Westernblot所需溶液的配制

一、所需试剂的配制1、丙烯酰胺贮存液（30%Acr/Bic）丙烯酰胺（Acr）29.2gN，N-甲叉双丙烯酰胺（Bic）0.8g超纯水至100ml37度溶解，4度避光保存一个月，使用时恢复至室温且无沉淀。

2、分离胶缓冲液（4×）（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：Tris（MW121.14）18.15g超纯水90ml用HCl调pH值至8.8，最后用超纯水定容至100ml，4度保存。

3、浓缩胶缓冲液（4×）（1.0mol/L Tris-HCl，pH6.8）:Tris（MW121.14）12.1g超纯水90ml用HCl调pH值至6.8，最后用超纯水定容至100ml，4度保存。

4、10%十二烷基硫酸钠（SDS）SDS 10g蒸馏水至100ml50度水浴溶解，室温保存。

如在长期保存中出现沉淀，水浴溶解后仍可使用。

5、10%过硫酸铵（Aps）Aps 0.1g超纯水1ml溶解后4度避光保存，保存时间为一周，现用现配，也可-20度保存6、N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）：避光保存。

7、2×上样缓冲液（2×Loading Buffer）：1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8）0.8ml10%SDS（电泳级）2ml溴酚蓝0.5mg甘油0.8ml2-巯基乙醇0.2ml蒸馏水 1.2ml总量为5ml，可在4度存放数周，-20存放数月。

（其中2-巯基乙醇可保护二硫键，并使蛋白下沉用利于电泳的进行。

）8、电泳缓冲液（pH8.3）Tris 3.03g甘氨酸（Gly）14.4gSDS 1g或10%SDS 10ml蒸馏水至1L无需调pH值（8.2~8.3），可在4度存放数周，次溶液可重复使用3~5次。

9、转移缓冲液：Tris 3.03g甘氨酸（Gly）14.4g甲醇200ml蒸馏水至1L先用蒸馏水溶解甘氨酸和Tris，然后再加入甲醇，最后补足液体。

无需调pH值（8.1~8.4），可在4度存放数周。

WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤Western Blot详细实验步骤及试剂配方1. 溶液配置1.1 5×SDS-PAGE上样缓冲液（Loading buffer）药品用量1 M Tris-HCl (PH=6.8) 1.25 mLSDS 0.5 gBPB（溴酚蓝，有毒）25 mg甘油 2.5 mL去离子水up to 5 mL分装至1.5 mL离心管中，每管500 μL，室温保存，使用前每管加入25 μL的β-巯基乙醇。

1.2 10×SDS-PAGE电泳缓冲液（Running buffer 母液）药品用量Tris 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144.2 gSDS 10 gddH2O up to 1 L室温保存即可，使用时稀释为1×的工作液，可回收反复使用4~5次。

1.3 Tris-HCl缓冲液（1）1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)→制分离胶Tris (MW: 121.14) 45.43 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 8.8（2）1.0 M Tris-HCl (PH=6.8)→制浓缩胶Tris (MW: 121.14) 30.29 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 6.8二者高压灭菌后，置于室温保存即可。

1.4 10% SDS (十二烷基硫酸钠)SDS 10 gddH2O up to 100 mL室温保存即可。

1.5 10% AP (过硫酸铵)→1.5 mL 离心管配制过硫酸铵（刺激性，腐蚀性） 0.1 g超纯水up to 1 mL混匀后，锡箔纸包住，避光处理，置于-20℃保存。

1.6 30% 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 150 g甲叉双丙烯酰胺 4 gMilli-Q水 30 mL滤纸过滤，Milli-Q水定容至500 mL，装入棕色瓶子中，4℃保存。

1.7 10×转膜缓冲液(Trans buffer 母液)Tris (MW: 121.14) 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144 g去离子水 up to 1 L室温保存即可，其1×的工作液配制为：100 mL母液+200 mL甲醇（有毒）+700 mL水。

Westernblot试剂配制及操作流程试剂配制：1.电泳缓冲液：a. 准备1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液（Tris-Glycine缓冲液）：每一升缓冲液中加入30.3g Tris base、288g glycine，并调节pH至8.3±0.1b. 准备3×SDS-凝胶缓冲液：每一升缓冲液中加入30g Tris base、144g glycine、10g SDS，并调节pH至8.3±0.12.蛋白提取缓冲液：a. 准备RIPA缓冲液：每一升缓冲液中加入5g Tris base、15g NaCl、5g sodium deoxycholate、1g NP-40，并将pH调节至7.4b.按需添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。

