第四课 哺乳动物总RNA提取及电泳

总RNA 的提取、电泳检测及浓度和纯度的测定撰写人：黄晶一、实验原理1、总RNA的提取见分子克隆（第三版）上册P522 “用一步法从细胞和组织中同时制备DNA、RNA和蛋白质”2、RNA的电泳见分子克隆（第三版）上册P540 “按大小分离RNA: 在含有甲醛的琼脂糖凝胶上进行的RNA电泳”3、RNA的浓度及纯度测定见分子克隆（第三版）下册P1695 “DNA或RNA的分光光度法测定”二、实验准备1、配制0.1%的DEPC水，37℃培养箱内放置过夜，之后灭菌两次。

2、准备大、中、小进口枪头各一盒，1.5ml进口离心管、0.2ml 进口PCR管各一瓶，灭菌两次（公用）3、准备研钵（n）、勺子（n+1）、50ml、100ml量筒各一个，180℃烤4小时以上（n=提取RNA的个数）4、10×MOPS缓冲液、甲醛、30％双氧水、胶布、氯仿（sigma）、异丙醇（sigma）、75％乙醇（以上试剂及物品公用，实验前请确定其是否齐备）三、实验步骤（一）总RNA的提取1．液氮研磨组织，取100mg组织，加入1ml Trizol，室温放置5min2．加入200ul氯仿，剧烈振荡混匀，室温放置3min，之后4℃，12000g,离心15min 3．上清移入新管，加入1/5体积的氯仿，剧烈振荡混匀，室温放置3min, 之后4℃，12000g,离心15min4．上清移入新管，加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10min,之后4℃，12000g,离心15min5．弃上清，加入1ml 75%乙醇，振荡，4℃，7500g,离心5min6．弃上清，室温晾干，之后加入40ul DEPC水溶解（RNA不要完全干燥，否则不利于溶解）（二）RNA的电泳1．用3％-30％的双氧水浸泡RNA专用的电泳槽及胶板、梳子10分钟以上2．之后用0.1%的DEPC水洗涤3．配制1.2%的含有甲醛的琼脂糖凝胶1）称取0.36g RNA专用的琼脂糖，加入24ml DEPC水，熔化后冷却到60℃2）加入3ml 10×MOPS，混匀后再加入3ml甲醛，之后再加入3ul EB4．用DEPC水配制1×MOPS 100ml作为电泳缓冲液，55V 预电泳30-40min5. RNA电泳样品的制备1）将6ul RNA样品、1ul 10×MOPS、1ul甲醛、2ul RNA上样缓冲液混匀2）65℃加热10min,之后冰浴2min,短暂离心后可上样6．60V 电泳30-40min7．紫外检测（三）RNA浓度及纯度的测定1. 运行分光光度计中测定RNA的程序2. 200ul DEPC水作为空白, 5ul RNA样品+295ul DEPC水作为测量样品3. 测量的RNA样品的OD260/280应在1.8-2.0之间4. RNA样品的实际浓度等于分光光度计显示浓度ｘ60四、注意事项1. 整个实验过程中要戴口罩、一次性手套，一次性手套应经常更换，防止污染RNase2. 实验试剂及物品大多数为公用，请养成良好的实验习惯，用毕放回原处，试剂或物品用完或快用完，告知负责人，及时补充3．烤箱不能过夜工作，以免发生火灾4．DEPC为疑似致癌物，操作时应戴口罩、手套，小心吸取，避免污染实验台及物品注：10×MOPS的配制方法0.627g MOPS溶于12ml DEPC水中，加入1.2ml 1M NaAc (DEPC水配制)，用2M NaOH 调pH 7.0, 加入0.75ml 0.2M EDTA, 之后加入DEPC水定容为15ml。

PCR技术详细步骤－从RNA抽提到电泳鉴定(2010-04-21 21:16:04)转载标签：分类：须一技之长，专业杂谈RNA抽提一，准备工作1，实验器具与材料：（1）移液枪：1ml、200ul、10ul（2）吸头：1ml、200ul、20ul（3）吸头台：放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个（4） EP管1.5ml、100ul（5）玻璃研磨器（6）容量瓶：1000ml（7）盐水瓶：100ml（8） 15ml塑料管一个（配75％乙醇用）2，实验器具的处理与准备（1）塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。

