硝酸还原酶活性测定
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硝酸还原酶(NR)活性测定试剂盒说明书
硝酸还原酶（NR）活性测定试剂盒说明书硝酸还原酶（Nitrate Reductase，NR）活性测定试剂盒说明书微量法100管/96样注意：正式测定前务必取23个预期差异较大的样本做预测定测定意义：NR（ EC 1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。
测定原理：NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ +NADH+H＋→ NO2ˉ +NAD＋ +H 2 O；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸及α 萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：诱导剂储备液：液体50mL×1瓶，4℃保存。
提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体10mL×1瓶，20℃保存。
试剂二：液体5mL×1瓶，20℃保存；试剂三：液体6mL×1瓶，4℃保存（如出现结晶析出，60℃90℃水浴溶解后使用）；试剂四：液体6mL×1瓶，4℃保存。
试剂五：标准储备液1mL，20℃保存。
诱导剂应用液的配制：用时将诱导剂储备液稀释10倍，即取10mL诱导剂储备液加90mL蒸馏水，充分混匀。
0.1umol/mL的标准液的配制：用时将试剂五稀释100倍，即取 0.1ml试剂五加9.9mL蒸馏水，充分混匀。
样本前处理：动植物组织样品的前处理:（1）取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），浸泡2h，取出样本，滤纸吸干。
（2）按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
硝酸还原酶活性测定实验报告
硝酸还原酶活性测定实验报告硝酸还原酶活性测定实验报告引言：硝酸还原酶是一种重要的酶类，在生物体内负责将硝酸盐还原为亚硝酸盐。
硝酸还原酶活性的测定对于研究生物体对硝酸盐的代谢和环境污染物的检测具有重要意义。
本实验旨在探究硝酸还原酶的活性测定方法，并通过实验验证其可行性和准确性。
材料与方法：1. 实验材料：- 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）- 0.1 mol/L 硝酸钠溶液- 0.1 mol/L 硫酸铵溶液- 1% 硫胺素溶液- 10% 硝酸盐还原酶提取液- 10% 硝酸盐还原酶抑制剂- 2% 硝酸盐还原酶底物溶液- 0.1 mol/L 硫酸铵铵铁硫氰化物溶液- 0.1 mol/L 醋酸溶液- 蒸馏水2. 实验仪器：- 分光光度计- 定量移液器- 离心机- 恒温水浴槽- 试管架- 显微镜实验步骤：1. 提取硝酸盐还原酶：a. 取一定量的样品（如细胞或组织），加入磷酸盐缓冲液，用搅拌器充分破碎。
b. 将破碎后的样品转移至离心管中，以12000 rpm离心10分钟。
c. 取上清液，即为硝酸盐还原酶提取液。
2. 硝酸还原酶活性测定：a. 准备一组空白对照组，加入相同体积的磷酸盐缓冲液代替硝酸盐还原酶提取液。
b. 准备一组实验组，加入一定体积的硝酸盐还原酶提取液。
c. 分别加入一定体积的硝酸钠溶液、硫酸铵溶液、硫胺素溶液和硝酸盐还原酶底物溶液。
d. 在恒温水浴槽中，将反应体系恒温30分钟。
e. 加入硝酸盐还原酶抑制剂停止反应。
f. 加入硫酸铵铵铁硫氰化物溶液，使反应产生红色沉淀。
g. 加入醋酸溶液，混匀后离心10分钟。
h. 取上清液，以分光光度计测定其吸光度。
结果与讨论：通过实验测定，我们得到了一组吸光度数据。
根据吸光度与硝酸还原酶活性之间的关系，我们可以计算出样品中硝酸还原酶的活性。
在本实验中，我们采用了硫酸铵铵铁硫氰化物法测定硝酸还原酶活性。
该方法利用硝酸还原酶将硝酸盐还原为亚硝酸盐，再与硫酸铵铵铁硫氰化物反应生成红色沉淀。
硝酸还原酶活性的测定
将试验材料使用打孔器打成圆片，混合均
匀后分别称取2份，每+ 份1g左右，编号后按 表2加入多种试剂：
三角瓶号 0.2mmol/L磷酸缓冲液（mL） 0.2mmol/LKNO3溶液（mL） 30%三氯乙酸（mL）
1
2
4.0 4.0
5.0 5.0
1.0 0
在针筒中进行反复抽气，直到放气后叶片变 软并沉入溶液；将针筒中混合溶液和叶片取 出放入编号三角瓶中，在30℃、暗条件下保 温30min；取出后立即向2号瓶加入1mL 30% 三氯乙酸以终止酶反应。
(按顺序加试剂)
取样 称量、编号 加缓冲溶液 暗处保温 抽气
测吸光光度值
显色反应
取1mL
绘制亚硝酸钠 原则曲线
计算含量
