蜜环菌胞外漆酶酶活力的分光光度法测定

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漆酶高产菌株的筛选实验方案

漆酶简介漆酶是一种含铜的多酚氧化酶(Laccase, P-diphenol oxidase, EC.1.10.3.2)，广泛分布于高等动植物、昆虫、真菌分泌物和少量细菌中，其中最主要的是担子菌亚门的白腐真菌。

漆酶为含铜的糖蛋白，约由500 个氨基酸组成，多为单一多肽，个别为四聚体。

糖配基占整个分子的10%～45%，糖组成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖等。

由于分子中糖基的差异，漆酶的分子量随来源不同会有很大差异，甚至来源相同的漆酶分子量也会不同。

通过对漆酶蛋白质晶体结构的研究发现,漆酶具有3个铜离子结合位点,共结合4个铜离子,且这4个铜离子处于漆酶的活性部位,在催化氧化反应中起决定作用，如果除去铜离子,漆酶将失去催化作用。

漆酶具有较强的氧化还原能力，能催化多酚、多氨基苯等物质的氧化，使分子氧直接还原成水，将酚类和芳胺类化合物还原成醌类物质，没有副产物的生成。

由于漆酶具有特殊的催化性能和广泛的作用底物，使得漆酶具有广泛的应用价值。

漆酶应用主要集中在制浆造纸，特别是纸浆的生物漂白，环境保护，木质纤维素降解等方面。

造纸工业方面，由于漆酶能高效的降解木质素及与木质素具有相似结构的物质，避免造纸工序中所使用的化学物质影响环境。

环境保护方面，漆酶能有效的除去工业废水、化学农药当中的毒物酚、芳胺、单宁和酚醛化合物，生物消除有毒化合物，使得漆酶在废水处理等环保事业有广阔的前景。

分光光度法测定漆酶活力最常用的底物是2,2’-连氮一双(3-乙基苯并唆毗咯琳-6-磺酸)(ABTS)。

实验一高产漆酶菌株酶活测定1 主要试剂的配制（1） 0.2 mmol/L pH 4.5柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液A 液：0.2 mmol/L 柠檬酸溶液：称取柠檬酸21.014 g ，加入蒸馏水溶解定容至500mL 。

B 液：0.2 mmol/L 柠檬酸钠溶液：称取柠檬酸钠29.412 g ，加入蒸馏水溶解定容至500mL 。

可见光分光光度法测定米曲霉发酵液中总黄酮

1422009No .9Serial No .210Chi n a Bre w i n gAna l y sis and Exa m i n ation收稿日期:2009-04-30作者简介:金红星(1968-),男,讲师,研究方向为微生物学。

可见光分光光度法测定米曲霉发酵液中总黄酮金红星,胡炎华,成文玉(河北工业大学化工学院,天津300130)摘要:米曲霉可发酵生产黄酮类物质,为确定发酵液中总黄酮含量,采用可见光分光光度法(A510)进行测定,并优化了测定条件。

确定乙醇浓度为95%(体积分数),亚硝酸钠浓度为4%(质量分数),硝酸铝浓度为10%(质量分数)以及氢氧化钠浓度为4%(质量分数)时最适用于米曲霉发酵液中总黄酮含量的测定。

最后分别用芦丁和槲皮素物质的量为标准确定总黄酮含量。

关键词:可见光分光光度法;米曲霉;发酵液;总黄酮中图分类号:O 657.32 文献标识码:A 文章编号:0254 5071(2009)09 0142 03D eter m ination of t otal flavonoi d s i n Asperg illus oryzae fer m entation by visible spectrophot om etryJIN H ongxi ng ,HU Yanhua ,CHENG W enyu(S chool of Che m ical Engineeri ng an d T echnology,H ebei Universit y of Technology,Tianjin ,300130,Chi na)Ab stract :T he concen tration of flavono i ds i n A spergill us oryzae f er m en t a tion was deter m i ned by v isi ble s pectrophoto m etry (A510).The optm i a l deter m i nati on cond itions were obtained as fo ll ow s :ethano l concentrati on 95%,sodi u m n itrite concentrati on ,4%,a l u m i nu m n itra te concentrati on 10%and sodi u m hydrox i de concentrati on 4%.The tota l fl avono i ds content we re assayed usi ng ruti n and querceti n as standard .K ey word s :v i si b l e spectropho t om etry ;A spergill us oryzae ;fer m entati on ;tota l fl avono i ds黄酮类化合物(F lavono i d)也叫生物类黄酮或维生素P ,常与维生素C 伴存,广泛存在于植物(如蔬菜、水果、花和谷物)中。

