全基因组重测序探索刚地弓形虫致病基因

《弓形虫SRS29C基因敲除株的构建与鉴定》一、引言弓形虫病作为一种世界范围内分布广泛的寄生虫病，严重危害了人类的健康和农业生产。

针对弓形虫疾病的研究一直备受关注，其中基因敲除技术为研究弓形虫的生物学特性和致病机制提供了新的途径。

本文将重点探讨弓形虫SRS29C基因敲除株的构建与鉴定过程，以期为相关研究提供理论依据和技术支持。

二、材料与方法1. 材料（1）弓形虫株：本实验选用的弓形虫株为敏感型速殖子株。

（2）质粒与酶：构建基因敲除载体所需的质粒和限制性内切酶。

（3）细胞与培养基：用于培养弓形虫的细胞系及相应培养基。

2. 方法（1）SRS29C基因的克隆与敲除载体的构建首先，通过PCR技术扩增SRS29C基因片段，并将其克隆至敲除载体中。

敲除载体的构建包括选择合适的酶切位点、连接片段及构建载体等步骤。

（2）基因敲除株的构建将构建好的敲除载体通过显微注射等方法导入弓形虫速殖子中，经过一定时间的筛选和培养，获得SRS29C基因敲除株。

（3）基因敲除株的鉴定通过PCR、Western blot、实时荧光定量PCR等方法对获得的基因敲除株进行鉴定，验证SRS29C基因是否成功敲除。

三、实验结果1. SRS29C基因的克隆与敲除载体的构建通过PCR技术成功扩增出SRS29C基因片段，并将其克隆至敲除载体中。

经酶切和测序验证，确认敲除载体构建成功。

2. 基因敲除株的构建将构建好的敲除载体通过显微注射等方法导入弓形虫速殖子中，经过一定时间的筛选和培养，成功获得SRS29C基因敲除株。

3. 基因敲除株的鉴定通过PCR、Western blot和实时荧光定量PCR等方法对获得的基因敲除株进行鉴定。

结果显示，SRS29C基因在敲除株中的表达水平显著降低或完全消失，证实了SRS29C基因的成功敲除。

同时，通过对敲除株的生物学特性进行分析，发现其与野生型弓形虫相比在生长速度、形态等方面存在差异。

四、讨论本实验成功构建了弓形虫SRS29C基因敲除株，并对其进行了鉴定。

弓形虫三磷酸核苷水解酶基因的克隆与序列分析【摘要】目的:克隆并分析我国刚地弓形虫三磷酸核苷水解酶（NTPase）的编码基因。

方式:采纳聚合酶链反映（PCR）扩增弓形虫RH株的NTPase基因，克隆入pGEM-T Easy载体，转化后挑取阳性克隆进行酶切与测序鉴定，并对取得的NTPase基因及推导的氨基酸序列进行生物信息学分析。

结果:PCR扩增取得特异的弓形虫NTPase基因序列，测序结果说明，取得的弓形虫NTPase-Ⅱ基因全长1 812 bp，编码的603个氨基酸与Genebank报导的氨基酸序列同源性为100%。

经DNAStar预测NTPase-Ⅱ存在6个潜在抗原表位。

结论:成功克隆出序列正确的弓形虫NTPase-Ⅱ基因，为其相关研究奠定了基础。

【关键词】弓形虫核苷水解酶克隆序列分析Abstract: Objective:To clone and analyze the nucleoside triphosphate hydrolase (NTPase) gene of Toxoplasma gondii. Methods: The NTPase gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) from RH strain of Toxoplasma gondii and cloned into pGEM-T Easy vector. Positive clones were screened and identified by BglⅡ、HindⅢ digestion and sequenced. The DNA sequence and its deduced protein sequence were analyzed. Results: The NTPase gene was specifically amplified, DNA sequenceanalysis showed that the length of cloned gene was 1 812 base pair. The homology of this deduced amino acids sequence was 100% to that in the Genebank. Conclusion: The NTPase-Ⅱ gene is successfully cloned, providing basis for the future research about this gene.Key words: Toxoplasma gondii; NTPase; cloning; sequencing刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是专性细胞内寄生的机遇致病性原虫，呈世界性散布。

全基因组重测序原理
全基因组重测序是一种通过高通量测序技术对一个个体的整个
基因组进行全面测序的方法。

它是基因组学研究中的重要工具，可
以帮助科学家们识别个体基因组中的变异，从而揭示与疾病相关的
遗传变化，推动个性化医学的发展。

全基因组重测序的原理基本上可以分为几个步骤。

首先，需要
提取待测序个体的DNA样本，然后将其打断成较小的片段。

接下来，这些DNA片段会被连接到测序芯片或流式细胞仪上，然后进行测序。

现代的高通量测序技术可以同时测序成千上万个DNA片段，从而大
大提高了测序的效率。

在测序完成后，科学家们会利用计算机软件将这些测序数据进
行比对和分析。

通过将测序数据与已知的参考基因组进行比对，可
以识别出个体基因组中的单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失变异（Indels）以及结构变异等。