六、成果与计算
❖ 把在原则曲线上查得旳NaNO2含量代入下式， 计算硝酸还原酶活性：
NaNO2含量(µg) ×稀释倍数 NR活性[NaNO2(µg)/鲜重(g)·h]=
样品重(g)×时间(h)
❖ 离体法需将材料磨成匀浆，经过滤或离心除 去残渣，以上清液为硝酸还原酶粗酶液进行 测定。因为研磨中NADH受损失，必需外加 NADH方可测定。
❖ 活体法直接用鲜活组织进行测定。环境中旳 NO3-进入细胞后，被硝酸还原酶还原成NO2并扩散到细胞外在溶液中积累，测定溶液中 NO2-旳含量即可得知硝酸还原酶活性旳大小。
❖ 活体法不破坏细胞原有旳酶反应系统，NADH 可由代谢反应不断生成，无需外加。活体法 简便、迅速，不需要珍贵仪器设备及低温条 件，但反复性欠佳，应作一定量旳反复。
❖ 本试验采用活体法测定硝酸还原酶活性。
二、原理
❖ 硝酸还原酶可将NO3-还原成NO2-：
❖ NO3-+NADH+H+ NR NO2- +NAD + +H2O ❖ 在一定条件下，NO2-旳生成量与硝酸还原酶
硝酸还原酶活力测定
NR活性(μg NO-2 /g鲜叶/h)
查标准曲线得NO-2浓度（μg） × 24％ ＝
0.5g × 0.5 小时× 1ml
10ml
55％
21％
九、注意事项
1.取样前叶子需进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，否则 酶活性低。 2.叶片要用打孔器取样(或用剪刀剪成大小一致的小块)。 3. 无机磷对NR活力有促进作用，因此常用磷酸缓冲液。 4. 活体法酶促反应在暗条件下进行，以防止亚硝酸盐还原为氨。 5.亚硝酸的磺胺比色法比较灵敏，显色速度受温度和酸度等因素的影
NR
NO-3+ NAD(P)H+H+
NO-2+ NAD(P)++ H2O
亚硝酸还原酶催化亚硝酸盐还原为铵：
硝酸还原酶是一种诱导酶，诱导物是 NO3- ，光照可促进硝酸盐的还原过程。
诱导酶：又称适应酶，指植物体内本来不含有，
但在特定外来物质的诱导下可以生成的酶。如硝
酸还原酶可为NO3-所诱导。
例如，水稻幼苗本无硝酸还原酶，但如果培养
植物生理生化实验
二.目的要求
1、了解NR测定对植物氮代谢的重要意义 及实际应用。 2、了解离体法和活体法测定NR的不同点。
3、掌握活体法测定NR的原理及其技术要点。
4、掌握测定过程相关仪器的使用方法。
55％ 21％ 24％
三、原理：
硝酸还原酶可以将NO3-还原成NO2-，其反应为： NO3-+NADH+H+
响。 因此标准液与样品的测定应在相同条件下进行，方可比较。
6.叶片要抽气，使叶圆片中的空气抽去而沉于溶液中。
思考题：
1．测定硝酸还原酶的材料为什么要提前一天施用
实验报告 硝酸还原酶活性的测定word文档良心出品
首都师范大学生命科学学院实验报告实验题目硝酸还原酶活性的测定一、实验原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于NO 使之还原为NO 。
NO -+ NADH + H +— NO 2- + NAD ++ H 2O产生的NO 可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。
因此，测定反 应液中NO 含量的增加即表明酶活性的大小。
NO 含量的测定----磺胺法NO 2-与磺胺和-萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物，用比色法在520nm 下读 取光密度值。
—、实验用品1. 材料：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗2. 仪器和用具：722型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液 枪，tip 头(两种规格：1000卩I ，200卩I ) 三、实验步骤1. 分别配制反应液于小烧杯中(1) 0.1M 磷酸缓冲液5ml +蒸馏水5ml(2) 0.1M 磷酸缓冲液 5ml + 0.2MKNQ 5ml 2. NO 2-的获得(1) 称取新鲜叶片0.5g 共四份,剪成小片，分别置于小烧杯内的反应液中。
(2) 在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部，溶液即可渗入组织内取代其 中的空气，内部产生的NO 可渗透到外部溶液中。
3.将小烧杯转到30 r 温箱,使其不见光,保温20min 。
4.用5卩g/ml NaNQ 母液配制标准梯度溶液 5、4、3、2、1、0.5、0.1、 0 卩 g/ml 。
5.吸取不同浓度的NaNOmI 于试管中，加入磺胺试剂2ml 及a -萘胺试剂2ml ，混 合均匀，在60r 水浴中保温20min ，于比色杯中，在520nm 下进行比色，读取光 密度，然后做出光密度一浓度曲线，以光密度为纵坐标， 体步骤及结果如下表和下图所示。