蜂蜜中的四环素族抗生素两种常用检测方法的比较

２１００年６月
１２３
第３１卷第６期
食品研究与ｊ笈ｉ｝：
检分测析
蜂蜜中的四环素族抗生素两种常用检测方法的比较
朱丽云ｔ君叶憬，杨，
（＿１中国计量学院生命科学学院，浙江杭州３０１；．１０８２浙江中烟工业公司，浙江杭州３００）１０６
０９，收率分别为８．９回９７０％、７％、３微生物管碟法操作周期长，作繁琐，差较大，是灵敏度高，效液相色８８％。操误但高
谱法操作简单，测量准确，但是检测金霉素灵敏度没有微生物管碟法的高。
关键词：四环素族抗生素；生物管碟法；微高效液相色谱法；比较
强和线性范围宽等特点，传统意义上的化学分析方法
等方面＿】１。由于它们的广泛使用而造成的食品中抗生
（．ｏｅｅｆｉｃｎｅ，ｈａｉａｇｎｅｓｙＨｎｚｏ１０８ＺｅａｇＣｉ；．ｈｎｏａｃｈｊｎ１ＣｌｇＬｆＳｉｃｓＣｉｌｎｉｒｔａｇｈｕ３０１，ｈｊｎ，ｈａ２ＣｉＴｂｃｏｅａｇｌｏｅｅｎＪｉＵｖｉ，ｉｎａＺｉ
Ｈｏｅ．ＭｉｒｂｏｏｉａｕｅｉｌｔｕｔａｉｎｈｌｔｏｎＬＣ．ＴｈｉｅｒｒｎｅａｄｒｃｖｒｆｎｙｃｏｉｌｇｃｌｔｂｎｐａｅｃｌｖｔａｏｍｅｈｄａｄＨＰｉｏｅｌｎａａｇｎｅｏｅｙｏａｈｏｃｎｔｒａｃｎａｒｏｃｎｉｏｅｔｈｃｅｍｙｉ，ｅｒｍｙｉ，ｕｅｍｙｉｎｈｎｙｗｉｔｅＭＴＰｌｔｏｒ９４２０９２２０９６ａｄｈＣＨａｏｍｅｈｄｗｅｅ０．９，．９，．９１ｎ８％，８１％，７％ｒｓｅｔｖｌ，ＴｈｔｗｉｈＨＰＣｗｅｅ０９９９，９９７．９ｎ０％，８％，８％０８ｅｐｃｉｅｙａｔＬｒ．９０．９，０９９７ａｄ８７３ｒｓｅｔｅｙＰｒｃｉａｌＴａｏｍｅｈｄｈｓｇｏｅｓｔｉｙｂｔｃｎｉｅａｌｒｏｔｏｇｈｎｌｅｉｄｅｐｃｉｌ．ａｔｌＭＰＣｈｌｔｏａｏｄｓｎｉｖｔｕｏｓｄｒｂｅｅｒｒｗｉｌｎａｄｅｐｒｏｖｃｙｉｈａｄｉｔｉａｙｎｎｎｒｃａｄＨＰＬｅｅｍｉａｉｎｗｉｏｄａｃｒｃｎｏｖｎｅｃｕｓｅｓｔｉｎｃｍｐｒｓｎｃＣｄｔｒｎｔｔｇｏｃｕａｙａｄｃｎｅｉｎｅｂｔｅｓｓｎｉｉｔｉｏａｉｏ．ｏｈｌｖｙＫｅｒ：ｅｒｃｃｉｅａｔｂｏｉｓｙｗｏｄｓｔｔａｙｌｎｎｉｉｔ；ｍｉｒｂｏｏｉａｕｅｉａｅｃｌｖｔｎｈｌｔｏｃｃｏｉｌｇｃｌｔｂｎｐｌｔｕｔａｉａｏｍｅｈｄ；ｈｇｅｏｍａｃｉｏｉｈｐｒｒｎｅｆ

蜜环菌产漆酶的发酵条件

生物工程

䚢基采用综合马铃薯培养基 (CPDA)：葡萄糖20 g，新鲜土豆200 g(煮沸30 min 取滤液)，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB1 10 mg，水1000 mL，pH自然。基础产酶培养基(质量分数) [10] (有小部分调整)：葡萄糖2%，蛋白胨0.2%，MgSO 4 ·7H 2 O 0 . 1 5 % ， K H 2P O 4 0 . 3 % ， C a C l 2 0 . 0 0 1 % ， V B1 0.001%，微量元素80 mL。微量元素混合液组成 [11]：氨基乙酸 7.8×10 -3 mol，MgSO 4 ·7H 2 O 1.2×10 -2 mol， MnSO4·H2O 2.9×10-3 mol，NaCl 1.7×10-2 mol， FeSO 4·7H 2O 3.59×10 mol，CoCl 2 7.75×10 mol，CaCl 2·2H 2O 9.0×10 -4 mol，ZnSO 4·7H 2O 3.48×10 -4 mol，CuSO 4 ·5H 2 O 4×10 -5 mol， KAl(SO4)2·12H2O 2.1×10-5 mol，HBO3 1.6×10-4 mol，NaMnO4 4.1×10-5 mol。 1.3 培养条件采用50 mL培养液/250 mL三角瓶接种灭菌后，立即置于25 ℃、180 r/min振荡培养18 d。收获后滤出培养液待测，菌丝体80 ℃烘干称质量。试验均设3个重复。 1.4 粗酶液的的制备取产酶高峰期的发酵液，于4000 r/min常温离心15 min，上清液即为漆酶粗提液。 1.5 漆酶酶活的测定[12] 以愈创木酚为底物，4 mL 50 mmol/L(含1 mmol/L愈创木酚)琥珀酸钠缓冲液(pH4.5)，加入1 mL酶样液，混合均匀后置于30 ℃水浴保温反应30 min，于465 nm处测光吸收值。定义每分钟氧化1 μmol愈创木酚的酶量为一个酶活力单位。 2 结果与分析 2.1 蜜环菌的生长曲线和产酶曲线采用基础培养基，测定菌丝干重和漆酶活力随培养时间的变化(见图1)。蜜环菌到第16天生长量基本上达到峰值。漆酶是次级阶段泌出，与菌丝的生长不同步，到第16天测定菌丝干重达最高而酶活力在第18天出现峰值。 2.2 培养条件对蜜环菌产漆酶的影响 2.2.1 不同碳源对蜜环菌产酶水平的影响以蛋白

