe3+） 在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质 的交换容量。
2、杂蛋白 常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞。 采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量 和吸附能力。 有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化。
2021/2/5
二、预处理目的
⑴改变发酵液固体粒子物理性质，如增大悬浮液 中固体粒子的尺寸，加快固体粒子的沉降速度。
⑵相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无 机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作。
⑶尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数 是液相）；四环素类抗生素、链霉素。
2021/2/5
• 凝聚与絮凝处理过程就是将化学药剂预先投加到 悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子 的分散状态，破坏其稳定性，使其聚集起来,增大 体积以便固液分离。
• 凝聚和絮凝技术常用于菌体细小而且黏度大的发 酵液的预处理中。
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Filtrate Volume, cm3
pH 2.8
pH 3.8 600
pH 4.2 400 200 pH 4.6
0 0 6 12 18 Time,minutes
The effect on filtrate volume of pH
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4、加入助滤剂（filter aids）
如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025%的淀 粉酶，搅拌30min后，再加2.5%硅藻土助滤剂，可提高过滤 效率5倍。
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第二节 发酵液的相对纯化
一、发酵液中的杂质
1、高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe3+） 在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质 的交换容量。
2、杂蛋白 常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞。 采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量 和吸附能力。 有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化。
2021/2/5
二、预处理目的
⑴改变发酵液固体粒子物理性质，如增大悬浮液 中固体粒子的尺寸，加快固体粒子的沉降速度。
⑵相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无 机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作。
⑶尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数 是液相）；四环素类抗生素、链霉素。
【3】 发酵液预处理
过滤介质
• 促使滤饼的形成，并成为滤饼的支撑物 • 种类 织物介质 粒状介质 多孔固体介质
• 粒状、多空固体介质 填充型—硅藻土、砂、颗粒活 性炭、玻璃珠、塑料颗粒 成型颗粒滤层—烧结陶瓷、烧 结金属、金属丝 ·适用原料—固体含量 <0.1g/100mL
助滤
一种不可压缩的多孔微粒，使滤 饼疏松，从而增加滤速 硅藻土 活性炭 石棉 锯屑
——加热、变性试剂、表面活性剂、有机 溶剂、絮凝剂 依据机理： （1）水溶性蛋白质溶液是胶体体系 （2）蛋白质所带电荷因溶液pH改变而改变 （3）蛋白质溶液缓冲能力很强 （4）蛋白质具有热敏性
固液分离
• • • •
离心分离 过滤 双水相萃取 吸附
离心分离
借助离心机旋转所产生的离心力，根 据物质颗粒的沉降系数、质量、密度及 浮力等因子的不同，使物质进行分离 要根据欲分离物质、杂质的大小、密 度、特性等不同，选择适当离心机、离 心方法和离心条件
• 过滤介质—滤布 • 适用原料—固体含量>0.1g/100mL
• 过滤操作 过滤阶段 恒速过滤—初期 恒压过滤—后期 滤饼洗涤 滤饼干燥 滤饼卸除
板框压滤机
应用
• 液体的澄清 • 分离难以过滤的低浓度悬浮液或胶体悬浮液 • 分离液相粘度大或接近饱和状态的悬浮液
真空转鼓压滤机
• 配合硅藻土，适用于 霉菌发酵液的过滤
凝聚与絮凝
