甜菜磷酸蔗糖合成酶的转基因研究

２０１ ３正
中 国 糖 料
Ｓ ｕ ｇ ａ ｒ Ｃｒ ｏ ｐ ｓ ｏ ｆ Ｃｈ ｉ ｎ ａ １ ３
第 ３期
文章 编 号 ： １ ０ ０ ７ — ２ ６ ２ ４ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ３ ～ ０ ０ １ ３ — ０ ２
甜菜磷酸蔗糖合成酶的转基 因研究
刘 大 丽 ｔ ， 马 龙 彪 ， 郝 慧
Ｋ ａ ｎ ａ 抗性植株 中， 通 过提 取 甜 菜基 因组 ＤＮＡ 及 Ｐ ＣＲ 鉴 定 ， 有 ８株 成 功 整 合 了 Ｂ ｖ Ｓ Ｐ Ｓ基 因， 阳性 率达 到 ２ ９ ％。 关键词 ： 甜 菜； 转基 因； 磷 酸 蔗 糖 合 成 酶
中图 分 类 号 ： ￥ ５ ６ ６ ． ３ ０ １ ； Ｑ７ ８ 文献 标 识 码 ： Ａ
糖 的代 谢密 切 相关 Ｓ Ｐ Ｓ是 一 种可 溶性 酶 ， 存 在于 细胞 质 中 ， 催 化 如下 可逆 反应 ： Ｕ Ｄ Ｐ Ｇ ＋ ６ 一 磷 酸果 糖 ６ 一 磷 酸蔗 糖＋ Ｕ Ｄ Ｐ 。 许 多果实 成熟 过程 中蔗糖积 累 与 Ｓ Ｐ Ｓ活性 的升 高密 切相关 。 因此 ． 克 隆甜菜 Ｂ ｖ Ｓ Ｐ Ｓ基 因 ， 并
ｐ Ｂ Ｉ １ ２ １按 照 ３ ： １的摩 尔 比建 立连 接反 应 体系 ， １ ６ ｏ Ｃ连 接过 夜 ； 连接 产物 转化 到 Ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ５ ｃ ￣ 感受 态 细胞 中 ， 通 过 Ｋ ａ ｎ ａ 抗 性 筛 选 出待测 阳性 克 隆 ；待 测 克 隆 经过 质 粒 提 取及 Ｐ Ｃ Ｒ鉴 定 ，引 物参 见 ［ ６ １ ，进 一 步 确定 重 组 子 ｐ Ｂ Ｉ １ ２ １ 一 Ｂ ｖ Ｓ Ｐ Ｓ 。重组 质粒 转化 到农 杆菌 Ｅ Ｈ Ａ１ ０ ５中 ， 待用 １ ． ３ 农杆 菌 介导 的甜 菜遗传 转化
（ １ ． 黑 龙 江 省 普通 高 等学 校 甜 菜 遗 传 育 种 重 点 实 验 室 。 哈尔滨 １ ５ ０ ０ ８ ０ ； ２ ． 中 国农 业 科 学 院 北 方 糖 料 作 物 资 源 பைடு நூலகம்利 用 重 点 实验室／ 中国 农 业 科 学 院 甜 菜研 究 所 ． 哈 尔滨 １ ５ ０ Ｏ ８ ０ ） 摘 要 ： 将 甜 菜磷 酸 蔗 糖合 成 酶 （ 曰 ｅ ￡ ０ ｖ ｕ ｌ ｇ ａ ｒ ｉ ｓ ｓ ｕ ｃ ｒ ｏ ｓ ｅ ｐ ｈ ｏ ｓ ｐ ｈ ａ ｔ ｅ ｓ ｙ ｎ ｔ ｈ ａ ｓ ｅ ， Ｂ ｖ Ｓ Ｐ Ｓ ） ￣ 因构 建 到植 物表 达 载 体 ｐ Ｂ Ｉ １ ２ １ 上，
进 而将 其 转化 到 甜 菜植 株 中去 ． 能够 有 效地 提 高 甜菜 块根 的含糖 率 及 品质 ． 进 而 有 效 地促 进 我 国甜 菜 产 业
的发 展 。
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 实验 材料 及试 剂