课程名称植物生理实验 实验时间2010331成绩姓名唐倪文班级_3学号 1090800032NaNO 浓度为横坐标。
具试剂管号12 3 4 5 6 7 8 NaNO 母液(ml)0 0.02 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ml ） 1 0.98 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1%磺胺(ml)22 2 2 2 2 2 2 0.2 %a -萘胺 (ml) 22 2 2 2 2 2 2 每管亚硝酸氮含 量（卩g ） 0 0.1 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 每管NaNO 浓度 （卩 g/ml ） 0 0.1 0.5 1.02.03.04.05.0 光密度0.0150.0520.1040.2020.3020.3960.493小麦幼苗完全培养液缺N 培养液KNOHO KNO HO 小麦鲜重（g ） 0.51 0.51 0.49 0.48 光密度0.178 0.176 0.065 0.039 亚硝酸钠浓度 （卩 g/ml ） 1.791 1.7710.6540.392亚硝态氮含量 （卩g ） 1.791 1.771 0.654 0.392 酶活性105.39104.1840.0424.505.吸取反应液各1 ml 于试管中加入磺胺和粉红色化合物.用比色法在520nm 下读取光密度值，从标准曲线上查得NO 的含量, 结果如下表。
实验八硝酸还原酶活性的测定
实验八硝酸还原酶活 性的测定
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果与分析 • 结论与讨论 • 参考文献
01
实验目的
了解硝酸还原酶的特性
硝酸还原酶是一种氧化还原酶，负责 将硝酸盐还原成亚硝酸盐，是植物和 微生物进行氮代谢的重要酶之一。
了解硝酸还原酶的特性，有助于深入 理解氮代谢的生物学过程，为农业生 产、生物固氮等领域提供理论支持。
预期结果
在实验前，根据相关文献和理论知识，预测实验 结果并制定预期目标。
结果比较
将实际实验结果与预期结果进行比较，分析两者 之间的差异和一致性。
结果分析
根据比较结果，分析实验中可能存在的问题和误 差来源，提出改进措施和建议。
05
结论与讨论
实验结论总结
硝酸还原酶活性在不同植物组织中存在 差异，表明该酶在不同组织中的功能和 作用可能有所不同。
03
04
在试管中加入适量的酶 液和硝酸盐底物。
将试管放入恒温水浴中， 设定适宜的温度进行反 应。
在反应过程中，定时取 样检测亚硝酸盐的生成 量。
通过分光光度计测定亚 硝酸盐的吸光度值，记 录数据。
数据记录和处理
1
记录每个取样的时间、亚硝酸盐的吸光度值。
2
根据吸光度值绘制亚硝酸盐生成曲线，计算酶活 性。
3
分析实验数据，得出硝酸还原酶活性测定的结果。
04
实验结果与分析
实验数据记录
实验数据记录表
在实验过程中，需要详细记录每 个实验步骤的实验数据，包括酶 液浓度、反应时间、反应温度等。
数据记录的准确性
确保实验数据的准确性是至关重 要的，因此需要使用精确的测量 工具和可靠的记录方法。
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果与分析 • 结论与讨论 • 参考文献
01
实验目的
了解硝酸还原酶的特性
硝酸还原酶是一种氧化还原酶，负责 将硝酸盐还原成亚硝酸盐，是植物和 微生物进行氮代谢的重要酶之一。
了解硝酸还原酶的特性，有助于深入 理解氮代谢的生物学过程，为农业生 产、生物固氮等领域提供理论支持。
预期结果
在实验前，根据相关文献和理论知识，预测实验 结果并制定预期目标。
结果比较
将实际实验结果与预期结果进行比较，分析两者 之间的差异和一致性。
结果分析
根据比较结果，分析实验中可能存在的问题和误 差来源，提出改进措施和建议。
05
结论与讨论
实验结论总结
硝酸还原酶活性在不同植物组织中存在 差异，表明该酶在不同组织中的功能和 作用可能有所不同。
03
04
在试管中加入适量的酶 液和硝酸盐底物。
将试管放入恒温水浴中， 设定适宜的温度进行反 应。
在反应过程中，定时取 样检测亚硝酸盐的生成 量。
通过分光光度计测定亚 硝酸盐的吸光度值，记 录数据。
数据记录和处理
1
记录每个取样的时间、亚硝酸盐的吸光度值。
2
根据吸光度值绘制亚硝酸盐生成曲线，计算酶活 性。
3
分析实验数据，得出硝酸还原酶活性测定的结果。
04
实验结果与分析
实验数据记录
实验数据记录表
在实验过程中，需要详细记录每 个实验步骤的实验数据，包括酶 液浓度、反应时间、反应温度等。
数据记录的准确性
确保实验数据的准确性是至关重 要的，因此需要使用精确的测量 工具和可靠的记录方法。
硝酸还原酶活性的测定.