• 凝聚：指在电解质的作用下，由于胶粒之间 的双电层电排斥作用降低，电位下降，而使 胶体体系不稳定的现象
• 絮凝：指在某些高分子絮凝剂的存在下，基 于架桥作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程
凝聚
Al2(SO4)3·18H2O AlCl3·6H2O FeCl3·6H2O FeSO4·7H2O CaCO3 ZnSO4 MgCO3
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第三章发酵液的预处理教学基本要求：1. 掌握预处理的概念。
2. 熟悉固液分离方法。
时间安排：3学时。
教学形式：本章以讲授为主，中间部分进行部分提问，采用PPT课件讲课。
教学内容：通常发酵液和生物溶液是高粘度的和非牛顿流体，必须进行预处理。
一、预处理的目的：1、改变发酵液的理化性质：(黏度、颗粒、颗粒稳定性等)，固液分离速度，分离器分离效率。
2、目标产物转移其中一相(多数为液相)；。
3、去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作。
二、预处理的方法1、加热法：最简单和最廉价的处理方法。
破坏凝胶结构、降低液体黏度、加速聚集。
去蛋白。
2、调节悬浮液的PH值：方法简单有效、成本低廉。
适当的PH值促进聚集。
3、凝聚和絮凝：凝聚：破坏溶质胶体颗粒表面的双电层，破坏胶体系统的分散状态，使胶体粒子聚集的过程。
大小：1mm大小。
絮凝：在絮凝剂高分子聚合电解质的作用下，胶体颗粒和聚合电解质交连成网，形成10 mm大小的絮凝团过程。
絮凝剂主要起中和电荷、桥架和网络作用凝聚剂种类：无机盐类：Al2(SO4)3.18(H2O)，AlCl3.6(H2O)，FeCl3，ZnSO4，MgCO3金属氧化物：Al(OH)3、Fe(OH)3、Ca(OH)2、石灰等。
聚合无机盐：聚合铝、聚合铁等。
絮凝剂种类：阳离子型、阴离子型或非离子型天然聚合物：多糖类物质、海藻酸钠、明胶等人工合成聚合物：聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物、聚丙烯酸类等。
三、固液分离法类型：过滤、离心、重力沉降、气悬浮（一）过滤1概念：在一定的压力差下，将固液悬浮液通过一多孔性介质而实现固液分离的过程。
原理——筛分。
2、过滤介质无定形颗粒：颗粒活性炭、沙、无烟煤成形颗粒：烧结金属、烧结塑料非金属织物：尼龙、玻璃纤维金属织物：不锈钢丝网无纺品：纸、石棉3、助滤剂一种颗粒均匀、质地坚硬的粒状物质，用于扩大过滤表面的适应范围，减轻细小颗粒的快速挤压变形和过滤介质的堵塞。
使用方法：A、预涂层；B、按一定比率混合。
常用的助滤剂：硅藻土、膨胀珍珠岩、石棉、纤维素、未活化的炭、炉渣、重质碳酸钙，及它们的混合物等。
3、过滤类型常规过滤（死过滤）和错流过滤死过滤：当进料液的流动方向和膜的压力方向在相同时，我们称之为死过滤；水质比较好的情况下可以采用死过滤，此时能耗低，回收率极高。
错流过滤：当进料液的流动方向和膜的压力方向垂直时，我们称之为错流过滤；因为错流过滤平行于膜表面有一个回流，这个回流会有效地冲走膜表面的污染物，所以错流过滤允许进料液中可以有一定量的不溶解固体,颗粒粒径〈100微米，条件比死过滤宽松的多。
错流过滤的过滤收率高，滤液质量较好，还可以减少处理步骤。
4、过滤设备的分类根据推动力的不同可分为四类（a）重力过滤：自然过滤（b）加压过滤：板框过滤器、加压叶滤器、气压罐式连续压滤器（c）真空过滤：转鼓真空过滤器、圆盘真空过滤器、带式真空过滤器（d）离心过滤：离心过滤器5、过滤器的选择：滤液的澄清度颗粒大小的分布发酵液的黏度固体颗粒的浓度滤饼的干燥度滤饼的洗涤生产能力7、提高过滤设备过滤能力的途径①降低滤饼阻力：a.添加电解质、絮凝剂、凝固剂；悬浮固体粒子越大、硬度越高，则形成的滤饼的阻力系数越低。
实际中常使用高分子絮凝剂。
絮凝剂的分子很大，它的各个区段上具有特殊的吸附作用，它可以与悬浮的粒子起桥联作用，形成巨大的絮团。
b.助滤剂：在发酵醪中加入适当粒度的硅藻土，发酵醪中的细微粒子就可能附着在硅藻土粒子凹凸不平的表面，坚硬的硅藻土粒子就作为许多胶体粒子的载体，均匀地分布于滤饼之中，相应地改变了原悬浮液的滤饼结构，降低了滤饼的阻力系数。
②降低滤液粘度：发酵醪粘度是温度的指数函数。
一般来说，从常温升高液温，粘度明显下降，因此对非热敏性的液体，升高温度是降低粘度最简便而有效的措施。
③降低悬浮液中悬浮固体的浓度：过滤速度与单位体积醪液所形成的滤饼体积成反比④热处理：热处理能使蛋白质等胶体粒子变性凝固，使过滤速度大为提高，该法在污水处理中效果非常明显⑤提高压力差ΔP：在实际操作中，最忌一开始就加大ΔP ，这样就会在滤布表面形成一层紧密的滤饼层，使过滤速度很快就降下来。
原则上开始应在很低的ΔP下进行，ΔP的提高应缓慢逐步地调高，最适ΔP应根据实验确定（二）离心：固液分离：第一选择为过滤，第二选择离心分离。
1、定义：它是利用惯性离心力和物质的沉降系数或浮力密度的不同而进行的一项分离、浓缩或提炼操作。