真菌漆酶的酶活测定方法评价

波波长为 465 nm[ 22] 。 2. 3 邻联甲苯胺法
以邻联甲苯胺作为测定漆酶酶活底物时 ( 表 3) , 以醋酸溶液为反应体系缓冲溶液, 其 pH 为 4 0或 4 6, 缓冲液浓度主要是 0 039、0 077 或 0 085 m o l /L 3种。底物浓度基本是 0 373 mm ol /L 或 0 420 mm o l/L。反应温度可选择在 40、30、28或
收稿日期: 2008- 04- 28 基金项目: 国家自然科学基金资助项目 ( 30671457) 作者简介: 林俊芳 ( 1962 ) , 男, 福建莆田人, 教授, 博士生导师, 研究方向: 生物转化与生物加工, E m ai:l lin j@f scau. edu. cn
2
生物加工过程
第 7卷
30
47
25
1
4 20
2
4 36
T ram etes villosa[ 21]
醋酸钠
0 100
50
0 50
50
4 20
注: 表中所列浓度指的是反应体系内的终浓度, 表示没有具体数据。
2. 2 愈创木酚法愈创木酚法测定漆酶酶活 ( 表 2) , 缓冲溶液常
用琥珀酸钠溶液, 终浓度为 0 05 m o l/L。缓冲溶液的 pH 基本为 4 5, 个别如磷酸钠缓冲溶液的 pH 则为 6 0。底物愈创木酚有 3种常用的终浓度 0 4、 0 8和 1 0 mm o l/L。反应温度基本都是在 30 进行, 而反应时间都是 30 m in。测定 OD 值变化的光
第 7卷第 4期 2009年 7月
生物加工过程 Ch inese Journa l o f B ioprocess Eng ineer ing

土壤漆酶测定方法

土壤漆酶测定方法土壤漆酶的测定可没那么神秘，就像探索一个小秘密一样呢。

咱先来说说比较常用的比色法。

这就像是给漆酶的活动拍个照，通过颜色变化来知道它的情况。

你得先采集土壤样本哦，把土壤从地里取出来的时候，就像从大地妈妈那里拿个小礼物一样。

采集好后，要对土壤进行预处理，把杂质什么的去掉，让漆酶能“清清白白”地接受检测。

然后准备一些特定的试剂，这些试剂就像是漆酶的小伙伴，它们碰到一起就会发生有趣的反应。

把处理好的土壤样本和试剂混合在一起，就等着看颜色的魔法啦。

如果漆酶在土壤里含量比较高，那颜色变化就会很明显，就像一个活泼的小孩在大声说“我在这儿呢”。

通过专门的仪器测量颜色变化的程度，就能算出漆酶的活性啦。

还有一种方法是酶联免疫吸附测定法，这名字听起来有点复杂，其实也很有趣。

这个方法就像是给漆酶做个标记，让它无处遁形。

同样要先把土壤样本准备好，然后利用漆酶和特定抗体之间的特殊关系。

抗体就像一个超级侦探，专门找漆酶这个小目标。

当它们结合的时候，又会产生一些信号，我们通过检测这些信号的强弱，就可以知道土壤里漆酶的多少啦。

这就像是一场小小的追逐游戏，抗体追着漆酶，然后我们就知道漆酶的情况了。

不过不管用哪种方法，在测定的时候都要特别小心哦。

就像照顾小宝贝一样，环境的温度、湿度都可能影响结果。

如果温度不合适，漆酶可能就会“闹小脾气”，不好好表现，测出来的结果就不准啦。

而且在操作过程中，每一步都要严格按照步骤来，不能马虎。

这就像搭积木，一块搭错了，可能整个城堡就不稳固了。

土壤漆酶的测定虽然有点小复杂，但只要我们认真对待，就像对待自己的小宠物一样细心，就能准确地知道土壤里漆酶的情况啦。

这样我们就能更好地了解土壤的健康状况，就像给土壤做个全面的体检一样呢。

蜜环菌栽培种培养基筛选及胞外酶活性测定

蜜环菌栽培种培养基筛选及胞外酶活性测定杨梅;桂阳;黄万兵;杨静;朱国胜;刘朝贵【摘要】为筛选出最适蜜环菌栽培生产种的培养基，通过生产种培养基组分筛选试验，测量第20天和第40天时菌丝或菌索的生长速度及其胞外酶活性并进行比较。

结果表明：在配方1（70％阔叶木屑，0％棉籽壳，17％麦麸，10％玉米面，1％蔗糖，0．3％磷酸二氢钾，0．2％硫酸镁，0．5％石灰，1％石膏，m水分∶m配料＝1∶1．3）中生长速度最大且最先长满管，且菌丝洁白，与其余不同培养料配方之间生长速度差异显著，而且栽培种培养基含木屑越多，菌株活力越好，越不易形成老化的红褐色菌索；在不同培养料和不同生长阶段其木聚糖酶活性大于CMC 酶和漆酶，漆酶活性最小，为十位级，其他2个酶为百位级；不同培养基中蜜环菌菌丝分泌的胞外酶活性具有显著性差异，但同种酶在不同培养料中酶活性的变化趋势一致。

说明，配方1 可作为蜜环菌适宜的栽培种培养基；不同培养料对胞外酶活性变化趋势影响小，但对其活性影响较大。

%In order to select the most suitable culture medium of A.mellea,the production of medium component was screened by measuring the A.hypha or bacteria growth speed and the extracellular enzyme activity,the authors compared between 20 and 40 days of hypha or rhizomorph of growth speed and extracellular enzyme activity.Results:Growth rate of the hyphae was the biggest and was the first full of tube and white in the formula(broadleaf sawdust70% ,cotton seed shell 0,wheat bran 17%,corn flour 10%,sugar1%,potassium dihydrogen phosphate 0.3%,magnesium sulfate 0.2%,lime 0.5%,gypsum 1%,mwater∶mmaterial=1∶1.3).The growth rate has obvious difference in different nutrient formula,and in culture medium,the morewood hyphae vitality the better,the more difficult to form a red brown rhizomorph;in different culture medium and different growth stages of the activity of xylanase and laccase enzyme is greater than CMC and laccase,the laccase activity is minimum for ten level,others for hundreds of level.Extracellular enzyme activity of A.mellea mycelia secretion of different medium has obvious difference,but the change trend in different culture medium in the same enzyme activity is consistent. Suggests that this formula can be used as armillaria suitable culture medium;different culture material has little effect on the enzyme activity changes in trend,but great influence on the activity of the extracellular enzyme.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2015(000)004【总页数】5页(P20-24)【关键词】蜜环菌;培养料;胞外酶;生长速度【作者】杨梅;桂阳;黄万兵;杨静;朱国胜;刘朝贵【作者单位】西南大学园艺园林学院，重庆 400715; 贵州省现代中药材研究所，贵州贵阳 550006;贵州省现代中药材研究所，贵州贵阳 550006;西南大学园艺园林学院，重庆 400715; 贵州省现代中药材研究所，贵州贵阳 550006;西南大学园艺园林学院，重庆 400715; 贵州省现代中药材研究所，贵州贵阳 550006;贵州省现代中药材研究所，贵州贵阳 550006;西南大学园艺园林学院，重庆 400715【正文语种】中文【中图分类】Q939.11蜜环菌[Armillaria(vaiil:Fr.)Kunllner]又名榛蘑，系伞菌目膨瑚菌科蜜环菌属的一种兼性寄生性真菌，广泛分布于世界各地林区[1]。