硝酸还原酶活性的测定一、原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，与作物吸收和利用N肥有关的不同品种，年龄、器官组织以及环境条件对硝酸还原活性都有影响，硝酸还原酶作用于NO3使还原为NO2NO3⎯+NADH+H→NO2⎯+NAD+H2O产生的NO2⎯可以从组织内渗到外界溶液中，并积累在溶液中因此测定反应溶液中NO2⎯的含量的增加，即表明酶活性的大小。
NO2⎯含量的测定用对氨基苯磺酸化比色法，亚硝酸对氨基苯磺酸和α-萘胺在酸性条件下生成红色化合物，颜色在2-3小时稳定，可用比色法定量，该法非常灵敏，能测定每毫升0.5微克的Na NO2。
二、仪器和药品721型分光光度计（或其他型号比色计），剪刀，真空泵（或注射器），小天平，温箱，烧杯，移液管，小烧杯（50ml）0.2MKNO3：将20、22克KNO3溶于100ml蒸馏水中。
0.1M磷酸缓冲液（PH=7.5）：将85.2%ml 1/15M磷酸氢二钠与14.8ml 1/15M磷酸二氢钾混合均匀。
1/15MNa2HPO4溶液：1000ml中含Na2HPO4•2H2O11.878克。
1/15M溶液：1000ml中含KH2PO49.078克。
对氨基苯磺酸试剂：1克对氨基苯硝酸加加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml.。
α–萘胺试剂，0.2克α–萘胺加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml。
NaNO2标准溶液：1克NaNO2用蒸馏水溶解至1000ml，然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1000ml，该溶液每毫升含有NaNO2 5微克，用时稀释之。
三、实验步骤：1、将新鲜叶片（蓖麻、向日葵、小麦、棉花等），用水冲洗净，并用吸水纸吸干，用剪刀剪成小块(注意块小为宜)，然后在小天平上称取等重的两份叶片，每份约0.5克。
分别置于含有下列溶液的小烧杯中。
（1）1M磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml（2）0.1M磷酸缓冲溶液5ml+0.2M KNO35ml然后将小烧杯置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后叶片便沉于底部（如没有真空泵，也可以20ml注射器代替，将反应液及叶片一起倒入注射器使之真空，如此进行抽气、放气反复多次，溶液即可渗入叶组织内取代了叶片内的空气，叶片便沉于溶液底部），取出小烧杯置于30℃温箱中，使不见光保温作用30分钟。
实验三 硝酸还原酶活性测定
3. 材料与试剂
两种处理的小麦： 两种处理的小麦：水 (ck)， KNO3（N） ， ） A液：磷酸缓冲液: 水: DNP溶液 蔗糖溶液 ＝ 5: 5: 1: 1 液 磷酸缓冲液 溶液: 溶液 B液：磷酸缓冲液: KNO3: DNP溶液: 蔗糖溶液 ＝ 5: 5: 1: 1 液 溶液
磷酸缓冲液(pH7.5): 0.2mol/L； KNO3溶液 0.2mol/L 溶液: 磷酸缓冲液 ； DNP (2-4-二硝基苯酚 溶液 1mmol/L； 蔗糖溶液 2.5mmol/L 二硝基苯酚)溶液 二硝基苯酚 溶液: ； 蔗糖溶液:
NO2-含量测定（磺胺比色法） 含量测定（磺胺比色法）
在酸性溶液中， 与磺胺形成重氮盐，重氮盐再与α在酸性溶液中，NO2-与磺胺形成重氮盐，重氮盐再与 萘胺偶联，形成紫红色的偶氮化合物。该偶氮化合物在 540nm有最大吸收峰，可以用分光光度计测定（OD540）。 有最大吸收峰， 有最大吸收峰 可以用分光光度计测定（
酶反应要在暗条件下进行的原因是叶绿体在光合作用时可产生 亚硝酸还原酶的辅酶铁氧还蛋白， 亚硝酸还原酶的辅酶铁氧还蛋白，与亚硝酸还原酶同时存在时 可还原NO2- ，所以在暗条件下进行反应可阻止 所以在暗条件下进行反应可阻止NO2- 的继续反 可还原 以保证测定结果的准确。 应，以保证测定结果的准确。