（2）玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）先泡酸过夜，冲洗干净后，在1‰DEPC水中泡8小时左右，37℃烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3次。

（3）金属制品：（镊子等）先洗干净，再送干烤3次。

（不需要泡DEPC水）3，试剂配制和准备：（1） DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。

配75％乙醇的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压。

（2） 75％乙醇（要在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无水乙醇＝1:3），然后放于-20℃备用。

（3）异丙醇：放入棕色瓶（4）氯仿：放入棕色瓶（5） Trizol：100ml/瓶存放于4℃二，抽提时注意事项：全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。

三，抽提步骤1．匀浆化作用取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP 管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。

总RNA的提取和电泳一、实验目的和原理完整的RNA提取和纯化是进行RNA方面的研究工作的前提（Northern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR等）。

在RNA制备过程中，必须注意控制RNA酶的活性，0.1%DEPC或者RNase Away TM试剂可以有效去除RNA酶，在实验过程中的实验器具和实验用水均需经过DEPC水处理。

二、试剂1)TRIzol试剂2)氯仿3)0.1% DEPC水：与5L蒸馏水中加入5 ml DEPC,充分混匀，置37℃过夜，然后高温高压灭菌，分装，4℃保存备用。

4)75%乙醇：需用DEPC处理水配制，75 ml 100%乙醇中加入DEPC水置总体积为100 ml。

5)PBS缓冲液:称量试剂NaCl 8g，KCl 0.2g ，Na2HPO4 1.42 g，KH2PO4 0.27g 至于1L烧杯中，向烧杯中加入800mL的去离子水，充分混匀，滴加HCl将PH调节至7.4，然后定容为1L，高温高压灭菌后，室温保存。

三、实验步骤（Trizol法提取总RNA）1.样品处理：1)单层贴壁细胞直接向直径为3.5cm的培养板中加入1mL TRIzol溶解细胞，通过移液管分次移出细胞裂解物。

取1mL裂解物移至一个1.5mL离心管中，室温放置5min。

或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀，加入相应量的TRIzol。

2)动物组织对动物组织进行匀浆处理，在装有新鲜动物肝脏组织匀浆中加入相应体积的预冷Trizol，每50-100mg样品加1mlTrizol，充分混匀。

静置10min，12000rpm，4°C 离心15min。

2.加入1/5体积（200μL）的氯仿，剧烈颠倒混匀15-30s，勿剧烈涡旋震荡，室温静置2-3min可见分层，如此重复几次使液体充分分层。

12000 ×g，4℃离心15 min。

离心后，溶液分为有机相和水相，中间有一层蛋白质层，RNA 在上层水相层。

从RNA抽提到电泳鉴定——以肌肉组织基因为例1、RNA抽提一，准备工作1，实验器具与材料：移液枪吸头吸头台EP管玻璃研磨器容量瓶盐水瓶15ml塑料管一个（配75％乙醇用）2，实验器具的处理与准备（1）塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。

（2）玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）先泡酸过夜，冲洗干净后，在1‰DEPC水中泡8小时左右，37℃烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3次。

（3）金属制品：（镊子等）先洗干净，再送干烤3次。

（不需要泡DEPC水）3，试剂配制和准备：（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4 小时后备用。

配75％乙醇的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压。

（2 ）75％乙醇：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无水乙醇＝1:3），然后放于-20℃备用。

（3）异丙醇：放入棕色瓶（4）氯仿：放入棕色瓶（5）Trizol：100ml/瓶存放于4℃二，抽提时注意事项：全程佩戴一次性手套和口罩并尽可能在低温下操作，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。

三，抽提步骤1．匀浆化作用取约100mg动物肌肉组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml 的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。

颠倒混匀10下，室温静置5分钟。

细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块。

组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管。

2．分离阶段每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。

盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其充分混匀，室温静置5分钟。

实验四RNA的提取及其纯度检测实验目的：了解Trizol提取总RNA的原理，掌握高质量完整总RNA提取的技术以及电泳变性胶电泳检测和浓度及纯度鉴定方法。

实验原理Trizol是一种酚与异硫氰胍的混合物，非常容易把组织和细胞中的总RNA提取出来。

在加入氯仿离心后，RNA保留在水相中，与DNA和蛋白质分离开来（保留在有机相中）。

吸取水相，加入异丙醇成淀RNA，从而得到完整纯度高的总RNA。

实验内容材料小鼠新鲜肝试剂总RNA提取纯化试剂：Trizol(Invitrogen)；DEPC(Amersham)，无水乙醇，已丙醇；电泳试剂：TAE，上样缓冲液（50%甘油，10 mM EDTA，0.25% 溴酚蓝，0.25%二甲苯青），琼脂糖。