实 验所 用 的 甜菜 试 管 苗 、 植 物 表 达 载体 ｐ Ｂ Ｉ Ｉ ２ １ 、 农 杆菌 菌 株 Ｅ Ｈ Ａ１ ０ ５由黑龙 江 大 学甜 菜 遗 传 育种 重 点 实验 室 提供 。Ｔ ４ ｌ ｉ ｇ ａ ｓ ｅ（ Ｂ ｉ ｏ ｌ ａ ｂ ｓ ） ； Ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ５ ｏ ｔ 感受 态 细胞 （ Ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｇ ｅ ｎ ） ； Ｔ ａ ｑ Ｄ Ｎ Ａ ｐ ｏ ｌ ｙ ｍｅ ｒ ａ ｓ ｅ （ Ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｇ ｅ ｎ ） ； 限制 性 内
以甜菜无 菌 苗 的叶柄 为 转基 因的外 植体 ， 将 其 置 于预培 养培 养 基 （ ＭＳ ＋ ０ ． ５ ｍｇ ／ Ｌ ６ 一 Ｂ Ａ） 中２ ｄ ； 分 别用 浓
切酶 （ ＭＢ Ｉ ） ： 未特 殊 注 明试 剂 均为进 口分析 纯 。
１ ． ２ ｐ Ｂ Ｉ １ ２ １ 一 Ｂｖ Ｓ Ｐ Ｓ植物 表达 载体 的构 建
分别 将顺 式 插入 甜 菜 Ｂ ｖ Ｓ Ｐ Ｓ （ Ｇ ｅ ｎ ｂ ａ ｎ ｋ ａ ｃ ｅ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｎ ｏ ． Ｘ８ １ ９ ７ ５ ） 基因的 ｐ ＭＤ １ ８ 一 Ｔ — Ｂ ｖ Ｓ Ｐ Ｓ载 体嘲 、 ｐ Ｂ Ｉ １ ２ １ 载
利 用 农杆 菌介 导 法 对甜 菜 叶柄 进 行 遗 传 转化 。通 过 对 转 基 因体 系的优 化 ， 确 定 了农杆 菌 浓度 ｏＤ 为 ０ ． ６时 ， 叶柄 外
植体经过 ２ ｄ的预 培 养 ， 农杆菌侵染 ５ ｍｉ ｎ ， 侵 染 受体 共培 养 ４ ｄ后 ， 所 获得 的 Ｋ ａ ｎ ａ 抗性 芽率 最 高 。在 所 获得 的 ２ ７株
甜菜 是我 国主要 的糖料 作物 之一 ， 其 含糖 率及 产量 直接 关 系到糖 料 的生产 和发 展ｆ Ｉ Ｊ 。常规 的育种 方法 在
提高 产量 和 含糖 率 上逐 渐 表现 出来 了很 大 的局 限性 随着 生物 技 术和 分子 生 物学 的发 展 ， 基 因工 程技 术 为
解决 这一 难题 提供 了有 效 而便捷 的方 法 。 蔗 糖是 植 物体 内光 合 同化 物 由 叶到果 实 的主要 运 输形 式 。 也是 决定 甜 菜 品质形 成 的关 键 因子［ ２ － ３ １ 。高 等 植 物 的蔗 糖代 谢是 一个 复 杂 的过 程 ， 其 中， 蔗 糖磷 酸合 成 酶 （ Ｓ ｕ ｅ ｒ ｏ ｓ ｅ ｐ ｈ ｏ ｓ ｐ ｈ ａ ｔ ｅ ｓ ｙ ｎ ｔ ｈ ａ ｓ ｅ ， Ｅ Ｃ ２ ． ３ ． １ ． １ ４ ， Ｓ Ｐ Ｓ ） 与 蔗
体用 Ｐ ｓ ｔ Ｉ 、 Ｓ ａ ｃ Ｉ 限制 性 内切 酶 酶 切 ， Ｔ ｒ ｉ ｓ 饱 和 酚提 纯 后 用 Ｋ ｌ ｅ ｎ ｏ ｗ大 片段 补 平 ，再 经 过 Ｔ ｒ ｉ ｓ 饱 和 酚 提纯 后 用
Ｘ ｂ ａ Ｉ限制性 内切 酶 酶切 ． 经 ｌ ％琼脂 糖凝 胶 电泳 回收 Ｂ ｖ Ｓ Ｐ Ｓ片段 及 ｐ Ｂ Ｉ １ ２ １片段 ： 将 目的 片段 Ｂ ｖ Ｓ Ｐ Ｓ和载 体