原理——密度差2优缺点：(1) 优点：难过滤的发酵液：固体颗粒小、溶液粘度大、过滤速度慢、甚至不能过滤的悬浮液，以及忌用助滤剂、或助滤剂无效的悬浮液；(2) 缺点：分离得到的不是滤饼一样的半干物，而是浆状物；处理量小；设备复杂，价格贵，分离成本高。
3、离心分离的三种形式：A、离心沉降；B、离心过滤；C、密度梯度(超离心)。
4、离心沉降利用悬浮液或乳浊液中密度不同的组分在离心力场中迅速沉降分层，实现固液分离。
离心沉降的基础是固体的沉降。
(1) 离心分离因数Fr，(又称离心力强度)：离心力/重力加速度(g)的比值Fr 越大，越有利于分离意义：衡量离心设备的离心程度的重要技术参数，用于离心机的分类（常速离心机Fr < 3,000g、中速离心机Fr = 3,000 —5,0000g、高速离心机Fr>50000g、超速离心机Fr = 20,000 —1,000,000g）(2) 沉降式离心机种类：实验室用瓶式离心机工业用无孔转鼓离心机：管式、多室式、碟片式以及卧螺式(decanter)等。
5、离心过滤使悬浮液在离心力场作用下产生的离心力压力，作用在过滤介质上，使液体通过过滤介质成为滤液，而固体颗粒被截留在过滤介质表面，从而实现固液分离。
它兼有离心和过滤的双重作用，分离效率更高。
(1) 常见的离心过滤设备：间歇式：刮刀自动卸料、停机手动卸料。
连续式：活塞推料、振动卸料。
6、超离心法根据物质的沉降系数、质量和形状不同，应用强大的离心力，将混合物中各组分分离、浓缩、提纯的方法称为超离心法。
它在生物化学、分子生物学以及细胞生物学的发展中起着非常重要的作用。
应用超离心技术中的差速离心、等密度梯度离心等方法，已经成功的分离制取各种亚细胞物质、如线粒体、微粒体、溶酶体、肿瘤病毒等。
用5×105g以上的强大离心力，长时间的离心(如17h以上)，可获得具有生物活性的脱氧核糖核酸(DNA)、各种与蛋白质合成有关的酶系、各种信使核糖核酸(mRNA)和转移核糖核酸(tRNA)等，这为遗传工程、酶工程的发展提供了必需基础。
超离心法是现代生物技术领域研究中不可缺少的实验室分析和制备手段。
超速离心机：离心分离因数在100,000g以上的离心设备（1）制备性超离心：制备性超离心的主要目的是最大限度地从样品中分离高纯度目标组分，进行深入的生物化学研究。
制备性超离心分离和纯化生物样品一般用四种方法：差速离心法、一般密度梯度离心法、等密度梯度离心法及平衡等密度梯度离心法。
1)粒子差速离心：粒子差速离心法，简称差速离心法．是采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降粒子，在不同离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。
如取均匀悬浮液，控制离心力及时间进行离心，使最大的粒子先沉降，而上清液中不再含有这种粒子，取出上清液，增加离心力再分离较小的粒子，如此逐级分离。
差速离心一船用于分离沉降系数相差较大的粒子，如常用于细胞匀浆中细胞器的分离。
(2)一般密度梯度离心法：一般密度梯度离心法也称分级区带离心,它是把样品铺放在一个连续的液体密度梯度上，然后进行离心，并控制离心分离的时间，使得粒子完全沉降之前，在液体梯度中移动而形成不连续分离区带。
该法仅用于分离有一定沉降系数差的粒子，与粒子密度无关。
这种方法已用于RNA－DNA混合物、核蛋白体亚单位和其他细胞成分的分离。
(3)等密度离心法：当不同粒子存在密度差时，在离心力场作用下，粒子或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们密度恰好相等的位置上(即等密度点)并形成区带，此即等密度离心法。
位于等密度点上的粒子没有运动，区带的形状和位置都不受离心时间的影内，体系处于动态平衡。
等密度离心的有效分离仅取决于粒子的密度差。
密度差越大，分离效果越好，与粒子的大小和形状无关。
根据梯度产生的方式，可分为预形成梯度（Preformed gradient）和自形成梯度（Self-formed gradient）的等密度离心，后者又称平衡等密度梯度离心。
①预形成梯度等密度离心：本法需要事先制备密度梯度，常用的梯度介质主要是非离子型的化合物(如蔗糖、甘油等)。
离心时把样品铺放在梯度介质的液面上，这个密度包括了所需要研究的密度范围，直到粒子的漂浮密度和梯度的密度相等时，粒子才发生沉降，并排列成不同的区带。
②自形成梯度的等密度离心(平衡等密度离心)：平衡等密度离心常用的梯度介质有粒子型盐类如铯盐或铷盐和三碘化苯衍生物等。
离心时是把密度均一的介质溶液和样品混合后装入离心管中，通过离心自形成梯度，让粒子在梯度中进行再分配。
离心达到平衡后，不同密度的粒子在梯度中各自分配到其等密度点的特定位置上，形成不同的区带。
这一方法已用于分离和分析人血浆脂蛋白。
（2）超速离心技术-应用（分析性超离心）测定分子量:用沉降速度法可测定S，再根据S求分子量。
沉降系数(S = 10-13 s)：单位离心力场中的沉降速度。
单位是秒。
因为许多生物大分子的S 很小，所以定义10-13 s为一个沉降系数单位，用S表示。
它是表示样品本身的一个特定的物理量。
大分子的纯度鉴定。
如果是匀质则是一个沉降界面，大分子的构相变化：构象发生改变，沉降速度也会改变。