固态发酵生产蜜环菌饮料

固态发酵生产蜜环菌饮料肖嫩群;刘洪娜;张华玲;曾奥;郭抗萧;陈海强;谭周进【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2012(038)007【摘要】以蜜环菌固态发酵物为原料制得一种蜜环菌饮料。

以蜜环菌固态发酵物为原料，提取其中的多糖等营养和药效成分，进行风味调配，通过正交试验和感官评价的方法确定蜜环菌饮料的配方。

该发酵饮料的培养基配方为：白砂糖1．5％，大米80％，黄豆1％，麸皮10％，红薯7．5％；饮料配方为：蜜环菌发酵液添加比例为30％、白砂糖为20g／L、柠檬酸0．6g／L、黄原胶0．2g／L，测得成品饮料中各成分的含量为：多糖0．049mg／mL，还原糖0．042mg／mL，蛋白质53．0mg／mL，氨基酸1．226mg／mL。

饮料的感官指标、理化指标和微生物指标均达国家标准。

【总页数】4页(P212-215)【作者】肖嫩群;刘洪娜;张华玲;曾奥;郭抗萧;陈海强;谭周进【作者单位】湖南中医药大学药学院,湖南长沙410208;湖南中医药大学医学院,湖南长沙410208;湖南中医药大学医学院,湖南长沙410208;湖南中医药大学医学院,湖南长沙410208;湖南中医药大学医学院,湖南长沙410208;湖南省食用菌研究所,湖南长沙410013;湖南中医药大学医学院,湖南长沙410208【正文语种】中文【中图分类】TS275【相关文献】1.蜜环菌发酵保健饮料的研制 [J], 范贵增;马柯;熊大维;任新明2.蜜环菌发酵生产胞外漆酶的工艺优化 [J], 刘太林;吴胜迪;张妍3.蜜环菌保健饮料生产工艺的研究 [J], 李凤林4.蜜环菌健脑饮料的生产工艺 [J], 高晗5.天麻蜜环菌深层发酵生产工艺研究 [J], 李进进;邓愍民;杨明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

分光光度法测定植物过氧化氢酶活性的研究(精)

随着科学技术的发展和社会的进步,过氧化氢酶的用途越来越广泛。目前纺织业应用强氧化剂过氧化氢漂白脱色,而多余的过氧化氢可用过氧化氢酶去掉,以符合于环保的要求。医学上也可用低浓度过氧化氢清除坏死组织,然后再用过氧化氢酶反应多余的过氧化氢。葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶复合制剂还可用于防治动物肠道、胃部由细菌引起的一些疾病。因此过氧化氢酶的酶活力测定对于研究和应用此酶显得十分重要。
分光光度法测定植物过氧化氢酶活性的研究
李仕飞1刘世同2周建平2罗天雄2
(1泉州金桥食品有限公司,福建泉州362011;2襄樊学院化学与生物科学系,湖北襄樊441053
摘要:H
2O
2
在240n m波长下有强烈吸收峰,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A
240
随反应时间增加
而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。本试验是在其他反应条件相同的情况下,从相同质量的3种不同植物(小麦叶片、豌豆、黄瓜中提取的3种过氧化氢酶(A、B、C与同体积同浓度的过氧化氢作用,根据其反应速度的不同得出A、B、C的活性大小,从而得出了在质量相同的情况下从黄瓜中可以提取更多的过氧化氢酶。
K ey words:H ydrogen pero x i de;cata lase;spectrophoto me try
过氧化氢酶大量分布于动植物细胞内[1],同时需氧微生物代谢过程也会有大量的过氧化氢酶产生,其产生和存在是一动态过程。动物肝脏细胞代谢产生的过氧化氢量多,此酶大量积蓄,所以从动物肝脏提取过氧化氢酶是制备过氧化氢酶的一个重要途径;细菌和霉菌在发酵过程中也会有大量的过氧化氢酶释放于胞外,积蓄于发酵液中,通过生化制备方法得到纯度较高的过氧化氢酶可应用于工业生产和医学界。
240