操作流程：1.样品制备：a. 收集细胞或组织样品，加入适量的蛋白提取缓冲液，并使用超声波细胞破碎仪或玻璃Dounce破碎器破碎细胞，释放蛋白。

b.在4℃下离心细胞提取物，收集上清液，并在离心后尽快使用或存储在-80℃的冰箱中。

2.SDS-凝胶制备：a. 准备15%缩胆凝胶：加入7.5mL 30%丙烯酰胺、10mL 10×SDS-凝胶缓冲液、7.5mL去离子水和20uL 10%Tetramethylethylenediamine (TEMED)，混合均匀。

b.将混合液倒入立方形凝胶模具中，插入两根不锈钢导电丝作为电极，并进一步注入10%胶解剂。

c.待凝胶定形后，用1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液冲洗凝胶表面。

3.蛋白电泳：a.加载样品：将样品加入离心管中，加入1×电泳缓冲液以使样品浓度均匀。

b. 加载样品：将样品加入凝胶孔中，通常每孔加入20-30ug样品。

c.进行电泳：将装有凝胶的电泳槽放入电泳缓冲液中，将蛋白电泳至凝胶顶部。

d.转移凝胶：根据需求选择湿式或半湿式转印方式，将蛋白转移到PVDF或NC膜上。

4.免疫印迹：a.封闭膜：将转印膜放入封闭溶液中（如5%脱脂奶粉或3%BSA）封闭非特异性结合位点。

Western Blot试剂的准备1. 30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr） 29.0g亚甲双丙烯酰胺（Bis） 1.0g混匀后ddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。

2. 4×分离胶缓冲液（1mol/L Tris-HCl PH 8.8）Tris 18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 8.8，定容至100ml。

3. 4×浓缩胶缓冲液（0.5mol/L Tris-HCl PH 6. 8） Tris 12.1g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 6. 8，定容至100ml。

4. 10%SDS：电泳级SDS 10.0g加ddH2O，68℃助溶，浓盐酸调PH 7.2，定容至100ml。

5. 5×电泳缓冲液（PH 8.3）：Tris 15.2g甘氨酸 94gddH2O 定容到1000mlSDS 5g 先在974ml蒸馏水中加入Tris碱，待溶解完全后，再加甘氨酸，最后加SDS。

6. 10%过硫酸铵（AP）：0.1g AP加ddH2O至1.0ml，4℃保存，要在一周内使用，最好新鲜配制。

7. 2×加样缓冲液：2×SDS加样缓冲液0.5mol/L Tris-HCl (PH 6.8) 2ml10%SDS 4 mlβ-巯基乙醇1ml甘油 2ml1%溴芬蓝1ml置4℃避光保存8. TEMED：注意室温较低时TEMED量可加倍，最后灌胶之前再用9. 转膜缓冲液(Towbin transfer Buffer)：即1×SDS-PAGE10. 0.0 1mol/L PBS (PH 7.4) ：NaCl 8.5g(12H2O)Na2HPO4 2.9011g(2H2O)NH2PO4 0.24g加ddH2O定容至 1000ml11. 封闭液: 1×PBS中加入 30ml5%（V/V）脱脂奶粉 1.5g0.02%叠氮钠 0.006g0.05%Tween-20 0.015g12. 漂洗液（PBST）：含0.05% Tween-20的PBS溶液每1000 ml PBS溶液中加0.5 ml Tween-2013. 水饱和正丁醇：正丁醇 50 mlddH2O 5 ml 加入瓶中震荡，使结合，存于室温。