这些变异的发现对于研究人类疾病的
遗传基础、进行疾病风险评估以及个性化医学的实践具有重要意义。

总的来说，全基因组重测序技术的发展为我们提供了一个全面
了解个体遗传信息的途径，有助于揭示疾病的发病机制，推动个性
化医学的发展，为预防和治疗疾病提供了更精准的方法。

随着技术的不断进步和成本的不断降低，相信全基因组重测序技术将在医学研究和临床实践中发挥越来越重要的作用。

全基因组重测序名词解释
全基因组重测序是一种高通量测序技术，它涉及对一个个体的
全部基因组进行多次测序。

这项技术可以提供个体基因组的完整信息，包括基因组中的所有DNA序列。

全基因组重测序通常用于研究
个体的遗传变异，包括单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失（Indels）和结构变异等。

通过对同一基因组进行多次测序，可以提高测序数
据的准确性和覆盖度，有助于发现更多的变异类型。

全基因组重测序的过程包括DNA提取、文库构建、高通量测序、数据分析和解读。

在数据分析阶段，科研人员会利用生物信息学工
具对测序数据进行比对、变异检测和功能注释，以识别个体基因组
的变异信息。

全基因组重测序在医学研究和临床诊断中具有重要意义。

它可
以帮助科学家们理解遗传疾病的发病机制，发现新的致病基因，并
为个性化医学提供基因组水平的信息。

在临床诊断中，全基因组重
测序可以帮助医生们进行遗传病风险评估、疾病诊断和治疗方案选择。

总的来说，全基因组重测序是一种强大的基因组学技术，它为
我们提供了深入了解个体遗传信息的途径，对基础科学研究和临床医学都具有重要意义。

图２－Ｉ：弓形虫ＳＡＧ２基因外引物扩增特异性结果Ｍ、ＤＬ一２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１、弓形虫；２、新孢子虫；３、隐孢子虫４、柔嫩艾美耳球虫；５、猪肉孢子虫；６、牛球虫；７、伊氏锥虫。

ｏｆｆｉｆＳｔＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｏＤＮＡｆｒｏｍｓｅｖｅｒａｌｍａｔｅｒｉａｌｓＦｉｇ２－１ＲｅｓｕｌｔＭ、ＤＬ－２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ：１、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ：２、Ｎｅｏｓｐｏｍｃａｎｉｎｕｍ；３、ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ：４、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ；５、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓｓｕｉｈｏｍｉｎｉｓ；６、Ｅ．ｂｏｖｉｓ：７、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｅｎａｎｓｉ．２．１．２ＳＡＧ２内因物扩增结果以弓形虫、新孢子虫、隐孢子虫、柔嫩艾美耳球虫、猪肉孢子虫、牛球虫、伊氏锥虫等病原体的ＤＮＡ为模板，用基于ＳＡＧ２基因设计的内引物进行ＰＣＲ扩增，电泳后，可见弓形虫能扩增出约为３５０ｂｐ特定片段。

而新孢子虫、隐孢子虫、柔嫩艾美耳球虫、猪肉孢子虫、牛球虫ＤＮＡ、伊氏锥虫基因组ＤＮＡ为模板者无此扩增条带（图２—２）。

图２—２：弓形虫内引物扩增特异性结果Ｍ、ＤＬ一２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１、弓形虫扩增产物；２、新孢子虫；３、隐孢子虫；４、柔嫩艾关耳球虫：５、猪肉孢子虫；６、牛球虫；７、伊氏锥虫。

Ｆｉ９２—２ＲｅｓｕｌｔｏｆｓｅｃｏｎｄＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｏＤＮＡｆｒｏｍｓｅｖｅｒａｌｍａｔｅｒｉａｌｓＭ、ＤＬ－２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；ｌ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ；２、Ｎｅｏｓｐｏｍｃａｎｉｎｕｍ；３、ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ４、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ；５、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓｓｕｉｈｏｍｉｎｉｓ；６、Ｅ．ｂｏｖｉｓ；７、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｒｎａｅｎａｎｓｉ．２．２弓形虫ＳＡＧ２基因片段重组质粒的鉴定２．２．１弓形虫ＳＡＧ２基因片段重组质粒的ＰＣＲ鉴定将用内引物扩增产物用ＤＮＡ回收试剂盒纯化回收后，与ｐＧＥＭ—Ｔｅａｓｙ载体连接、转化ＪＭｌ０９、涂板、筛选，取白色菌落进行鉴定，其结果见（图２—３）。

《弓形虫SRS29C基因敲除株的构建与鉴定》一、引言弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种寄生性原虫，能够感染多种动物和人类，导致严重的神经系统疾病。

