蛋白质复性名词解释
蛋白质是由氨基酸组成的生物大分子，是构成生物体各种组织和器官的重要成分。蛋白质的功能多样，可以参与生物体内的酶催化、结构支持、运输、通信、能量存储、免疫防御等重要生理过程。
蛋白质的复性是指它的折叠状态和三维结构。蛋白质
synthesized 是在生物体内通过一系列复杂的生物化学反应合成的，但它不是以线性链的形式存在，而是经过折叠和组装形成复杂的三维结构。这个过程被称为蛋白质的折叠，而折叠之后形成的三维结构就是蛋白质的复性。
蛋白质的复性是非常关键的，因为它决定了蛋白质的功能和稳定性。如果蛋白质的复性受到破坏，它可能失去原有的生物活性和功能。例如，当蛋白质的复性受到变性剂（如酸、碱、高温等）的作用时，蛋白质的结构可能会发生改变，导致其在生物体内无法正常发挥作用。
蛋白质的折叠和复性是一个自发的过程，在正常生理条件下，蛋白质可以自行正确地折叠成其稳定的复性。但有时蛋白质的折叠过程会出现错位或失败，导致其形成不正确的复性。这种情况下，被称为蛋白质的错折，错误复性的蛋白质可能会失去原有的功能，甚至产生有害的效应。
蛋白质折叠和复性的控制是一个复杂的过程，涉及到多个层面的调节。通常，蛋白质的折叠主要由其氨基酸序列所决定，不同氨基酸之间的相互作用力（如氢键、离子相互作用、范德华力等）在折叠过程中扮演重要的角色。此外，还有一些蛋白质专门参与蛋白质折叠和复性的分子辅助工具，如分子伴侣和分子伴侣辅助因子等，它们能够帮助蛋白质正确折叠和达到稳定的复性。
总之，蛋白质的复性是指其折叠和组装成稳定的三维结构的过程，它对蛋白质的功能和稳定性起着关键作用。探索蛋白质复性的机制对于理解生物大分子的结构与功能具有重要意义，也对于研究蛋白质相关疾病和开发药物具有重要价值。
安徽农业科学，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉ．Ｓｃｉ．２００８，３６（１４）：５８０１—５８０３ 责任编辑张杨林责任校对卢瑶 包涵体蛋白的复性研究进展 夏启玉１，２ ７肖苏生 ，邓柳红 ，易，Ｊ＇４ ，张春发 ＊ （１ 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口５７１１０１；２．海南大学农学院，海南儋州５７１７３７） 摘要介绍了包涵体的洗涤、变性溶解和传统的复性方法，详细阐述了包涵体蛋白的层析复性方法以及复性过程中的添加剂效果。 关键词 包涵体；变性；层析复性；添加剂 中图分类号 Ｑ７８ 文献标识码Ａ 文章编号０５１７－６６１１１（２００８）１４－０５８０１—０３ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｂｏｄｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＸＩＡ Ｑｉ－ｙｕ ｅｔ ａｌ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｉｋｏｕ，Ｈａｉｎａｎ ５７１１０１） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｅ ｗａｓｈｉｎｇ，ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ ｗｅｒｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｅｘｐａｔｉａｔｅｄ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｔｈｅ ａｄｄｉｔｉｖｅ ｉｍｐａｃｔ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ；Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ；Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ；Ａｄｄｉｔｉｖｅ 基因工程技术的飞速发展为大规模生产目标蛋白质提 供了可能，大肠杆菌因其易于操作、遗传背景清楚、发酵成 本低和蛋白表达水平高等优点，成为生产重组蛋白的首选 表达系统。外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵 体的形成，包涵体易于分离纯化，并能避免蛋白酶对外源蛋 白的降解，但包涵体不溶且无生物学活性。因此，如何高效 地复性包涵体蛋白是基因工程技术面临的一个难题。笔者 对包涵体蛋白的复性研究进展作一综述，旨在为促进基因 工程技术的发展提供理论依据。 １包涵体简介 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集形成的无活 性固体颗粒。一般含有５０％以上的重组蛋白，其余为核糖体 元件、ＲＮＡ聚合酶、内毒素、外膜蛋白、质粒ＤＮＡ以及脂体、 脂多糖等，一般直径大小为０．５～１．０ ＬＬｍ，呈非水溶性。包涵 体主要是因为重组蛋白的表达量过高，表达过程中缺乏某 些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次 级键等原因形成的。 ２包涵体的前处理 ２．１洗涤 由于包涵体中的重组蛋白与部分破碎的细胞 膜、膜蛋白及脂体粘连在一起，所以在溶解包涵体之前要先 洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如２ ｍｍｏｌ／Ｌ尿素在５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｓ ｐＨ值７．０～８．５，１ ｍｏｌ／ＬＥＤｒｒＡ中洗涤。高浓度的 变性剂能使包涵体溶解。此外可以用温和去垢剂Ｔｉｌｔ。 Ｘ－１００ 洗涤去除膜碎片和膜蛋白。 ２．２溶解包涵体的溶解常用强的变性剂，如尿素（浓度８ ｍｏｔ／Ｌ）和盐酸胍（ＧｄｎＨＣ１，浓度６￣８ ｍｏｌ／Ｌ），通过离子间的 相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而使部分包涵体蛋白 溶解。尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。 此外，去垢剂也能溶解部分包涵体。