蜜环菌培养.doc

1、蜜环菌培养基组分探讨12、蜜环菌子实体的液体培养13、蜜环菌子实体的液体培养14、蜜环菌母种培养基筛选试验l5、蜜环菌深层液体发酵条件研究16、蜜环菌不同发育阶段甲素和戊素含量变化研究17、蜜环菌不同发育阶段甲素和戊素含量变化研究1用漆树培养蜜环菌种植天麻初探018、蜜环菌固体培养特性19、蜜环菌的化学成分及其药理作用 110、蜜环菌抑菌作用的初步研究 111、蜜环菌液体发酵条件研究及其饮料开发 112、蜜环菌优良菌株的筛选、鉴定及对乌天麻产量的影响 013、蜜环菌发光条件的研究 114、不同树种树枝对蜜环菌生长的影响 115、蜜环菌培养基组分探讨 116、蜜环菌不同发育阶段多糖成分的研究 117、蜜环菌液对天麻试管快繁的影响 118、蜜环菌和天麻共生营养关系的放射性自显影研究 119、蜜环菌深层液体发酵条件研究 120、黑龙江省牡丹江林区蜜环菌的调查与鉴定 121、野生和人工培养的蜜环菌菌索营养成分比较 122、蜜环菌与第二营养对猪苓菌丝生长发育的影响 023、贵州蜜环菌资源及其生态研究 124、蜜环菌菌索多糖的分离纯化及其部分理化性质 125、蜜环菌抑制天麻种子发芽的研究 126、天麻营繁茎被蜜环菌侵染过程中细胞结构的变化 127、天麻栽培一种蜜环菌复壮的简易方法 128、蜜环菌深层发酵产多糖的研究 129、大兴安岭和长白山地区蜜环菌生物种的研究 130、中国蜜环菌生物种E与其它种的相互关系 131、天麻消化蜜环菌过程中超微结构的变化及酸性磷酸酶细胞化学定位 132、蜜环菌的化学成分 133、乙型蜜环菌对不同品种天麻产量及天麻素含量的影响 134、天麻、蜜环菌化感现象及天麻连作障碍原因探讨 035、蜜环菌半固体培养基培育方法 136、胡萝卜有利于蜜环菌生长 137、珍稀食药用菌——蜜环菌的开发与应用 138、蜜环菌的化学成分及应用研究 139、蜜环菌Am-1菌株的选育 040、蜜环菌的提纯复壮与诱变育种 141、蜜环菌菌索多糖对小鼠血糖及急性毒性作用研究 142、蜜环菌菌种的复壮研究 143、银耳蜜环菌醇提取物的心血管药理研究 144、蜜环菌侵染猪苓菌核的细胞学研究 145、板栗苞培养蜜环菌栽培种研究 146、蜜环菌水溶性多糖的分离纯化及结构研究 047、蜜环菌代天麻的研究概况 148、天麻与蜜环菌的共生匹配过程149、西藏蜜环菌生物学特性研究初报150、天麻与蜜环菌 151、用木屑加淀粉快速制蜜环菌菌种 152、丙型蜜环菌对天麻生物产量及天麻素含量的影响153、优质蜜环菌的标志及鉴别方法154、天麻病虫害的防治方法 155、天麻病虫害的防治方法 156、蜜环菌荧光条件及机理再研究 157、猪苓与蜜环菌的关系 158、培养蜜环菌的经济途径 159、培育天麻蜜环菌的新原料及方法1 ******60、天麻蜜环菌和萌发菌的分离培养 161、天麻球茎不同部位的细胞对蜜环菌侵染的反应 162、蜜环菌菌索多糖的免疫增强作用研究 163、蜜环菌胞外漆酶的合成、纯化及性质研究 164、天麻依存蜜环菌寄生木霉的研究 165、蜜环菌深层发酵液多糖的分离纯化和组成 166、蜜环菌子实体发生条件的初探 167、蜜环菌和猪苓的发育学及其二者的相互作用机理 068、天麻共生菌—蜜环菌的培育方法 169、蜜环菌成熟菌索的超微结构 070、中国蜜环菌生物种与北美种的交配关系 171、天麻病虫害防治方法 172、我国猪苓研究的进展 173、天麻病虫害的防治方法 174、蜜环菌液体深层发酵培养基的优选 175、速栽天麻培菌的新技术 176、天麻引种要点 177、蜜环菌激发子诱导猪苓细胞产生活性氧及其相关酶的变化 178、蜜环菌菌丝体液体培养条件的优化 1*****79、蜜环菌产多糖培养条件优化的研究进展 180、天麻生活史的研究 081、蜜环菌侵染后猪苓菌核防御结构的发生及功能 082、用蜜环菌发酵物代替天麻 1****83、蜜环菌栽培种培养基的筛选研究 1****84、天麻病虫害的防治方法 185、蜜环菌提取物对血清蛋白质合成及肝脏细胞色素P450含量的影响 186、蜜环菌高效分离技术 1****87、天麻蜜环菌棒排放的新方法 1****88、优质蜜环菌种的鉴别方法 1***89、中国蜜环菌生物种新记录1 ****90、天麻矿物质吸收及其营养机理探讨 191、蜜环菌固体发酵的研究1 ****92、不同蜜环菌菌株对乌天麻产量的影响1 ***93、天麻与紫萁小菇蜜环菌的营养关系及其在栽培中的应用1 ***94、天麻原球茎生长发育与紫萁小菇及蜜环菌的关系0 ****95、培育天麻要注意的问题 196、蜜环菌饮料的研制 1****97、天麻生长发育的营养研究进展 198、蜜环菌发酵保健饮料的研制1 ***99、天麻消化紫萁小菇及蜜环菌过程中细胞超微结构变化的研究 1100、蜜环菌菌种的分离与复壮0 ****101、芥黄蜜环菌交配型复等位基因的研究 0102、蜜环片的临床及生产工艺 0103、天麻新法栽培技术 1104、组织培养中天麻与蜜环菌共生机理的研究1 ***105、蜜环菌生物种及系统发育研究进展 1106、蜜环菌多糖分离纯化及其部分理化性质 1107、蜜环菌水溶性多糖的分离、纯化及组成分析 1108、蜜环菌根病 1109、蜜环菌培养及浸膏提取工艺的初步研究 1110、天麻的人工栽培技术——第二节蜜环菌菌棒和菌床的培育 1**** 111、蜜环菌保健饮料生产工艺的研究 1112、5株蜜环菌产几种胞外酶活性比较 1113、天麻产量与蜜环菌材和种源的关系1 ****114、人防地洞栽培天麻技术 1115、蜜环菌菌种保藏技术要点 1****116、天麻大型细胞消化蜜环菌过程中溶酶体小泡的作用 0117、蜜环菌对天麻生长的影响(简报) 1***118、蜜环菌多糖分离纯化及性质的研究 