操作步骤总RNA的提取1小鼠肝组织的匀浆裂解断颈处死小鼠，立即解剖取出肝脏，取50-100mg到玻璃匀浆器中，假如1mlTrizol反复匀浆膜碎组织，使细胞完全裂解。

按1 ml Trizol加入0.2 ml氯仿，震荡15秒，室温放置3分钟，12000×g，4℃离心15分钟。

2 RNA的沉淀将离心的上清转移到新的离心管中，按1 ml Trizol加入0.5ml异丙醇，震荡15秒，室温放置10分钟，12000×g，4℃离心10分钟。

3 RNA的洗涤与溶解吸掉上清，加入1 ml 75% 乙醇洗涤沉淀，4℃，7500×g离心5分钟。

吸掉上清，空气干燥RNA沉淀10分钟，加入适量的DEPC处理水（50μl）溶解RNA，立即电泳和紫外浓度和纯度鉴定，剩余-70℃保存备用。

结果在凝胶上可以看到一般可以看到三条带，其中从上样孔开始对应的带的分别是28S,18S和5S，其中18S和28S的条带明显清晰，而5S的带比较弱，28S的带的亮度是18S带亮度的2背左右，说明RNA保持完整。

紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度总RNA用10mM的Tris-HCl(pH8.0)稀释，利用紫外分光光度计测定A260和A280值，根据1OD=40ug定量,并计算A260/A280比值，每一样品重复3次。

实验十一 动物组织细胞总RNA 的提取一、实验原理RNA 是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。

对RNA 进行操作在分子生物学中占有重要地位。

获得高纯度和完整的RNA RNA 是很多分子生物学实验所必需的，如是很多分子生物学实验所必需的，如Northern 杂交、杂交、cDNA cDNA 合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA 的质量。

由于细胞内的大部分RNA 是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA 时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA 分离，释放出RNA RNA。

再通。

再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA 与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA RNA。

在提取的过程中要。

在提取的过程中要抑制内源和外源的RNase 活性，保护RNA 分子不被降解。

因此提取必须在无RNase 的环境中进行。

可使用RNase 抑制剂，如DEPC 是RNase 的强抑制剂，常用来抑制外源RNase 活性。

提取缓冲液中一般含SDS SDS、酚、、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂，也能抑制RNase 活性。

并有助于除去非核酸成分。

本实验介绍异硫氰酸胍法和TRIzol 法提取动物组织总RNA 并通过电泳并通过电泳 进行鉴定。

进行鉴定。

二、仪器和试剂1.1.仪器：仪器：仪器：超净工作台、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、振荡器、移液器、吸头、Ep 管、玻璃匀浆器、试管、玻璃匀浆器、试管、玻璃器皿洗净后置180℃烘烤8h 8h；不耐高温的器皿（如塑料制品）应用；不耐高温的器皿（如塑料制品）应用0.1% DEPC 浸泡2h,702h,70～80℃烘烤～80℃烘烤干燥，120℃高压20min 20min，再，再7070～80℃烘烤干燥方可使用。

～80℃烘烤干燥方可使用。

～80℃烘烤干燥方可使用。

2.2.试剂：试剂：试剂：(1)(1)细胞裂解液：细胞裂解液：细胞裂解液：异硫氰酸胍异硫氰酸胍 4mol/L 4mol/L柠檬酸钠（柠檬酸钠（pH7.0pH7.0pH7.0）） 25mmol/L十二烷基肌氨酸钠十二烷基肌氨酸钠 0.5% 0.5%β-巯基乙醇巯基乙醇 0.1mol/L 0.1mol/L称取柠檬酸钠0.64g 0.64g，十二烷基肌氨酸钠，十二烷基肌氨酸钠0.415g 0.415g，吸取，吸取β-巯基乙醇0.7ml 0.7ml，用无，用无Rnase 的蒸馏水溶解，定容至50ml 50ml。