近年来，随着基因编辑技术的发展，尤其是CRISPR-Cas9系统在寄生虫学研究中的应用，弓形虫的基因敲除技术逐渐成为研究其致病机制和药物靶标的重要手段。

SRS29C基因作为弓形虫中的一个重要基因，其功能尚不明确，但被认为与弓形虫的致病性密切相关。

因此，构建SRS29C基因敲除株并进行鉴定，对理解该基因在弓形虫生命周期中的作用以及为新型药物研发提供潜在靶点具有重要意义。

二、方法2.1 基因敲除载体的构建首先，我们通过PCR扩增技术，以野生型弓形虫基因组DNA为模板，获取SRS29C基因的全长序列。

随后设计并构建基于CRISPR-Cas9系统的基因敲除载体，包括Cas9蛋白表达序列、靶向SRS29C基因的sgRNA序列以及用于筛选敲除株的标记基因等。

2.2 细胞培养与基因编辑将构建好的基因敲除载体通过电转或显微注射的方式导入弓形虫细胞中。

在适宜的培养条件下，使细胞进行基因编辑过程。

2.3 敲除株的筛选与鉴定通过PCR、Sanger测序或高通量测序等方法，对编辑后的细胞进行筛选和鉴定，确认SRS29C基因是否成功敲除。

同时，通过观察敲除株的表型变化和生物学特性，进一步验证敲除效果。

三、结果3.1 基因敲除载体的成功构建通过PCR扩增技术成功获取了SRS29C基因的全长序列，并成功构建了基于CRISPR-Cas9系统的基因敲除载体。

该载体在体外实验中表现出良好的表达和靶向性。

3.2 成功构建SRS29C基因敲除株将基因敲除载体导入弓形虫细胞后，经过适宜的培养条件，成功构建了SRS29C基因敲除株。

通过PCR和测序等方法，确认了SRS29C基因的敲除效果。

3.3 敲除株的表型与生物学特性分析与野生型相比，SRS29C基因敲除株在表型上发生了明显变化。

全基因组重测序流程小伙伴们！今天咱们来唠唠全基因组重测序这个事儿的流程。

这流程听起来可能有点复杂，不过只要跟着大概的步骤走，其实也没那么难啦。

首先呢，得有样本的采集呀。

这个样本呢，可以是各种各样的生物组织或者细胞啥的。

但是呢，采集的时候可得小心点儿哦！要保证样本的质量，要是样本质量不好，后面可就麻烦咯。

我觉得在采集样本的时候，最好能多采集一点，以防万一嘛。

当然啦，具体采集多少还得根据实际情况来定。

提取好DNA之后呢，就是要对DNA进行定量和质检啦。

这一步为啥要做呢？就是要看看咱们提取出来的DNA质量咋样，量够不够。

要是DNA的量太少或者质量不好，那后面的测序可就不准确了。

这一步啊，我觉得可以多检查几遍，确保万无一失。

然后就是构建测序文库啦。

这个环节可以根据实际情况自行决定一些参数啥的。

构建文库的过程中呢，要按照试剂盒的说明来操作，不过也不要太死板啦，有时候根据经验稍微调整一下也未尝不可。

小提示：在这一步可别太着急，一步一步稳稳地来很重要哦！再接下来就是测序啦。

测序的仪器有好多不同的类型，要根据自己的需求和预算来选择合适的仪器哦。

这一步就像是把咱们之前准备好的东西交给一个超级精密的机器去解读一样。

测序的时候要注意仪器的参数设置，这个很重要！为什么呢？因为这会直接影响测序的结果呀。

测完序之后呢，就会得到一大堆的数据啦。

这些数据就像是一堆乱麻一样，需要我们去整理和分析。

这个数据分析可不容易呢，不过现在有好多软件可以帮助我们。

我们要从这些数据里找到我们想要的信息，就像在大海里捞针一样。

刚开始看这些数据的时候可能会觉得头大，但是别担心，慢慢研究就会有收获的。

最后呢，就是结果的解读和验证啦。

这一步要特别注意！要把得到的结果和我们之前的预期或者已有的知识进行对比，看看是不是合理。

如果有不合理的地方，可能就需要重新检查前面的步骤啦。

小提示：别忘了最后一步哦！。

《刚地弓形虫SRS29C核酸疫苗的构建及SRS29C与SAG1联合免疫保护性比较研究》一、引言刚地弓形虫是一种常见的寄生虫，其感染可引起严重的疾病，如弓形虫病，给人类健康带来极大的威胁。

近年来，随着分子生物学技术的进步，核酸疫苗成为寄生虫疾病防治的一种新兴手段。

本文将探讨刚地弓形虫SRS29C核酸疫苗的构建，以及SRS29C 与SAG1两种核酸疫苗联合免疫保护性的比较研究。

二、材料与方法1. 材料刚地弓形虫SRS29C和SAG1基因序列，实验动物（如小鼠），相关分子生物学试剂和仪器等。

2. 方法（1）基因克隆与核酸疫苗构建：通过PCR技术扩增SRS29C和SAG1基因，将其克隆至真核表达载体中，构建SRS29C和SAG1核酸疫苗。

（2）免疫保护性实验：将构建好的核酸疫苗通过特定途径免疫实验动物，观察并比较SRS29C与SAG1单独及联合免疫后的保护效果。

三、SRS29C核酸疫苗的构建1. 基因克隆首先，根据刚地弓形虫SRS29C基因序列设计PCR引物，通过PCR技术扩增出目标基因。

然后，将扩增出的基因片段克隆至真核表达载体中，构建SRS29C核酸疫苗。

2. 疫苗表达与纯化将构建好的SRS29C核酸疫苗转染至细胞中，通过细胞培养和纯化技术，获得纯化的SRS29C蛋白。

四、SRS29C与SAG1联合免疫保护性比较研究1. 免疫实验动物分组与处理将实验动物分为四组：SRS29C单独免疫组、SAG1单独免疫组、SRS29C+SAG1联合免疫组以及未免疫对照组。

