牡丹组织快繁的研究进展

xxxxx学院毕业论文题目：牡丹组织快繁的研究进展系别：食品工程系专业：生物技术及应用班级：学生姓名：学号：指导老师姓名：指导老师职称：2011年10月16日星期日目录一.植物组织培养快繁的定义二.牡丹组织培养的研究进展2.1外植体的选择2.2培养基的选择2.3激素配方的选择三.褐化的控制3.1外植体的影响3.2培养基离子3.3植物生长调节剂的影响3.4培养基状态的影响3.5培养条件的影响四.培养条件4.1温度4.2光照4.3 CO2五.炼苗、移栽六.问题及展望七.参考文献牡丹组织快繁的研究进展摘要：本文介绍了牡丹快繁的研究进展以及影响牡丹快繁的因素和褐化的控制。

同时罗列出了现阶段牡丹快繁中出现的问题，和对这些问题的解决方法，以及对未来牡丹快繁的展望关键词：牡丹组织快繁影响因素褐化1. 植物组织培养快繁的定义植物组织培养是指在无菌的条件下，将离体的植物（根、茎、叶、花、果实、种子等）、组织（形成层、花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞）以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整的植株。

由于培养物是脱离植物母体，在玻璃瓶中进行培养，所以也叫做离体培养。

其完整过程是：脱分化再分化生长根茎叶外植体愈伤组织生长点或完整植株发生胚状体在有些情况下，再分化也可不经愈伤组织阶段，而直接发生于脱分化的细胞。

【1】2.牡丹组织培养的研究进展2.1外植体的选择在牡丹快繁中做为外植体的有根、叶及叶柄、芽、茎尖。

其中不同的外植体在不同的培养基中的发芽、生根率不同。

比如：李玉龙等【2】运用“青龙卧墨池”和“杂种18号”的腋芽茎尖进行培养,在培养基1/2MS+BA0.5-1.0mg/L+GA30.1-0.5mg/L+KT0.2-1.0mg/L得到愈伤组织,在培养基MS+BA0.2-2.0mg/L+GA30.2-0.5mg/L使芽伸长,在培养基1/2MS+IBA/IAA0.1~2.0mg/L+2%蔗糖+0.5%活性炭诱导生根。

谢静萱【3】运用牡丹(枯枝牡丹)的腋芽茎尖在培养基MS+BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+LH500mg/L+蔗糖5%获得愈伤组织及分化出芽。

张龙勃等运用“胡红”的休眠芽茎尖,在培养基MS+BA1.5mg/L+KT0.5mg/L获得幼苗。

孔祥生等【4】运用“姚黄”、“洛阳红”的休眠芽茎尖,在培养基1/2MS(大量减半)+BA1.0mg/L+GA30.5mg/L获得愈伤组织、丛生芽。

陈怡平等先后分别用紫斑牡丹的土芽、叶柄、叶片、幼芽、心皮、雄蕊及经一段时间组织培养的试管苗等作外植体进行愈伤组织的诱导,得出:配方MS+BA15 mg/L+NAA2 mg/L最为理想;不同外植体中,试管苗的幼芽和土芽诱导率最高,叶柄和叶片次之,其诱导率分别为100%、60%、30.8%,而生殖器官雄蕊和心皮未能诱导成功。

目前,已报道的牡丹芽培养中,多数以鳞芽为外植体进行研究,包括腋芽【5】、花芽、顶芽、休眠芽【6】等,在所有鳞芽中,以休眠芽的分化表现最好,分化率可达94%,花芽最差仅16%。

不同取材时期对芽培养也有影响,12月至翌年2月取材,经过低温休眠,芽充分分化,营养物质累积丰富,苞片紧密,污染率低,成活率高,萌发时间早,因此,此时期取材最好2.2培养基的选择目前牡丹试管苗组织培养中采用的基本培养基多为MS、1/ 2MS ,有时也采用 WPM培养基,并添加不同浓度的生长素,牡丹试管苗生根培养使用的生长素多为IBA,也有将生长素 IBA和 IAA同时使用,不同的外植体诱导生根时用的培养基不尽相同。