1119、蜜环菌的采集与培养1 ****120、蜜环菌抗杂分离及快速培养技术 1***121、蜜环菌对硒的耐受能力及硒对其多糖产率的影响 1****122、蜜环菌菌种分离新法——天麻组织分离法 1***123、蜜环菌菌种培养初报1 ****124、蜜环菌固体发酵的研究 1125、天麻的寄主——蜜环菌菌种培养基质的研究 1****126、猪苓菌丝生长的伴栽菌种选择 1***127、蜜环菌A_9培养基的筛选1 ***128、天麻菌材培育方法1 ****129、蜜环菌侵染天麻皮层过程中酸性磷酸酶的细胞化学研究0 *** 130、菌索接种蜜环菌的简易技术 1*****131、蜜环菌菌索培养特性的研究 1*****132、怎样防止天麻品种的退化 1**133、天麻室内菌床培植法1 ******134、快速培养蜜环菌种促进天麻速生高产新技术的研究 1**** 135、天麻代用品蜜环菌制剂及疗效观察 1***136、蜜环菌菌株遗传多样性RAPD分析 1137、长白山地区蜜环菌菌种的分离与筛选1 **138、蜜环菌栽培种培养料含水量试验1 ******139、引培法分离蜜环菌菌种技术1 ***140、蜜环菌胞外多糖的分离纯化及其性质研究 1141、天麻生产的夏秋管理1 ****142、蜜环菌和天麻、猪苓的关系及尚未大量人工驯化原因 1*** 143、蜜环菌枝条原种生产技术 1***********144、天麻菌材原料的开发 1**145、蜜环菌配方和培养方法的改进 1******146、天麻病虫害的防治方法 1147、天麻高产栽培新技术 1*****148、蜜环菌的研究进展 1***149、天麻吸收蜜环菌营养机制的细胞学研究0 ***150、天麻蜜环菌同步播种栽培法1 ********151、天麻蜜环菌同步栽培法 1******152、天麻蜜环菌、萌发菌母种生产技术1 ****153、天麻蜜环菌棒排放的新方法 1****154、天麻蜜环菌和萌发菌的分离培养1 **********155、天麻蜜环菌棒排放新方法 1156、培育天麻蜜环菌的新原料及方法 1157、天麻蜜环菌棒排放新方法 1158、天麻蜜环菌沙箱同步栽培法1 ****159、天麻蜜环菌同步播种栽培法1160、天麻蜜环菌同步播种栽培法1161、天麻蜜环菌同步播种栽培法 1162、袋装天麻蜜环菌菌种制作技术 1***163、天麻蜜环菌同步播种栽培法 1164、天麻蜜环菌的特征与特性 1***165、怎样培育天麻蜜环菌材 1****166、天麻蜜环菌棒排放的新方法 1***167、天麻蜜环菌的培育 1**168、天麻蜜环菌同步播种栽培法 1***169、天麻蜜环菌母种培养基0 **170、蜜环菌根病 0**171、菌索接种蜜环菌的简易技术1 ****172、怎样防止天麻品种的退化1 **173、天麻室内菌床培植法 1174、天麻室内塑料袋栽培 1***175、蜜环菌栽培种培养料含水量试验1 *****176、引培法分离蜜环菌菌种技术1 ***177、蜜环菌枝条原种生产技术 1***178、蜜环菌配方和培养方法的改进1 ***179、蜜环菌母种培养基筛选试验1 **180、新法快速繁殖蜜环菌1 **181、天麻与蜜环菌 1182、天麻共生菌——蜜环菌的培养及其在福建的最适菌材与最适生态变种的探讨1 ***183、有关栽种天麻的几个问题 1**184、天麻低产原因何在 1185、液体培养蜜环菌对碳氮源的利用试验 1***186、密环菌液体种子培养法 1**187、天麻节料高产栽培技术的研究1188、棉籽壳压块栽培蜜环菌 1****189、峡渝01蜜环菌的发现与培育 1190对建立小草坝林场天麻替代菌材配料基地请示的批复0191“鄂天麻一号”栽培技术要点1地洞栽培天麻试验报告 1192天麻室内速生高产栽培技术 1陆凤英栽培天麻致富1193天麻栽培的几项关键措施1天麻(上) 1194雷公山人工培植天麻获得成功 1 谈谈人工栽天麻 1 毛竹林中种天麻 1195低山区野外冬栽天麻技术1196剪下的果枝烧掉可惜 1 天麻产量与蜜环菌材和种源的关系 1197箱栽天麻配套技术 1优质菌材胡枝子的栽培1 利用圆叶杨菌材栽培羊肚菌初报 1 198繁殖天麻大有可为 1 林内天麻栽培技术 1天麻箱栽法 1天麻箱栽图说 1199天麻双扣膜栽培1林间栽天麻技术1天麻生物学特性研究1200天麻的高产栽培1 杨树种植天麻试验研究初报1 北方天麻的箱栽技术1 天麻生产技术规程(Ⅱ)1 天麻的室内栽培技术 1201天麻高产栽培模式1 天麻长虫如何杀灭1202秋栽天麻技术1 天麻共生菌—蜜环菌的培育方法 1 栽培天麻究竟能不能赚钱? 1203天麻双层箱固定菌材高优栽培技术要点1 天麻的台板式覆砂栽培技术1 天麻箱栽 1 204人工林杨树代栎种植天麻试验1 天麻仿野生栽培新技术 1 天麻的收获与加工1205坑棚栽培天麻 1 用菌枝培养优质蜜环菌材（上）0 天麻原种室内袋式河沙高产栽培技术研究 1206天麻原种室内袋式河沙高产栽培技术研究1 室内怎样栽天麻 1 绿天麻栽培技术 1207天麻种子林园繁殖高产新模式1 天麻(下) 1 天麻的地道栽培 1 桑柞树下种天麻 1208防空洞内栽培天麻的高产措施 1 天麻箱栽图解 1 天麻猪苓混栽模式 1 天麻的第二营养来源研究 1209适宜培养蜜环菌的材料0 天麻一代和多代栽培对比及添加配料试验 1210张自强的箱栽天麻一步法 1 天麻栽培管理技术要领 1 有趣的天麻栽培 1211科技天麻人工栽培技术研究0 箱养天麻1 天麻的几种常用栽培方法 1212大个体天麻高产优质栽培技术研究 1 天麻栽培的主要技术及其对产量的影响 1213天麻状元谈麻经1 秋栽天麻如何引种1 蜜环菌伴栽天麻的几种方法1 天麻仿野生栽培技术(二) 1。