各组动物分别接受相应的核酸疫苗免疫处理。

2. 免疫保护性观察与比较在免疫后的一定时间内，通过人工感染刚地弓形虫的方式，观察各组动物的感染情况及病程进展。

比较SRS29C单独免疫组、SAG1单独免疫组以及联合免疫组的保护效果，评估各组疫苗的免疫保护性。

五、结果与讨论1. SRS29C核酸疫苗的构建成功，为进一步研究其免疫保护性奠定了基础。

2. SRS29C与SAG1联合免疫在保护效果上具有一定的协同作用，能显著提高动物的抗刚地弓形虫感染能力。

《刚地弓形虫SRS29C核酸疫苗的构建及SRS29C与SAG1联合免疫保护性比较研究》一、引言刚地弓形虫是一种能够引起人类和动物感染的寄生虫，其危害性极大，严重威胁着人们的健康和畜牧业的可持续发展。

随着分子生物学和免疫学技术的不断发展，核酸疫苗作为一种新型的疫苗形式，在寄生虫病防治方面展现出巨大的潜力。

本研究旨在构建刚地弓形虫SRS29C核酸疫苗，并比较SRS29C与SAG1联合免疫保护性的差异，以期为刚地弓形虫病的防控提供新的思路和方法。

二、材料与方法1. 材料刚地弓形虫SRS29C基因序列、SAG1基因序列、细胞系、实验动物等。

2. 方法（1）SRS29C核酸疫苗的构建通过PCR技术扩增SRS29C基因，并将其克隆至真核表达载体中，构建SRS29C核酸疫苗。

（2）SAG1核酸疫苗的构建（此部分与SRS29C类似，具体步骤略）（3）免疫保护性实验将实验动物分为不同组别，分别接种SRS29C核酸疫苗、SAG1核酸疫苗以及联合接种SRS29C与SAG1核酸疫苗。

通过攻毒实验观察各组动物的存活率、感染情况等指标，评估各组疫苗的免疫保护性。

三、实验结果1. SRS29C核酸疫苗的构建成功成功构建了SRS29C核酸疫苗，经PCR和测序验证，基因序列正确，无突变。

2. 联合接种SRS29C与SAG1的实验结果联合接种SRS29C与SAG1核酸疫苗的实验动物在攻毒后表现出较高的存活率，感染情况明显低于单独接种SRS29C或SAG1的实验动物。

