1-1 免疫血清制备及效价测定-1

实验报告
10.选择波长630nm，将酶标板置于载板台上，开始扫描，测定OD值。

结果如下所示：
思考题：
1.查阅资料，了解共有哪些类型的ELISA实验，以及本实验中所用ELISA属于哪一类？答：本实验中所用ELISA属于间接法ELISA。

①直接ELISA
原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。

加酶标抗体进行孵育。

固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。

彻底洗涤未结合的酶标抗体。

此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。

加底物反应。

直接法主要用于测定抗原。

②间接法ELISA
原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。

洗涤除去未结合的抗原及杂质。

加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。

经洗涤后，加酶标二抗。

固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。

洗涤后，加底物显色。

③双抗夹心法ELISA
原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。

将特异。

免疫血清的制备及效价测定制备免疫血清的传统方法是将抗原注入动物体内，由动物体内 B 细胞增殖分化成浆细胞产生抗体。

由于抗原分子（完全抗原）具有多种抗原决定簇，每一种抗原决定簇可以激活具有相应抗原受体的 B 细胞系产生该决定簇的抗体，因此用抗原免疫机体获得的免疫血清一般均为多克隆抗体。

制备的免疫血清的质量（特异性、亲和力及效价高低）受多种因素的影响，主要包括抗原的性质、免疫动物的种类及状态、免疫剂量、免疫途径及免疫方案（加强免疫次数，间隔时间，佐剂的使用等）等。

因此要获得高质量的免疫血清需先通过预实验摸索确定最佳免疫方法。

测定免疫血清中抗体效价的方法很多，如凝集实验，沉淀实验、溶血实验， ELISA 等均可用于对抗体效价的测定。

第一部分、免疫血清的制备我们要制备的是多克隆抗体----抗IgG抗体的制备。

Ig是免疫球蛋白，对异种动物而言，是良好的抗原物质。

可以刺激异种动物产生抗Ig血清，经适当提取后，产生抗Ig抗体，又叫第二抗体或抗抗体。

在多数的间接标记反应中，均需制备抗Ig抗体。

【实验材料】1．动物IgG（兔源的，购买）2．弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂3．青霉素和链霉素4．实验动物： BALB/c小鼠5．无菌 1ml 注射器6. 生理盐水，酒精棉等【实验步骤】1. 免疫程序：40 ug+弗氏佐剂+青霉素1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml+生理盐水混悬液背部皮下多点注射，隔10天加强免疫2次，腹腔注射20ug+不完全弗氏佐剂，一周后收血清。

一般在末次免疫结束后的第7 天,自鼠尾取少量血,分离血清,采用间接法ELISA 分析血清中抗体的效价，达到效价即可收取。

2. 获得免疫血清：小鼠摘眼球取血,收入小试管中,3000转/分离心5分钟,上清即为免疫血清。

第二部分、免疫血清质量评价一、 效价测定抗体效价测定方法很多，本实验采用琼脂扩散法，ELISA法—）、琼脂扩散法1.操作步骤（具体见附注）⑴ 做琼脂板，打梅花孔。

免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类1、免疫标记法及其分类1）荧光免疫法：原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。

底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。

结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。

该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。

以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。

除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。

洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。

最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。

传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。

2）放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。

然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。

RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng／ml水平。

但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。

近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。

3）酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。

竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L 板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg／L，线性范围达1 000ug／L。

夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r＝0.92)。

ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。

免疫学实验抗血清的制备及其效价测定班级：生物技术1401小组：11姓名：2016年11月抗血清的制备及免疫小鼠效价检测摘要：本试验以牛血清白蛋白为抗原，对小鼠和家兔进行免疫，以制备高效价抗血清。

采用多次中程免疫使产生免疫应答小鼠的血清中抗体达到实验所需的要求，然后采集小鼠血液，从中分离出血清，从而获得抗血清。

利用间接ELISA 方法测得抗血清效价。

关键词：抗血清；间接法ELISA ；抗体效价前言：用具有抗原性的物质（牛血清白蛋白BSA ）注入到健康小鼠的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。

抗体主要存在于血清中，经三次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集小鼠血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。

酶联免疫吸附实验（ELISA ）是一种新型的免疫测定技术，利用间接ELISA 法，将抗原BSA 包被在酶标板上，加入待测的抗体，再加相应的二抗，生成复合物后再加入底物显色，借助仪器测得的光吸收值计算抗体效价。

材料与方法：实验主线：实验材料：包被缓冲液（0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液）、10ug/ml 抗原（牛血清白蛋白）、0.01M PBS 溶液、5%（w/v ）脱脂奶粉、PBST 洗涤液（含0.05%Tween 20的0.01M 的PBS ）、2M H2SO4、待测抗体、HRP 标记的羊抗小鼠IgG （二抗）、底物溶液TMB 、健康小鼠酶标板、酶标仪、保鲜膜、排枪、离心管、玻璃棒、烧杯、离心机、恒温箱动物免疫抗血清的采集与分离中程免疫3次间隔一周间接法ELISA 测定抗血清的效多克隆抗体实验内容与方法：一．动物的免疫：1.1实验动物的选择选择实验动物应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体等因素。