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石酸钠为缓冲液时, 底物 ABT S 的用量只有 100 L , 酶液只需 30 L , 均远远少于以琥珀酸为
第 4 期吴涓等: 蜜环菌胞外漆酶酶活力的分光光度法测定 · 89 5·
缓冲液时的用量. 因 ABT S 价格昂贵, 故综合考虑认为以酒石酸钠为缓冲液较好.
收稿日期: 2000-06-02 基金项目: 安徽省科委自然科学基金资助项目( 98212411) 作者简介: 吴涓( 1969- ) , 女, 讲师( 现在安徽大学生命科学学院工作) .
· 8 94 · 厦门大学学报( 自然科学版) 2001 年
· 8 96 · 厦门大学学报( 自然科学版) 2001 年
度一个单位变化所需的酶液量来表示( OD/ min) . 由图 1 可见, 在每一个温度下, 酶活力随时间的延长均呈现先上升后下降的趋势, 且都在 30 min 时达到最高, 其中以 25 ℃下 30 min 时的酶活力最高( 3. 15×10- 2 OD / min) . 当反应时间相同时, 以 25 ℃下酶活力最高, 其次是 37 ℃, 30 ℃下酶活力最低. 故本方法中以 25 ℃, 30 min 为最适测定条件. 2. 3. 2 以琥珀酸钠为缓冲液
( 表 4) . 由于底物和酶液的用量都很少, 所以反应时间对酶活力的影响并不显著. 而随着酶液量的加大, 在相同反应时间下, 酶活力逐渐减小, 说明相对于底物而言, 酶液是过量的. 当底物
∶酶液为 100∶50 时酶活力最高. 实验还发现, 方法 2 的反应比较稳定, 无需以冰浴终止反应,
因为方法 2 中底物和酶液的用量比方法 1 少得多; 而且比较表 3, 4 不难发现( 采用同一种酶
液) , 用方法 2 所测得的酶活力远远高于方法 1. 显然, 方法 2 优于方法 1.
2. 3 以愈创木酚为底物测定
漆酶活力
表 4 反应时间和底物及酶液用量对漆酶活力的影响 T ab. 4 Effects on laccase activity of time and am ount of
1 材料与方法
1. 1 菌种
蜜环菌( A rmillaria mellea) 由上海农业科学院食用菌研究所提供.
1. 2 主要试剂与仪器
ABT S 和丁香醛连氮为美国 SIGMA 公司产品, 邻联甲苯胺和愈创木酚以及其它试剂均
为国产分析纯试剂. 主要仪器有: PHS3E 数字式 pH 计, 7230 分光光度计, T GL -16 高速台式冷冻离心机.
氮 -二( 3-乙基苯并噻唑-6-磺酸) ( 简称 A BT S) 、丁香醛连氮、愈创木酚和邻联甲苯胺为底物, 比较了
这 4 种底物对漆酸的敏感性, 探讨了酶反应时间、温度、缓冲液及其 pH 值和底物与酶的用量等条件
对漆酶催化反应的影响. 实验结果表明, 适宜的测酶条件可以确保漆酶活力的测定快速而准确.
3. 0 m L 反应液中含 20 mmol/ L ABT S 0. 7 mL , 酶液 0. 1 mL 和 25 mm ol/ L 琥珀酸缓冲液( pH 4. 5) , 在 25 ℃下反应 2 min 后立即用冰浴终止反应, 测定 436 nm 处[ 12] 吸光度的增量.
表 2 表明, 用这两种方法测出的酶活力相差不大, 以琥珀酸为缓冲液时较高一些. 但以酒
表 1 缓冲液 pH 值和底物及酶液用量对漆酶活力的影响 T ab. 1 Effects o n laccase activ ity o f buffer pH and am ount
of substrate and enzyme
A BT S/ L 酶液/ L 酶活力/ IU ·L- 1( 缓冲液 pH= 3. 0) 酶活力/ IU ·L- 1( 缓冲液 pH= 4. 5)
表 3 反应时间和反应条件对漆酶活力的影响 T ab. 3 Effects of reaction time and r eaction co ndition o n laccase activ ity
反应时间酶活力/ IU ·L - 1 酶活力/ IU ·L - 1
/ min
( 不冰浴)
( 冰浴)
缓冲液酒石酸钠( pH 3. 0, A BT S∶酶为 100∶30)
L accase activity/ IU ·L - 1
1*
2* *
1 594
5 36
中反应, 测定 25 ℃下 525 琥珀酸( pH 4. 5)
1 673
6 48
nm 处[ 4] 吸光度的增量, 并 * 1 代表酶液取自静置培养 36 d 的发酵液;
2. 2 以丁香醛连氮为底物测定漆酶活力
2. 2. 1 方法 1
用 0. 5 mmol/ L 丁香醛连氮 0. 2 m L 和 1. 8 m L
表 2 缓冲液对漆酶活力的影响 T ab. 2 Effect of buffer on laccase activity
酶液在 1. 5 mL 、50 mm ol/ L 的磷酸缓冲液( pH 6. 0)
酶活单位( IU/ L ) .
2 结果与讨论
2. 1 以 ABT S 为底物测定漆酶活力