张桂花【7】等在牡丹芽萌发期和休眠期分别进行腋芽和顶芽组织培养,结果表明:自芽萌动至开始休眠为适宜培养期,芽诱导最佳培养基为MS+6-BA0.5-1mg/L+NAA0.1-0.2mg/L,MS为最佳壮苗培养基,牡丹试管苗培养的适宜光照强度为2000 lx,光照时数为10 h/d,适宜温度(25±1)℃。

刘淑敏【8】运用“古班同春”的花芽,在培养基MS+VC+BA获得幼苗。

陈怡平等以紫斑牡丹休眠地下芽为材料,对同一时间打破休眠的地下芽在3种不同培养基上的发育状况、不同时期低温处理后在同一培养基上的发育以及不同时期休眠地下芽在同一培养条件下的发育进行了比较研究,得出MS+BA1mg/L+NAA0.5mg/L+2,4-D0.5mg/L 最有利于打破休眠的地下芽发育,720 h的低温处理对于地下芽的萌发率及发育速率最好,彻底打破休眠的不同时期地下芽在同一培养条件下发育速率基本一致。

陈笑蕾【7】采用“洛阳红”、“胡红”、“肉芙蓉”、“鲁荷红”、“乌龙捧盛”和“朱砂垒”牡丹品种的鳞芽诱导培养,结果表明:品种之间的增殖率、综合萌芽率和增殖系数,“乌龙捧盛”品种表现较好。

以“乌龙捧盛”鳞芽为材料,对鳞芽增殖系数的影响依次为:NAA>基本培养基类型>6-BA>IAA;培养基MS+Ca2+(WPM)+6-BA 2.0mg/L+IAA0.3mg/L和MS+Ca2++6-BA1.0mg/L+IAA0.1mg/L 有利于试管苗的增殖,继代培养时间应低于35 d。

在生根培养过程中,IBA和基本培养基类型是影响牡丹试管苗生根率的主要因素,培养基1/2MS+IBA 1.0mg/L+IAA 1.0mg/L+蔗糖20mg/L有利于根的诱导;基本培养基类型和蔗糖浓度是影响牡丹试管苗平均根长的重要因素,培养基WPM+IBA1.0mg/L+IAA1.0mg/L+蔗糖40mg/L有利于根的生长;IAA浓度和蔗糖浓度是影响牡丹试管苗根数的重要因素培养基1/4MS+IBA3.0mg/L+IAA3.0mg/L+蔗糖30mg/L和培养基1/2MS+Ca2+(WPM)+IAA3.0mg/L何松林【7】等以“洛阳红”叶柄为试验材料,探讨离体培养中褐化的防止,得出:WPM为基本培养基时褐化现象最轻,1/2MS次之,MS褐化现象最为严重;3种抗氧化剂和吸附剂对褐化的抑制作用较为明显,其中以PVP最好,VC较次之,Na2S 2 O3最差;外植体采取前对母株进行遮光处理以及在培养过程中对材料进行暗处理有利于抑制褐化;培养基中生长调节物质(BA、NAA)的浓度变化对褐化没有明显的影响2.3激素配方的选择生长调节剂配响以 DKW为基本培养基，在16 种不同激素配比水平下对牡丹组培苗继代增殖培养。

结果如表 2 所示。

细胞分裂素 ZT 不比牡丹继代增殖的影适合牡丹继代增殖,无论ZT单用还是与BA组合，对继代增殖的效果都不好,生长势不整齐,试管苗老化;BA浓度高于4.0mg/L分化苗数少,且过早停长，不利于牡丹的繁殖，附加2.0-3.0mg/L BA时, 牡丹分化苗数和有效苗数都较高，增殖效果好；生长素种类对牡丹继代增殖的影响不大,IAA0.5mg/L 或NAA0.05mg/L处理没有明显差别。

生长素配比牡丹试管苗不定根诱导的影响在附加不同生长素配比的1/2DKW 培养基中接种牡丹生根苗,结果表明,各处理生根率低于10%甚至不生根，说明 1/2DKW 基本培养基不适宜做牡丹组培苗生根培养。