选择与抗原亲缘关系远的动物，尤其在制备抗免疫球蛋白（Ig）抗体时；根据抗体的需要量选择动物，制备一抗常用动物为小鼠和家兔，制备二抗常用动物为羊和马；常用青壮年期的雄性动物。

免疫血清的制备实验报告背景介绍免疫血清是一种含有特异性抗体的血清，它能够识别并结合特定抗原，并在机体内产生免疫反应。

免疫血清在医学、生物学研究以及临床诊断中起着重要的作用。

本文将介绍免疫血清制备的实验过程，以及关键步骤和注意事项。

材料与方法1.抗原：选择具有特定抗原性的物质，如病毒、细菌或蛋白质等。

2.动物：选择适合的动物作为免疫体，如小鼠、兔子或羊等。

3.细菌培养基：提供细菌生长所需的培养基。

4.免疫佐剂：增强机体免疫反应的物质，如佐剂CA等。

5.离心机：用于离心分离血清和细胞。

实验步骤1.抗原制备：根据实验需要，获得相应抗原物质。

如为蛋白质，可通过细菌表达系统获得目标蛋白。

如果抗原是病毒或细菌，需要先进行培养和提取。

2.免疫程序：将抗原注射给动物。

根据具体实验要求，可选择皮下注射、肌肉注射或腹腔注射等途径。

3.免疫佐剂的使用：将适量的免疫佐剂与抗原混合，增强免疫反应。

佐剂通常会激活免疫细胞，增加抗原的摄取和处理。

4.免疫程序的重复：根据需要，可进行多次免疫程序，以增加机体对抗原的免疫反应。

5.血清采集：在免疫程序完成后，采集动物的血液样本。

样本中含有免疫反应产生的抗体。

6.血清的处理：将采集到的血液样本放置在离心管中，进行离心分离。

分离后，得到的液体即为免疫血清。

结果与讨论通过以上实验步骤，我们成功制备了免疫血清。

制备的免疫血清中含有特异性抗体，能够与抗原结合并产生免疫反应。

免疫血清的制备过程中有几个关键步骤需要注意：1.抗原的选择：根据实验需求选择合适的抗原。

抗原的纯度和性质会直接影响免疫血清的质量。

2.免疫佐剂的使用：合理选择免疫佐剂，能够增强机体的免疫反应，提高抗体产量。

但佐剂的过量使用可能导致免疫反应过度激活，损害动物的健康。

3.血清采集的时间点：根据实验设计，选择合适的时间点采集血液样本。

免疫反应的早期和高峰期通常是采集血清的最佳时间。

4.血清处理的注意事项：血液样本采集后，应尽快进行离心分离，以防止血液凝固。

项目一免疫血清的制备与提纯一、免疫血清的制备(Preparation of antiserum)【实验原理】将适当的免疫原物质注入动物体内，经一段时间动物血清中可出现大量特异性抗体，这种含抗体的血清称为抗血清(或免疫血清)。

它在血清学检测中有广泛应用。

理想的抗血清的产生主要取决于抗原的纯度和免疫原性，以及动物的应签性。

同时免疫接种时的免疫途径、抗原剂量、有无佐剂、注射次数及间隔时间等因素均可影响抗血清的质量。

制备的抗血清可直接用于某些实验，也可从中提取特异性抗体或某一组分。

下面介绍几种常用的免疫血清制备方法，免疫动物均选用家兔，这是因为：(1)其产生的血清量足够实验应用并容易驯养；(2)为采血、注射用耳血管很容易找到；(3)用兔子作免疫接种的资料较多，可方便利用；(4)能产生高效价抗体，并且可用常用的沉淀反应、凝集反应或溶血、溶菌反应等试验方法进行鉴定。

【试剂和器材】1．免疫动物2～3kg健康雄性家兔。

2．免疫原绵羊红细胞(SRBC)、OX19变形杆菌、人IgG(SPA菌体吸附)、正常人混合血清、牛血清白蛋白(BSA)、聚丙烯酰胺凝胶分离的蛋白质抗原。

3．佐剂完全和不完全福氏(Freund)佐剂。

4．其它试剂生理盐水、70%酒精等。

5．器材注射器及针头、棉球、三角烧瓶、玻璃珠、试管、吸管、柯氏瓶(扁瓶)、Luer-lock(双联)注射器、止血钳、手术剪、手术刀等，以上器材均应高压灭菌或消毒后使用；离心机、液体旋转混合器、温箱、水浴箱、冰箱等。

【步骤和方法】(一)溶血素的制备1．制备抗原取脱纤维羊血或用阿氏(Alsever)液保存的绵羊红细胞(采血方法见附录常用实验动物采血方法)，用生理盐水洗３次，每次加2～3倍生理盐水，离心2000r/min 10min，弃上清。

最后一次按压积用生理盐水配成10%SRBC悬液，放４℃保存备用。

2．免疫动物家兔耳缘静脉注射10%SRBC悬液1ml，间隔3天，连续7次，末次免疫后2周，由耳静脉取血1ml(取血方法见附录常用实验动物采血方法)，分离血清，测定溶血素效价(见补体结合试验)，当效价≥1:2000则可放血收集血清，此法效价可达1:6000~1:10000。