1.Western Blotting 相关溶液及抗体1)转膜缓冲液（running buffer）(10×)(1L)Tris 30.3g甘氨酸144g不调pH转膜工作液（1×)(1L)（现配现用）(10×)转膜缓冲液（running buffer）100ml无水乙醇100ml水800ml2)TBS 缓冲液(5×)（1L）Tris-HCl 12.15gNaCl 146.4g用36-37%浓盐酸调节pH值至约7.4（约5ml浓盐酸，pH试纸检测即可）TBST：TBS+Tween-20 0.1%（1ml for 1L）3) 封闭液TBST 缓冲液中加入5%脱脂奶粉或者(3% Gelatine)4）Western Blotting 第一抗体适合于自己蛋白的抗体5）Western Blotting 第二抗体辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG/(羊抗鼠IgG)4.实验步骤（1）SDS-PAGE 电泳分离蛋白质：(浓缩胶70V，30-40min；分离胶120V，1h)5×loading buffer: 4mlddH2O 1.76ml 1M Tris-HCl pH 6.8 0.24ml甘油1ml 10%（w/v）SDS 0.8mlß-巯基乙醇0.2ml（2）将4 张滤纸剪成与海棉大小一致的方形（3）配（1×)转膜工作液(10×)转膜缓冲液（running buffer）80ml无水乙醇80ml水640ml800ml（4）将胶泡在（1×)转膜工作液中（防止胶干掉，最好不要用水，水泡胶会涨）（5）用尺子量胶大小，裁PDVF膜（不要用手蹭膜，手上有蛋白）（6）PDVF膜先在无水乙醇中泡约1min,然后泡到（1×)转膜工作液中。

（PDVF膜为疏水性的，先在乙醇中泡会使其亲水性好）（7）将海绵和滤纸在水中浸湿，然后按照一下顺序(整个操作过程中保证膜不能干)：白板—海绵—两层滤纸--PDVF膜（靠正极）--胶（靠负极）（用小试管排气泡）--两层滤纸—海绵（用小试管排气泡）--夹住—放入胶槽中（白板靠红，黑板靠黑，保证电极方向不要错）--在胶槽中加入转子—倒入（1×)转膜工作液—在胶槽中放入冰袋—80V～100V 恒压，60min(该条件可以转移25kD～90kD的蛋白)(8)封闭：在封闭液中室温，摇1h或者4℃静置过夜。

Western blot常用试剂配方1. 丙烯酰胺-双丙烯酰胺储存液：30% AB（100ml）丙烯酰胺29 g双丙烯酰胺1g加蒸馏水至100ml，过滤，棕色瓶保存。

2. 10% SDS：（10ml）电泳级SDS 1 g蒸馏水9 ml初始PH约为7.85，用针尖蘸少许浓盐酸调PH 至7.2，定容至10ml。

3.TEMED（四甲基乙二胺）（成品）4. Lower-buffer （1.5M Tris-Cl PH 8.8）：50mlTris-base 9.085 g蒸馏水45 ml加浓盐酸（约0.4ml）调PH至8.8后定容至50ml，4℃保存。

5. upper buffer（1.0M Tris-Cl，PH6.8）：50mlTris-base 6.055 g蒸馏水44 ml加3.5ml浓盐酸调PH至6.8后定容至50ml，4℃保存。

6. 10%过硫酸铵（10% AP）：0.5ml 新鲜配制称取0.05g AP于1.5ml EP管中，储存于-20℃，用时溶于0.5ml蒸馏水7. 5 × loading buffer：（1ml）50mlupper buffer 0.312 ml 15.6ml甘油（丙三醇）0.5 ml 25mlSDS 0.1 g 5gDTT 0.0385 g溴酚蓝0.005g 0.25g加蒸馏水溶解后定容至1ml。

取0.2ml加0.8ml蒸馏水配成工作液。

8. 5 × running buffer：（1000ml）Tris-base 15.1 g甘氨酸（Glycine）94 gSDS 5 g加蒸馏水溶解后定容至1000ml。

用时加4000 ml蒸馏水。

9. 考马斯亮蓝染液：100ml（可重复利用）甲醇30 ml冰乙酸10 ml蒸馏水60 ml考马斯亮-250 0.05 g10. 考马斯亮蓝脱色液500ml：现用现配乙酸（10%）50ml甲醇（30%）150ml加蒸馏水定容至500ml。

WB所需溶液的配制1Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Running buffer) 5×Tris base 15.14gGlycine(甘氨酸) 72.0gSDS 5.0g蒸馏水溶解至1000ml5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。

使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。

2转膜缓冲液（Sending buffer）（现用现配）1000 ml 1500 mlGlycine(甘氨酸) 14.413 g 21.6 g1.0 M Tris.HCl (pH8.3) 25 ml 37.5ml10% SDS 1 ml 1.5 ml甲醇(methanol) 200 ml 300 ml蒸馏水溶解至1000 ml 溶解至1500 ml必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。