处 理 A液 吸光度 [ NO2- ] NR活性 活性 B液 吸光度 [ NO2- ] NR活性 活性
（uMol/ml）（uMol/h•gfw） ） ）
（uMol/ml）（uMol/h•gfw） ） ）
H2 O KNO3 对照 [ NO2- ] （uMol/ml）= 0.0026＋0.359OD520 ） ＋ NR活性（ NO2- , uMol/h•gfw）= [ NO2- ] ×10ml/1ml ÷（鲜重 ×0.5h） 活性（ 鲜重g× 活性 ） ）
实验七、硝酸还原酶活性测定
根据实验数据得出结论，分析硝酸还原酶活性的影响因素
影响因素分析
根据实验数据，分析影响硝酸还原酶活性的因素，如温度、pH值、底物浓度等。通过对比不同条件 下的活性数据，评估各因素对酶活性的影响程度。
结论得出
基于数据分析结果，得出硝酸还原酶活性测定的结论，总结实验结果，阐述实验中得出的规律和趋势 。
对比不同样品之间的硝酸还原酶活性差异
问题与改进
在实验过程中，我们也遇到了一些问题，如操作 不规范导致的误差、数据波动等。针对这些问题 ，我们应加强操作规范性，提高实验的准确性和 可重复性。
对未来实验的展望与改进建议
拓展实验内容
未来我们可以进一步研究硝酸还原酶活性在不同生长阶段、不同环境 条件下的变化，以更全面地了解其在植物生长和发育中的作用。
硝酸还原酶通常由两个组成部分：血红素蛋白和铁硫蛋白，它们共同作用将硝酸盐 还原为亚硝酸盐。
硝酸还原酶对环境条件敏感，如温度、pH值和抑制剂等，这些因素会影响酶的活性。
硝酸还原酶活性测定的基本原理
硝酸还原酶活性测定的基本原理 是通过测量一定时间内亚硝酸盐 的生成量来计算硝酸还原酶的活
性。
在实验条件下，加入一定量的硝 酸盐作为底物，酶促反应一段时 间后，测定亚硝酸盐的生成量。
实验七、硝酸还原酶 活性测定
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 数据分析与结论 • 实验总结与展望
01
实验目的
了解硝酸还原酶活性测定的原理
硝酸还原酶是植物体内一种重要的酶， 负责将硝酸盐还原成亚硝酸盐，进而 参与植物的氮代谢过程。了解硝酸还 原酶活性测定的原理有助于深入理解 植物的氮代谢机制。
02
确保所有溶液的浓度和比例符合 实验要求。
硝酸还原酶活性的测定
实验二、硝酸还原酶活性的测定-活体法[原理]：硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般以每克鲜重含氮量表示，即以ug.g-1.h-1为单位。
NR 的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
[试剂]1．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于去离子水后定容至1 000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml-1的标准液；2．0.1molpH7.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4.12H2O30.0905g与NaH2PO4.2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml；3．1%（W/V）溶液：1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.L-1HCL中（25ml浓盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.L-1HCL）；4．0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，贮于棕色瓶中；5．0.1mol.L-1KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250Ml 0.1mol.L-1Ph7.5的磷酸缓冲液中；6．0.025mol.L-1Ph 8.7 的磷酸缓冲液：8.864 0g Na2HPO4.12H2O，0.0570g KH2OP4.3H2O，溶于1 000ml去离子水中；7．30%三氯乙酸溶液：30g三氯乙酸。