这表明联合接种可以产生更好的免疫保护性。

四、讨论本研究成功构建了刚地弓形虫SRS29C核酸疫苗，并比较了其与SAG1联合免疫保护性的差异。

研究结果表明，联合接种SRS29C与SAG1核酸疫苗可以产生更好的免疫保护性。

这可能与两种抗原的协同作用有关，它们在体内共同激发免疫应答，从而提高抗刚地弓形虫感染的能力。

此外，本研究还为刚地弓形虫病的防控提供了新的思路和方法。

核酸疫苗作为一种新型的疫苗形式，具有许多优点，如制备简便、安全性高、免疫原性强等。

精准医学杂志2023年10月第38卷第5期 JP r e c i sM e d ,O c t o b e r 2023,V o l .38,N o .5d o i :10.13362/j .j pm e d .202305022 文章编号:2096-529X (2023)05-0469-02㊃病例报告㊃[收稿日期]2023-05-19; [修订日期]2023-07-02[基金项目]促进市级医院临床技能与临床创新能力三年行动计划重大临床研究项目(S H D C 2020C R 3005A );上海市教委高峰高原人才计划(20191910);上海市科委 科技创新行动计划 国内科技合作项目(21015801600)[通讯作者]顾劲扬,E m a i l :g j y n yd @126.c o m 肺泡灌洗液宏基因组检测辅助诊断肝移植术后肺弓形虫感染1例韩冰1 王健1 蔡浩1 张亦弛1 赵帅1 丁瀚1 顾劲扬2(1 上海交通大学医学院附属新华医院移植科,上海 200092; 2 华中科技大学同济医学院附属协和医院肝脏移植中心)患者,男,58岁,因 肝炎后肝硬化失代偿 于2021年12月28日在我院行心脏死亡供体原位肝脏移植术,术前于普通病房住院进行治疗,患者C h i l d 评分10分C 级,M E L D 评分12分㊂供体为女性,55岁,死因为颅内出血,有颅内手术史,病程15d ,有肺部感染,宏基因组痰液检测示肺炎克雷伯杆菌感染,血培养及宏基因组检测均为阴性㊂受者手术顺利,术后进行常规抗感染㊁免疫抑制等治疗,早期恢复良好㊂2022年1月14日胸部C T 平扫提示患者右肺散在炎性病变(图1A ),无发热,少许咳嗽,咳痰少,痰培养阴性,以头孢曲松他唑巴坦抗感染进行治疗㊂2022年1月25日患者出现低热,体温37.8ħ,复查胸部C T 显示右肺下叶炎性病灶较前范围增大(图1B ),痰培养仍阴性,抗生素升级为美罗培南㊂此后患者间歇性体温升高,最高达到38.8ħ,2022年1月30日患者心率显著增高,呼吸急促,血气分析结果提示呼吸性碱中毒合并代偿性代谢性酸中毒,予以面罩吸氧,次日患者血氧饱和度降低,血常规检查结果显示白细胞急剧升高,达到32.9ˑ109/L ,中性粒细胞96%,胸部C T 检查提示右下肺实变(图1C )㊂患者因低氧血症转入I C U 治疗,予替加环素+美罗培南+利霉素钠+卡泊芬净+磺胺甲唑加强抗感染并停用免疫抑制药物,同日行气管插管及纤支镜检查见气管插管远端气管黏膜肥厚,黏膜表面黄色痰液附着,无法吸出,气管壁及部分支气管开口内见黄色黏稠分泌物附着,以5m L 生理盐水灌洗后回收3m L 送痰培养及宏基因组学检测,后者检测结果显示,刚地弓形虫序列数58450,相对丰度99.8%,近平滑念珠菌序列数177,相对丰度93.6%,见图2A ㊂同期血液样本送宏基因组学检测结果显示,刚地弓形虫序列数2103,相对丰度99.7%,见图2B ,继续给予上述抗感染的治疗方案,但效果不佳,患者发生了多器官功能障碍综合征,并于2022年2月3日主动要求出院㊂A :2022年1月14日胸部C T 平扫示双肺散在炎性病变;B :2022年1月25日胸部C T 平扫示右下肺炎症进展;C :2022年1月31日胸部C T 平扫示双肺炎症进展,右下肺实变图1 患者不同时间点的胸部C T平扫结果A :肺泡灌洗液样本;B :血液样本图2 患者肺泡灌洗液及血液样本宏基因组测序结果讨论 弓形虫是一种猫科动物和其他温血动物的细胞内原生动物寄生虫,大多数宿主(80%)是无症状的,但是免疫抑制状态的实体器官移植(S O T )患者,具有较高的弓形虫感染的风险而且死亡率比较高[1]㊂在心脏移植中,当供体为弓形虫I gG 阳性而受者为血清阴性(D o n o r +/R e c i pi e n t -)时,受者弓形虫病发病率最高[2],在非心脏移植受者中发病率不足1%,但病死率却高达43%㊂国内S O T 患者术后弓形虫感染的报道并不多,孙雁等[3]和冀晓东等[4]分别报道了㊃964㊃精准医学杂志2023年10月第38卷第5期 JP r e c i sM e d ,O c t o b e r 2023,V o l .38,N o .51例肝移植术后弓形虫脑炎患者,均最终死亡㊂临床表现方面,移植患者的弓形虫病最常见症状为发热,根据累及部位不同,有肺炎㊁心肌炎㊁脑脓肿等临床表现㊂大多数的病例(82%)在移植后的前6个月发病,通常是肺部或播散性感染[2]㊂本病例患者早期少许咳嗽,痰少,后经纤支镜检查发现痰液极黏稠,后逐渐出现发热及呼吸困难㊂弓形虫病诊断多依赖实验室检查㊂最直接的证据当然是通过显微镜技术在体液或组织中查到速殖体,但相对耗时且需要相当高技能才能获得可靠的检测结果[5]㊂目前常用的是弓形虫抗体I gM 和I gG 的血清学检验,但具有免疫功能缺陷的移植患者不能仅凭血清学检查结果准确诊断㊂P C R 对弓形虫急性感染的检测更敏感,特别是对于已知供受体弓形虫I gG 状态不一致者,以及因无法耐受磺胺甲唑的预防致弓形虫感染风险增加者帮助较大㊂此外,连续定量P C R 检测能够检测出弓形虫载量的升降,有助于记录对治疗的反应㊂对于S O T 受者急性弓形虫病的诊断,美国移植学会(A S T )指南建议对血液和体液进行P C R 检测,并对受累组织进行活检以鉴定速殖子(强推荐㊁低级别)[2]㊂宏基因组测序可检测样本中的所有目标D N A ,并提供快速准确的病原信息,是一种革命性D N A 检测方法㊂器官移植后受者处于免疫抑制状态,罕见病原体感染风险增高,临床中多采用宏基因组测序的方法进行检测㊂我中心曾应用宏基因组二代测序成功检测出1例肝移植术后中枢神经系统曲霉菌感染[6]㊂R A N I 等[7]通过宏基因组二代测序法对比分析了肾移植受者和健康对照者尿液样本中抗生素耐药基因,用以指导抗生素的使用㊂综上,宏基因组测序在器官移植术后抗感染精准诊断和治疗中的应用范围越来越广,价值也越来越大㊂该类病人治疗方面,A S T 指南推荐用乙胺嘧啶㊁磺胺嘧啶和亚叶酸钙诱导治疗至少6周(强推荐㊁低级别),并建议在诱导后终生抑制治疗(弱推荐㊁低级别)[2]㊂有队列研究显示早期诊断及针对性治疗能够将弓形虫感染患者的生存率从65%提高到77%[8]㊂此外,为预防移植后弓形虫病的发生,A