1 实验背景目的基因的获得RT-PCRNorthern 杂交cDNA 克隆 差异显示为什么提取RNA ？第一讲总RNA 的提取和电泳检测1 实验背景蛋白质, DNA, RNA, 糖类, 脂质, 多肽, 小分子物质等目标产物分离纯化杂质生物大分子提取的依据1 实验背景生物分子间差异电荷溶解度生物学性质亲和性物理化学性质分子量形态1 实验背景生物大分子提取流程原料的选择、前处理粗提纯化浓缩和保存样品分析与检测生物大分子提取的一般原则1 实验背景完整性纯度效率一级结构高级结构产量经济一般原则2 实验设计mRNA的特性单链线性分子核蛋白体核糖核酸，不稳定性，易被降解（2,3位有一OH，反应活性高）均一性: rRNA（28S、18S、5.8S、5S，占80%）mRNA（1%～5%）tRNA和小分子RNA （10%～15%)容易被RNA酶（RNase）破坏2 实验设计提取RNA的来源细菌酵母血液动植物组织（小鼠脾细胞）培养细胞同一来源的不同组织（如植物幼嫩叶片、成熟根和茎等）如何从脾细胞中提取总RNA？2 实验设计RNA 提取的基本过程浓缩检测脾细胞获得、培养12345纯化逆转录保存2 实验设计RNA 酶哪里有？外源：环境、器皿、耗材、试剂内源：组织本身含有的RNA酶RNA酶有链内二硫键，所以抗长时间煮沸和温和变性剂，变性后迅速重新折叠；RNA酶不需要二价阳离子激活，所以EDTA没用最好的办法是避免污染2 实验设计如何避免RNA酶的污染？试剂专用，最好使用新开封的，分小份保存，用后丢弃器皿、耗材、取液器专用勤换手套尽量简化操作步骤、缩短提取过程，以减少各种有害因素对RNA的破坏，把杂质的污染等降到最低程度等在操作中避免讲话使用RNA操作专用台2 实验设计如何破坏RNA酶的活性？变性剂：异硫氰酸胍、苯酚（蛋白质变性）、氯仿（除脂）等异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶变性剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。

实验二、总RNA的提取和电泳一、总RNA的提取（Tripure法）（一）试剂和仪器：组织匀浆器，离心管(DEPC处理)Tripure液（异硫氰酸胍，水饱和酚），氯仿，异丙醇，75% 冰冷乙醇（用DEPC处理过的水配制），无RNase水， DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液：按1∶1000体积比将DEPC加入到灭菌双蒸水中，室温放置过夜，然后高压消毒。

（二）样品准备：1．悬浮培养细胞: 300×g, 4℃离心收集1×10 8个细胞;用25 ml预冷的1×PBS漂洗细胞,离心收集;去上清,加1ml Tripure液,裂解。

2．贴壁培养细胞：计算好1×108个细胞所需培养瓶数后，用胰酶消化，离心收集细胞，细胞裂解同上。

3．组织：将50-100 mg新鲜或液氮冰冻组织置于匀浆器中，加入1ml Tripure液，匀浆。

（三）抽提方法：1．取500μl组织匀浆液移至一个1.5ml 离心管中，室温放置5分钟。

2．加入100μl氯仿，颠倒混匀15秒钟，室温放置2-3分钟。

3．4℃，12000g离心15分钟。

4．小心吸取上层水相至一个新的1.5ml 离心管中。

注意不要吸出中间层，该层富含蛋白质。

5．加250μl的异丙醇与样品颠倒混匀，置室温10分钟沉淀RNA。

6．4℃，12000g，离心10分钟沉淀RNA。

7．弃上清，加75%预冷乙醇500μl，漂洗沉淀。

10 7500g，离心5分钟。

弃上清。

11 室温干燥5分钟。

不宜完全干燥，否则沉淀难以溶解。

12 将RNA溶于20μl无RNase水中。

用紫外分光光度计分别测定样品在260nm和280nm的吸光度值估算RNA的收率和纯度，琼脂糖电泳鉴定RNA的质量，-70℃保存备用。

对于长期保存，RNA应重新补充NaAc（pH5.0）至0.25mol/L，再加入2.5倍体积乙醇， -70℃保存。

注意事项：1．所有玻璃器皿洗干净后，应在180℃至少干烤3h以上；所有塑料器皿均应用DEPC处理后，高压灭菌；操作时应勤换手套，禁止讲话。