水溶后定容至100ml。
[方法]摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。
以亚硝态氮（ug）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（Y）建立回归方程。
2.样品中硝酸还原酶活力测定1.在取材的前一天加50mmol/L KNO3或NaNO3到培养苗的水中就可以诱导酶的产生。
硝酸还原酶活力的测定
硝酸还原酶活力的测定硝酸还原酶是一种催化硝酸还原反应的酶，它在许多生物体中具有重要的功能。
测定硝酸还原酶活力是研究生物体硝酸还原代谢的关键方法之一。
本文将介绍测定硝酸还原酶活力的原理、方法和应用。
一、原理硝酸还原酶活力的测定原理基于硝酸还原酶催化硝酸还原为亚硝酸的反应。
该反应可以测定硝酸还原酶活力的大小。
一般使用还原性染料作为指示剂，如甲基蓝(Methylthioninium chloride)、二甲基对苯二胺(Diaminobenzidine)等。
这些染料在还原状态下呈现出不同的颜色，可以通过测量吸光度的变化来间接测定硝酸还原酶活力。
二、方法1.准备工作（1）制备硝酸还原酶提取液：从待测生物组织中提取硝酸还原酶，常用的提取液包括磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液等。
（2）制备工作液：一般为硝酸还原酶提取液、辅酶(NADH)溶液、染料溶液等混合制备的试剂。
2.测定步骤（1）取一定量的硝酸还原酶提取液加入工作液中，使最终反应体系中硝酸还原酶的浓度适宜。
（2）将反应体系在适当的温度下孵育一定时间，使反应达到平衡。
（3）加入染料溶液，使反应体系中的染料还原。
（4）立即测量反应体系中染料的吸光度，记录下初始吸光度值。
（5）在一定时间内，每隔一段时间重复步骤(3)和(4)，记录下吸光度值。
（6）根据吸光度的变化，绘制反应体系中染料吸光度随时间的曲线。
（7）根据曲线的斜率，计算出硝酸还原酶的活力。
三、应用硝酸还原酶活力的测定在许多领域中有重要的应用价值。
1.农业领域：硝酸还原酶活力的测定可以用于评估土壤中硝酸盐的还原能力，从而指导农作物的施肥管理。
2.食品安全领域：硝酸还原酶活力的测定可以用于检测食品中硝酸盐的含量，从而评估食品的安全性。
3.环境科学领域：硝酸还原酶活力的测定可以用于评估水体和土壤中硝酸盐的还原能力，从而研究生态系统的健康状况。
4.医学领域：硝酸还原酶活力的测定可以用于评估人体内硝酸盐的代谢水平，从而研究心血管疾病等疾病的发生机制。
硝酸还原酶(NR)活性的测定
硝酸还原酶(NR)活性的测定硝酸还原酶(NR)活性的测定主要采用光度法和荧光法。
光度法测定硝酸还原酶活性的步骤如下：1. 准备0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)。
2. 准备硝酸钠(NaNO3)的不同浓度标准溶液。
3. 取一定量的细胞提取物，加入适量的磷酸盐缓冲液，使得体积总量达到一定的体积。
4. 在一条白色或透明的96孔板中，分别加入相同体积的磷酸盐缓冲液和不同浓度的NaNO3标准溶液。
5. 加入适量的细胞提取物到每一孔中，混匀。
6. 在适当的温度下孵育一定的时间。
7. 加入 Griess 试剂（硫酸铁铵与草酰胺的混合溶液）到每个孔中。
8. 在深色环境下，测量每个孔的吸光度值。
9. 利用吸光度值与所加入的NaNO3标准溶液浓度之间的关系，绘制标准曲线。
10. 根据待测样品的吸光度值及标准曲线，计算出硝酸还原酶活性。
荧光法测定硝酸还原酶活性的步骤如下：1. 准备0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)。
2. 准备硝酸钠(NaNO3)的不同浓度标准溶液。
3. 取一定量的细胞提取物，加入适量的磷酸盐缓冲液，使得体积总量达到一定的体积。
4. 在一条黑色的96孔板中，分别加入相同体积的磷酸盐缓冲液和不同浓度的NaNO3标准溶液。
5. 加入适量的细胞提取物到每一孔中，混匀。