S T 指南还推荐筛查所有I g G 阳性的供受者,高危受者(D o n o r +/R e c i pi e n t -)可采用磺胺甲唑预防弓形虫病[2]㊂本例患者通过宏基因组二代测序辅助诊断,明确为肝移植术后弓形虫病,并采用磺胺甲唑积极治疗,但并未能逆转病情挽救患者生命㊂鉴于器官移植术后弓形虫感染发病率低,特别是我国报道的更少,结合文献和本病例分析,对于器官移植患者有肺部感染征象,但培养无细菌真菌感染依据,特别是常规经验性抗感染效果不佳的患者,可通过纤支镜检查获取肺泡灌洗液行宏基因组二代测序辅助诊断,以明确是否存在肺部弓形虫感染,尽量做到早诊早治,以提高移植后弓形虫感染的治愈率,改善患者预后㊂[关键词] 肝移植;弓形虫病;支气管肺泡灌洗;宏基因组;序列分析,D N A[中图分类号] R 531.8;R 657.3 [文献标志码] B作者声明:韩冰㊁王健㊁蔡浩㊁张亦弛㊁顾劲扬参与了研究设计;韩冰㊁赵帅㊁丁瀚参与了论文的写作和修改㊂所有作者均阅读并同意发表该论文,且均声明不存在利益冲突㊂[参考文献][1]L A H O Z R M ,MO R R I S M I ,I N F E C T I O U S D I S E A S E SC OMMU N I T Y O FP R A C T I C EO FT H EAM E R I C A NS O C I -E T Y O F T R A N S P L A N T A T I O N.T i s s u ea n db l o o d p r o t o z o ai n c l u d i n g t o x o p l a s m o s i s ,C h a g a s d i s e a s e ,l e i s h m a n i a s i s ,B a b e -s i a ,A c a n t h a m o e b a ,B a l a m u t h i a ,a n dN a e g l e r i a i ns o l i do r ga n t r a n s p l a n t r e c i p i e n t s -G u i d e l i n e s f r o mt h eA m e r i c a ns o c i e t y o f t r a n s p l a n t a t i o n i n f e c t i o u sd i s e a s e sc o mm u n i t y o f p r a c t i c e [J ].C l i nT r a n s pl a n t ,2019,33(9):e 13546.[2]D A R D C ,MA R T Y P ,B R E N I E R -P I N C H A R T M P ,e ta l .M a n a g e m e n t o f t o x o p l a s m o s i s i n t r a n s p l a n t r e c i p i e n t s :A nu p-d a t e [J ].E x p e r tR e vA n t i I n f e c tT h e r ,2018,16(6):447-460.[3]孙雁,于立新.原位肝移植术后弓形虫脑炎一例[J ].中华器官移植杂志,2018,39(8):499-501.[4]冀晓东,赵晨希,夏爽,等.肝移植后中枢神经系统弓形虫感染1例[J ].实用器官移植电子杂志,2020,8(5):390-392.[5]L I U Q ,WA N GZD ,HU A N GSY ,e t a l .D i a gn o s i so f t o x o -p l a s m o s i s a n dt y p i n g o ft o x o pl a s m a g o n d i i [J ].P a r a s i t V e c -t o r s ,2015,8:292.[6]韩冰,王健,赵帅,等.肝移植术后中枢神经系统曲霉感染一例[J ].中华移植杂志(电子版),2021,15(1):49-51.[7]R A N IA ,R A N J A N R ,M E TWA L L Y A A ,e t a l .A b u n d a n c eo fm u l t i d r u g r e s i s t a n c ee f f l u x p u m p si nt h eu r i n a r y m e t a ge -n o m e of k i d n e y t r a n s pl a n t p a t i e n t s [J ].B i o m e dR e s I n t ,2020,2020:5421269.[8]C AM P B E L L A L ,G O L D B E R G C L ,MA G I D M S ,e ta l .F i r s t c a s e o f t o x o p l a s m o s i s f o l l o w i n g s m a l l b o w e l t r a n s pl a n t a -t i o na n d s y s t e m a t i c r e v i e wo f t i s s u e -i n v a s i v e t o x o p l a s m o s i s f o l -l o w i n g n o n c a r d i a c s o l i d o r g a n t r a n s p l a n t a t i o n [J ].T r a n s pl a n t a -t i o n ,2006,81(3):408-417.(本文编辑 耿波 厉建强)医学学术论文结果的写作结果是科研论文的核心,是结论的依据,是形成观点与主题的基础㊂由结果引发讨论,导出推理㊂结果反映了论文的学术水平及其价值㊂结果的内容重点是新发现㊁新创造㊂正反内容应同时介绍㊂临床研究主要是治疗效果:近期㊁远期疗效和随访情况等;实验研究主要是有关数据与统计㊁图片等;流行病调查应包括调查地点㊁对象的一般情况,疾病的发生与暴发情况,疫情分析,人体与环境标本的实验结果,综合比较分析,控制措施与评价等㊂结果的表达方式有图㊁表和文字三种形式㊂结果部分的叙述以文字描述为主,可附以必要的图和表㊂一般情况下,凡是能用文字简要叙述清楚的,就不必用图和表㊂另外,应注意三者的重复,已有图表者,文字只作概括性描述即可,不必重复具体的数据,但也没有必要将全部结果都简化成 结果见某表㊁某图 ㊂此外,在结果部分只能列出作者自己的实验结果和结论,引用他人报道的结果,一般仅限在讨论部分使用㊂㊃074㊃。