2. 2. 1 以酒石酸钠为缓冲液
3. 0 m L 反应液中含 1 m mol/ L ABT S 100 L , 50 mm ol/ L 酒石酸钠缓冲液和适量酶液,
在 25 ℃下反应 2 min 后立即用冰浴终止反应, 在 420 nm 处[ 6] 测定吸光度的增量. 实验考察了
根据底物的不同, 在不同的温度、时间、波长等条件下, 采用分光光度法测定漆酶活力, 对
照为不加底物, 以消除发酵液颜色的干扰. 各种缓冲液的配制方法见文献[ 13] . 需特别指出的是, 对于不同的底物, 它们与漆酶反应生成的产物其最大吸收波长是不同的, 本文中采用的波
长均来自文献( 见下文) . 定义在 25 ℃条件下每分钟使 1 mol 的底物转化所需的酶量为一个
在不同的反应时间测定酶 * * 2 代表酶液取自静置培养 19 d 的发酵液 .
活力. 在实验过程中发现,
吸光度不太稳定, 因此采取冰浴和不冰浴两种终止反应的方式来探讨最适测定条件, 比较结果见表 3.
表 3 结果表明以下规律: 首先, 随反应时间的延长酶活力逐渐下降. 其次, 不冰浴终止反应时测出的酶活力普遍比以冰浴终止反应时要高. 在不冰浴条件下虽然酶活力较高, 但测定过程中吸光度不太稳定, 所以此方法有待改进.
100 100 100 100 100 30 50 70 90 100 249 229 232 194 202 117 205 205 187 174
3. 0 时的酶活力. 显然, 在 pH 3. 0
的缓冲液中, 当 ABT S∶酶为 100∶30 时酶活力最大, 为 249 IU / L .
2. 1. 2 以琥珀酸为缓冲液
1. 3 漆酶发酵液的制备
将固体斜面上刮下的菌索在匀浆器中与无菌水混合, 匀浆后接种到发酵培养基中, 在 25
℃和 pH 5. 8 条件下摇瓶培养( 160 r/ min) 或静置培养, 在不同时间取出一定量的发酸液经 12 000 r/ m in 离心 20 min, 取上清液用于测试酶活力.
1. 4 漆酶活力的测定
吴涓1, 肖亚中1, 王怡平1, 李清彪2
( 1. 安徽大学生命科学学院, 安徽合肥 230039; 2. 厦门大学化学工程系, 福建厦门 361005)
摘要: 采用分光光度法测定蜜环菌( A r millar ia mellea) 胞外漆酶 ( L accase) 的活力, 分别以 2, 2’-连
缓冲液 pH 值以及底物与酶的用量对漆酶活力的影响, 结果见表 1.
由表 1 可以看出, 在 pH 3. 0 的缓冲液中, 随着酶液量的增加, 酶活力均低于 ABT S ∶ 酶为 100 ∶30 时的酶活力. 当缓冲液 pH 值为 4. 5 时, 酶活力在 ABT S∶酶分别为 100∶50 和 100∶70 时均很高, 随后呈下降趋势, 但都低于 pH
第 40 卷第 4 期 2001 年 7 月
厦门大学学报( 自然科学版)
V ol. 40 N o. 4
Journal of Xiamen University ( Nat ural Science)
Jul. 2001
文章编号: 0438-0479( 2001) 04-0893-06
蜜环菌胞外漆酶酶活力的分光光度法测定
关键词: 漆酶; 底物; 酶活力
中图分类号: O 657. 3
文献标识码: A
蜜环菌( A rmillaria mellea) 胞外漆酶( L accase) 是多酚氧化酶的一种, 它是一种含铜的蛋白质, 可催化多酚或某些氨类物质发生氧化反应. 许多研究表明, 木素降解与酚氧化酶有着必然联系. 有文献报道, 漆酶是贝壳状革耳菌( Panus conchatus) 在固体培养条件下的主要木素降解酶[ 1] . 还有人指出, 只有在漆酶和木素过氧化物酶的协同作用下, 木质素的降解才明显[ 2～4] . 近年来国外正致力于将漆酶等木素降解酶应用于造纸业, 以环境安全的生物制浆法取代传统的化学制浆法[ 5] , 而漆酶活力的测定则是这些研究的重要基础. 长期以来, 人们已在实践中摸索建立了许多测定漆酶活力的方法. 测 O2 法是较早采用的一种方法, 测量漆酶催化反应中的耗氧量即可间接推知其活力, 此法后来改进为氧电极法和氧吸收法[ 6] . Badiani 等人根据漆酶催化的氧化反应机理建立了测定漆酶活力的高压液相色谱法[ 6] . 70 年代 Wood 等人提出用极谱法分析漆酶活力, 但其灵敏度远低于比色法[ 7] . 阎宏涛等人采用了脉冲激光光声光谱法来测定漆酶活力, 在同一测定条件下该方法与分光光度法比较, 灵敏度提高了 3 个数量级, 可以有效地用于低含量酶的检测[ 8] . 分光光度法则是较普遍采用的一种方法[ 9～12] , 与高压液相色谱法相比, 它不需要昂贵的仪器, 操作简便快捷, 对实验条件的要求也不是太高, 因此应用更为普遍. 本文利用漆酶能氧化酚类和芳胺类化合物的特性. 分别以 ABT S、丁香醛连氮、愈创木酚和邻联甲苯胺为底物, 采用分光光度法比较了这 4 种底物对漆酶的敏感性, 以及反应时间、温度、缓冲液及其 pH 值和底物与酶的用量等条件对漆酶催化反应的影响.