小片段可不加SDS。

310% SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS,C12H25O4NaS）溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存。

4Tris.HCl的配置1.0M Tris.HCl (pH8.8) Tris 30.28 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到8.81.5 M Tris.HCl (pH8.8) Tris 45.43 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到8.81.0 M Tris.HCl (pH6.8) Tris 30.28 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到6.81.0 M Tris.HCl (pH8.3) Tris 30.28 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到8.3，需要大约8毫升。

注：Tris的分子量是121.4. 4度储存。

5 10% APS (Ammonium persulfate ; 过硫酸铵)的配置称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。

Western-Blot操作流程试剂配制10mM Tris (,)1%NP40%TritonX-100% 兑氧胆酸钠2 mM EDTA1 mM PMSF20%T 油调pH直至。

混匀后4C保存，长期保存于-20 C。

使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail制胶用(1-6):1. L Tris • HCl ()Tris 12.114g蒸储水100ml溶解后，(用浓盐酸调pHS),室温下保存。

2. L Tris • HCl ()Tris 18.671g蒸储水100ml溶解后，(用浓盐酸调pHS),室温下保存。

3. 10% SDSSDS 10g蒸储水至100ml如溶解困难，可在50C水浴下溶解，室温保存。

如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。

4. 10%过硫酸胺(AP)过硫酸胺（现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在管中，一次性多装几管，使用时加入蒸储水水即可，溶解后，4C保存，保存时间为1周）5. 四甲基乙二胺原液（TEMED 4C保存。

6. 30灿稀酰胺:4?C保存。

10"层胶，即分离胶（两块胶，15ml）：胶的浓度根据自己所做蛋白的大小确定依次加入去离子水30炳烯酰胺5ml1.5M Tris-HCl ()10%SDS150 卬l10%AP150 卬lTEMED 6 (1 l每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED；加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEME混匀后应即刻灌胶。

灌胶后加异丙醇（1ml）消泡5毗层胶（两块胶，6ml）:依次加入去离子水30%M烯酰胺1ml1M Tris-HCl ()10%SDS60 卬l10%AP60 卬lTEMED 6 (1 l每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED;加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEME混匀后应即刻灌胶。

7. 5X电泳液缓冲液Tris （）15.1g甘氨酸0 94gSDS 5.00g蒸储水至1000ml溶解后室温保存，用时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。

一、试剂配置：1、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris+48ml 1mol/L HCL混合，加水稀释到100ml终体积。

过滤后4℃保存。

2、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40ml水中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。

过滤后4℃保存。

这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。

3、胶配置：加入TEMED后，立即混匀即可灌胶。

4、封闭液：（含5％脱脂奶粉的TBST 缓冲液）脱脂奶粉（国产，安怡牌）5g+TBST 100ml溶解后4℃保存。

使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。

5、抗体:用TBST 稀释至一定浓度使用，每张膜需0.5ml。

二、SDS－PAGE 电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

（2）灌胶与上样1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

）2、按前面方法配10％分离胶，加入TEMED 后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时，可用10ml 枪吸取5ml 胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。

（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。

操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。

加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。

）3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。

再等3min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

4、按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED 后立即摇匀即可灌胶。

将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。

灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。

插梳子时要使梳子保持水平。

由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。

WB所需溶液的配制1Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Running buffer) 5×5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。

使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。

2转膜缓冲液（Sending buffer）（现用现配）必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。

小片段可不加SDS。

310% SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate ，SDS,C12H25O4NaS）溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存。

4Tris.HCl的配置注：Tris的分子量是121.4. 4度储存。

5 10% APS (Ammonium persulfate ; 过硫酸铵)的配置称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。

使用时尽量现配现用，短期内实验频繁可多配。

4度存则两周内用完，最多不能超过一个月。

负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。

6 10×TBS (Tris-buffered saline)的配置加HCl调pH到7.6，室温储存。

7TBST (Tris-buffered saline with Tween20) 的配置8 上样缓冲液（loading buffer）的配置SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。

按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。

9 stacking gel buffer (4×)调pH到6.8，加双蒸水到10毫升。