以1/2MS基本培养基附加不同浓度的IAA与IBA或 NAA 与 IBA，预备试验时发现,3 种生长素单独使用或配合使用浓度较低时 (0.5-1.0mg/L IAA，0.3-1.0mg/L IBA，参考多数植物生根培养所用浓度）生根率很低，加大生长素浓度后，牡丹试管苗获得了较高的生根率 (表2)，其中 IBA 促进生根效果明显，随浓度升高，生根率明显增加；IAA 和 NAA 也有随浓度升高,生根率提高的趋势,不过 NAA 浓度达到 0.3mg/L 时开始抑制不定根发生，IAA3.0mg/L 和IBA2.0mg/L配合时也有此现象发生。

生长素对发根条数的影响趋势与生根率相同。

综合以上结果牡丹不定根诱导以 IAA2.0 或 NAA0.2 与 IBA2.0 配合使用效果较好。

李丽霞等【8】以牡丹“荷花紫”、“大胡红”品种的幼叶作外植体,采用正交设计法,考察6-BA、2,4-D、KT、NAA 4种激素及酪蛋白对牡丹愈伤组织产生的影响,确定适宜的激素种类及水平,优化筛选出适宜于两个牡丹品种的愈伤组织诱导培养基,得出:激素2,4-D是幼叶愈伤诱导的关键因素,适宜于牡丹“荷花紫”及“大胡红”培养的培养基配方均为1/2MS+2,4-D4mg/L+KT0.2mg/L+NAA0.4mg/L+酪蛋白200mg/L。

3.褐化的控制3.1外植体的影响牡丹的取材时期和部位对于降低褐化非常关键。

如夏季材料比其他季节材料更易氧化褐变，因而取材应选在早春特别是花期以前一周左右进行。

陈笑蕾【7】研究取材时期对褐化程度的影响上也认为，5月份取材较6月份褐化程度低。

即低温处理对降低褐化率有一定作用。

安佰义研究不同外植体发现叶柄比叶片褐化程度轻，子叶和幼茎的接种褐化率最低，更适合做外植体。

培养基的影响3.2培养基离子1/2 MS、WPM、MS三种基本培养基处理中均有褐化现象的发生。

但从褐化程度上看，以MS培养基褐化最严重,1/2 MS 次之，WPM 褐化程度最轻。

所以降低无机盐浓度可以减轻牡丹外体褐变程度3.3植物生长调节剂的影响植物生长调节剂是培养基中不可缺少的关键物质,其用量虽然极少,但对外植体的诱导和分化起着重要和明显的调节作用,常用的是生长素类和细胞分裂素类。

BA （6-苄氨基腺嘌呤）和2iP（细胞分裂素）、GA3（赤霉素）细胞分裂能力较强，随浓度增加，褐化程度加剧，可能是由于分裂素类能促近酚类化合物的合成或者是刺激多酚氧化酶活性提高。

陈笑蕾认为BA和NAA浓度的变化对褐化现象影响不明显3.4培养条件的影响正常光照和黑暗两种处理，都有褐化现象的发生，但就褐化程度来看，暗培养较轻，而光下培养褐变指数较高【10】。

较强的光照条件可以加剧褐变发生。

有报道认为光是多酚氧化酶酶促因子，即增加光照可以提高多酚氧化酶活性，因而导致褐变加剧。

张俊琦认为经过暗培养的外植体褐化有所缓解，但随着培养时间的增加，褐化程度也随之加重。

这可能是因为暗培养只是暂时降低了多酚氧化酶的活性,一旦恢复正常培养,其活性也马上活跃起来。

以牡丹根韧皮部为材料在29 ℃黑暗条件下继代培养，能使牡丹愈伤组织处于旺盛的生长状态,并有效地控制褐变。

温度对愈伤褐化的影响非常明显。

低温对控制褐变效果显著，但是温度过低，不利于外植体的生长分化，转入正常条件下，褐变加剧。

据推测是低温抑制外植体内酚类化合物的合成，降低多酚氧化酶的活性,减少酚类氧化,从而减轻褐变。

3.5培养基状态的影响培养基的状态因固化剂量的多少而有所不同。

琼脂是植物离体培养的首选固化剂。

它是从红藻等海藻中提取的一种高分子糖类，不参与代谢、不提供营养，使培养基在常温下凝固。