6. 在适当的温度下孵育一定的时间。
7. 加入荧光探针（如草酰胺二乙酸盐,DAF-FM DA）到每个孔中。
8. 在荧光酶标仪中，设置适当的激发波长和发射波长，测量每个孔的荧光强度。
9. 利用荧光强度与所加入的NaNO3标准溶液浓度之间的关系，绘制标准曲线。
10. 根据待测样品的荧光强度及标准曲线，计算出硝酸还原酶活性。
植物生理学实验实验三 硝酸还原酶活性测定
当磺胺与α-萘胺均过量时，所生成的红色深浅与NO2-含量成 直线关系。
NO2-含量标准曲线： [ NO2- ](µmol/ml) = 0.0026＋0.359OD540
NR活性(NO2- , µmol/h•gfw)
=
[NO2-] (µmol/ml)×稀释倍数 鲜重(g)×时间(h)
硝酸还原酶活性测定
⑥ 取A液和B液1ml代替反应液，加入2ml磺胺试剂和2mlα-萘胺试剂，作 为对照管，在540nm测定样品的吸光值（以蒸馏水为对照） 。
5. 结果与分析
分析硝酸盐对硝酸还原酶活性的影响。
处理
H2O KNO3 对照
A液
B液
吸光度 [ NO2- ] NR活性
吸光度 [ NO2- ] NR活性
（uMol/ml）（uMol/h•gfw）
（uMol/ml）（uMol/h•gfw）
[ NO2- ] （uMol/ml）= 0.0026＋0.359OD540 NR活性（ NO2- , uMol/h•gfw）= [ NO2- ] ×10ml/1ml ÷（鲜重g×0.5h）
6. 注意事项
① 抽真空放气后，摇晃直至ห้องสมุดไป่ตู้段沉于溶液中； ② 硝酸还原过程应在黑暗中进行； ③ 磺胺试剂和α-萘胺试剂加入时，注意顺序； ④ 正确使用分光光度计； ⑤ 避免移液管使用交叉感染。
1. 实验目的意义
硝酸还原酶（EC.1.6.6.1，缩写NR）是硝酸盐同化中第一 个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植 物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响， 因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之 一，也可作为品种选育的指标之一。
➢掌握硝酸还原酶活性的测定方法 ➢了解硝酸还原酶的特性
硝酸还原酶活性的测定(活体法)
主要试剂
• 0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液 • 0.2mol/L KNO3 • 磺胺试剂 • α-萘胺试剂 • 亚硝酸钠标准液
实验器材
• 天平 • 真空泵 • 分光光度计 • 恒温箱 • 剪刀 • 试管 • 小烧杯 • 移液管
取材
1. 取十棵小麦，称量叶片1.2克，用剪刀将叶片剪成0.2-0.5cm 小段，在A4纸上混匀。
9 ml
10-3 10-4 10-5
9ml蒸馏水作对照
步骤
在每一皿中放一张滤纸→整齐放入 20粒种子→中缝朝向滤纸，加盖→ 放入25℃温箱中→三天后测定不同 处理中的平均根数。（3勺种子）
意义
盐类或有机物从细胞中渗出，进入周围环 境中。通过电导度的测量，可以测知物质 的外渗，表明植物受害的情况。
实验器材
电导仪，冰 箱, 恒温箱，恒温 水浴器，量筒， 烧杯，镊子，玻 棒等。
实验步骤
1. 豆芽30株，切取中段1－2cm 长（用刀片），10株一组，分 三组，分别放于小烧杯内。
2.处理 60℃ 温箱、 -20 ℃ 冰箱（放在白瓷盘内，
在520nm波长下读取光密度。
用什么溶液调100%？
对比标准曲线，查出亚硝态氮的含量。
• 以亚硝酸钠量（ µg ）为横坐标，以光密度为纵坐标， • 绘制光密度-含量标准曲线。
根据标准曲线计算反应液中所产生的亚硝态氮量。
X × V1/V2
样品中酶活性 （ug / g·h）＝
反应时间（0.5hr）×样品重量（g）
硝酸还原酶活性的测定（活体法） 不良环境对植物的伤害
生长素类物质对根芽生长的影响
张晓燕
中国农业大学生物学院
1. 每 两 组 取 十 株 小 麦 ， 用 剪 刀 将 叶 片 剪 成 小 于 0.5cm小段，在A4纸上混匀。