《刚地弓形虫SRS29C核酸疫苗的构建及SRS29C与SAG1联合免疫保护性比较研究》一、引言刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种重要的胞内寄生虫，其感染范围广泛，对人类和动物健康构成严重威胁。

随着生物技术的进步，核酸疫苗作为一种新型的疫苗形式，因其高效、安全、易于制备等优点，逐渐成为抗寄生虫病研究的热点。

本研究旨在构建刚地弓形虫SRS29C核酸疫苗，并对其与SAG1蛋白的联合免疫保护性进行比较分析，为进一步研发更有效的刚地弓形虫病防治方法提供理论依据。

二、材料与方法1. 材料刚地弓形虫SRS29C基因序列、SAG1基因序列、相关酶、载体等。

2. 方法（1）SRS29C核酸疫苗的构建：根据SRS29C基因序列设计引物，通过PCR扩增目的基因，将目的基因克隆至真核表达载体，构建SRS29C核酸疫苗。

（2）SAG1蛋白的制备：通过基因工程方法表达SAG1蛋白，并进行纯化。

（3）免疫保护性比较研究：将动物分为不同组别，分别接种SRS29C核酸疫苗、SAG1蛋白疫苗以及联合接种，观察各组动物的免疫反应及对刚地弓形虫感染的抵抗力，比较SRS29C与SAG1的联合免疫保护性。

三、实验结果1. SRS29C核酸疫苗的构建成功通过PCR扩增、克隆至真核表达载体等步骤，成功构建了SRS29C核酸疫苗。

2. SRS29C与SAG1的免疫保护性比较（1）单独接种SRS29C核酸疫苗组：动物对刚地弓形虫感染的抵抗力有所提高，但效果有限。

（2）单独接种SAG1蛋白疫苗组：动物对刚地弓形虫感染的抵抗力明显提高，但免疫反应较强，可能出现一定程度的副作用。

（3）联合接种SRS29C核酸疫苗与SAG1蛋白疫苗组：动物对刚地弓形虫感染的抵抗力显著提高，且免疫反应较为温和。

四、讨论本研究成功构建了刚地弓形虫SRS29C核酸疫苗，并通过比较其与SAG1蛋白的免疫保护性发现，联合接种SRS29C核酸疫苗与SAG1蛋白疫苗可显著提高动物对刚地弓形虫感染的抵抗力，且免疫反应较为温和。

两株猪源刚地弓形虫的分离及其生物学特性的研究
的开题报告
一、选题背景
弓形虫是一种普遍存在于人畜共患病中的原生动物，其中猪是其主
要宿主之一。

弓形虫会引起猪的黄疸、热、水肿以及不育等症状，严重
危害畜禽养殖业的健康和产业发展。

因此，对于猪源弓形虫的分离与鉴
定及其生物学特性研究显得尤为重要。

二、研究目的
本研究旨在分离并鉴定两株猪源弓形虫，并对其进行生物学特性的
研究，以期更深入地了解猪源弓形虫的生物学特性和致病机制，为其预
防和控制提供理论参考和实践指导。

三、研究内容
1. 猪肝样本采集和处理：采集猪肝样本，经过样本处理后进行病原
体分离。

2. 病原体分离及鉴定：分离两株猪源弓形虫，通过生理生化检测、
序列分析等方法鉴定其物种。

3. 生物学特性研究：以分离的猪源弓形虫为材料，分别从生长培养、形态学、生存周期等方面对其进行研究。

四、研究意义
1. 为猪源弓形虫的鉴定和分子疫学研究提供基础数据。

2. 探究猪源弓形虫的生物学特性，深入了解其致病机制。

3. 提供理论依据和技术手段，为其预防和控制提供实践基础。

四、研究方法
1. 病原体分离和鉴定的方法：PCR扩增、酶测、DNA测序。

2. 生物学特性研究的方法：培养和光学显微镜观察、甲苯染色、检测形态学和生存周期等生物学特性。

五、预期结果
通过本次研究，将分离并成功鉴定两株猪源弓形虫，同时揭示其生物学特性和致病机制，为其预防和控制提供理论和实践参考。

刚地弓形虫基因型和与基因型相关的致病机制研究进展
王林;沈继龙
【期刊名称】《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》
【年(卷),期】2013(31)4
【摘要】弓形虫病是由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的呈世界性分布的人兽共患寄生虫病,对人类健康和畜牧业发展造成严重危害。

弓形虫属仅有刚地弓形虫一种,经多重酶切电泳分析(MLEE),PCR-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和微卫星分型等研究发现,各地刚地弓形虫具有丰富的遗传多态性。

已知不同基因型弓形虫株的致病机制不同。

本文对世界各地区弓形虫株基因型及基因型与毒力间的相关性研究进展进行了综述。

【总页数】6页(P319-324)
【关键词】刚地弓形虫;基因型;种群结构;毒力
【作者】王林;沈继龙
【作者单位】安徽中医药大学第一附属医院检验中心;安徽医科大学病原生物学教研室;安徽病原生物学省级实验室,人兽共患病安徽省重点实验室
【正文语种】中文
【中图分类】R382.5
【相关文献】
1.中国弓形虫分离株基因型及致病性的研究进展 [J], 付晓莹;冯永杰;梁宏德;杨玉荣
2.刚地弓形虫基因型与毒力关系的研究进展 [J], 乔增培;沈继龙
3.胡子鲶致病性气单胞菌的分离鉴定及其致病力与毒力基因型相关性 [J], 龙苏;韩书煜;牛志伟;梁静真;胡大胜;黄钧;李鸿骥;刘齐;苏江华
4.百日咳致病菌株的药物敏感性和疫苗相关基因型研究 [J], 李丽君; 袁林; 贾举; 高薇; 王青; 孟庆红; 史伟; 李玥; 姚开虎
5.泛酸激酶相关神经变性病新变异致病性鉴定及表型-基因型相关性研究 [J], 杜鹏;李宁;蒋玮莹
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

刚地弓形虫基因型与毒力关系的研究进展乔增培;沈继龙【期刊名称】《国际医学寄生虫病杂志》【年(卷),期】2007(034)002【摘要】弓形虫是一种专性有核细胞内的寄生原虫,可以感染包括人类在内的几乎所有温血动物.弓形虫不同虫株基因组之间存在微小差异,这可能是导致不同虫株对小鼠急性毒力差异的原因.近年来,对弓形虫基因组的研究主要集中在一些编码毒力相关的重要的抗原基因.各分离株基因组之间只有1%～2%的差异,这种差异在各不同虫株间较稳定.弓形虫株大多数属于Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型中的一种,只有Ⅰ型是公认的小鼠强毒株,其余两型属弱毒株.目前的观察认为弓形虫基因组的变异度要比表型的变异度小.该文综述了与虫株毒力表型密切相关的基因,如SAG1,SAG2和SAG5等.越来越多的研究表明,造成弓形虫表型差异的因素并非单一的,而是若干基因共同作用的结果.【总页数】4页(P85-88)【作者】乔增培;沈继龙【作者单位】230032,合肥,安徽医科大学人兽共患病研究所,安徽医科大学病原生物学教研室;230032,合肥,安徽医科大学人兽共患病研究所,省部共建教育部重要遗传病基因资源利用重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R5【相关文献】1.NDV基因型与其毒力、现有疫苗免疫保护之间的关系 [J], 冯涛;刘金凤2.105株携带耶尔森菌强毒力岛大肠杆菌的毒力基因型和部分菌株毒力因子序列研究 [J], 吕殿红;魏文康;黄忠;温肖会3.刚地弓形虫基因型和与基因型相关的致病机制研究进展 [J], 王林;沈继龙4.刚地弓形虫毒力调节因子研究进展 [J], 夏菁;彭鸿娟5.高表达毒力因子ROP18的转基因刚地弓形虫株的建立及鉴定 [J], 蒋宗儒;安然;杨杰;万俐娟;都建因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

《弓形虫SRS29C基因敲除株的构建与鉴定》一、引言弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种常见的寄生虫，对人类和动物健康造成严重威胁。

近年来，随着基因编辑技术的发展，基因敲除技术已成为研究弓形虫致病机制、药物靶标筛选等的重要手段。

SRS29C基因作为弓形虫中一个重要的基因，其功能与寄生虫的生存和致病性密切相关。

因此，构建SRS29C基因敲除株并进行鉴定，对进一步研究弓形虫的生物学特性和开发新型抗虫药物具有重要意义。

二、材料与方法1. 材料（1）弓形虫株：选取适宜的弓形虫株作为实验材料。

（2）质粒和酶：包括构建基因敲除株所需的质粒、限制性内切酶、连接酶等。

（3）培养基和试剂：包括细胞培养基、PCR试剂、电转缓冲液等。

2. 方法（1）SRS29C基因的克隆与敲除载体的构建利用PCR技术扩增SRS29C基因片段，将其克隆到敲除载体中，构建SRS29C基因敲除载体。

（2）弓形虫细胞的转染与筛选将构建好的敲除载体通过电转方法转入弓形虫细胞中，通过药物筛选等方法筛选出成功敲除SRS29C基因的弓形虫细胞。

（3）基因敲除株的鉴定通过PCR、Western blot、测序等方法鉴定SRS29C基因是否成功敲除，并检测敲除株的生物学特性变化。

三、实验结果1. SRS29C基因的克隆与敲除载体的构建通过PCR扩增得到SRS29C基因片段，将其克隆到敲除载体中，成功构建SRS29C基因敲除载体。

经测序验证，载体序列正确无误。

2. 弓形虫细胞的转染与筛选将构建好的敲除载体通过电转方法转入弓形虫细胞中，经过药物筛选等步骤，成功筛选出SRS29C基因敲除株。

3. 基因敲除株的鉴定通过PCR、Western blot等方法鉴定，发现SRS29C基因在敲除株中已成功缺失。

与野生型相比，敲除株在生长速度、形态等方面发生了明显变化。

进一步测序验证了敲除株的基因序列正确无误。

四、讨论本实验成功构建了弓形虫SRS29C基因敲除株，并进行了鉴定。