如强的阴离子去垢剂ＳＤＳ 和ｓａｒｋｏｓｙｌ（Ｎ一十二烷基肌氨酸钠）可以破坏蛋白内的疏水 键，可以增溶几乎所有的蛋白。极端ＤＨ值也可以破坏蛋白 的次级键从而增溶蛋白。Ｇａｖｉｔ等采用低ＤＨ值（２．６）和高温 基金项目 中国热带农业科学院中央级公益性科研院所基本科研业务 费专项资金资助。 作者简介夏启玉（ｉ９８３一），女，湖北浠水人，硕士研究生，研究方向：植 物基因工程。＊通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ＺｈａｎｇｃＳ＠ｈｏｔｍａｉｌ．Ｃｏｒｎ。 收稿日期２００８．０３—１７ （８５℃）溶解抗真菌重组肽的包涵体［ 。高ｐＨ值（≥１２）结合 低浓度的变性剂（如２０％～４０％异丙基或ｎ丽基乙醇溶液） 用于溶解生长激素包涵体非常有效［２１。由于蛋白间二硫键的 存在，在增溶时一般要使用还原剂。还原剂的使用浓度一般 为５０～１００ｍｍ０１／Ｌ ２－Ｂ ＭＥ或ＤＴＴｏ ３包涵体的复性 由于包涵体无生物学活性，因此需要进行复性。复性主 要是通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状 态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常 形成。还原剂一般和变性剂的去除一起慢慢地氧化去除，使 二硫键慢慢形成。常用的氧化方法有空气氧化法、谷胱甘肽 氧化法和混合二硫化物氧化法。 ３．１传统的复性方法传统的复性方法有稀释、透析和超 滤复性［ 。稀释是最简单、也较有效的复性方法，直接加入水 或缓冲液，放置过夜即可，缺点是体积增加较大，变性剂稀 释速度太快，不易控制。透析复性的好处是不增加体积，通 过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，但耗时长， 容易形成没有活性的蛋白质聚集体，且不适合大规模操作， 无法应用到生产规模。Ｈｗａｎｇ结合稀释法和透析法，得到了 具有生物活性的人组织蛋白酶原ＫＩ 。超滤复性是选择合 适截留分子量的膜，允许变性剂通过膜而不允许蛋白质通 过，伴随着变性剂的去除，以相同的速度加入复性液，蛋白 浓度保持不变，生产中使用较多，规模较大，易于对透析速 度进行控制。其缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋 白可能在超滤过程中不可逆地变性。Ｗｅｓｔ等结合超滤和透 析方法，使５ ｇ／Ｌ的牛碳酸酐酶复性率达到４２％四。 ３．２柱上层析复性近年来，层析复性是研究较多并成功 应用于生产中的一种色谱复性技术。胃蛋白酶难于在体外 复性，甚至被认为不可能在体外复性。但是Ｋｕｒｉｍｏｔｏ等发 现，吸附在琼脂糖上的胃蛋白酶可以在ｐＨ值为３～５的条 件下复性，最后他们在为ＤＨ值为５的条件下获得了６０％的 复性效率嘲。常用的色谱方法如下所述。 ３．２．１凝胶过滤层析复性。凝胶过滤层析复性又称体积排 阻复性（ＳＥｃ），是一种广泛应用的层析技术。ＳＥＣ介质的多 孔结构可以使蛋白质分子彼此分离，从而有助于蛋白质的 折叠。与常用的稀释复性法相比，
1 重组蛋白包含体的复性
[摘要]：重组蛋白在大肠杆菌中的高表达往往导致形成包含体。不可溶、无生物活性的包含体必须经过体外变复性才可得到生物活性蛋白。变复性实验是建立在蛋白质体外折叠机制的基础上的。近年来，随着对蛋白质折叠机制的认识，发展了不少促进蛋白折叠和二硫键氧化来提高活性蛋白产率的复性办法。
[关键词]：蛋白折叠、包含体、复性、二硫键形成
Abstract：Expression of recombinant proteins in Escherichia coli often results in
the formation of insoluble inclusion bodies. Active protein can be recovered by
solubilization of inclusion bodies followed by renaturation of the solubilized
protein. The process of renaturation is established in the understanding to the
mechanism of protein folding in vitro. In recent years, With the understanding of
mechanisms of protein folding, many renaturation methods were developed, which can
increase the yield of active proteins.
Key word: protein folding、inclusion body 、renaturation 、the forming of disulfide
bond
大肠杆菌表达系统以其操作简便，遗传背景清楚，大规模发酵成本低成为目前最常用的外源蛋白表达系统。它为许多具有药用和工业应用价值的真核生物蛋白质的获得提供了方便。但是，重组蛋白的高表达往往导致形成不溶的、没有生物活性的包含体（如人生长激素、人胰岛素和尿激酶）。
包涵体表达的蛋白的复性
包涵体： 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
包涵体的组成与特性：
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
包涵体的形成：
主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。
包涵体表达的有利因素：
1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。
2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。
3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。
4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。
破菌：
1、机械破碎
2、超声破碎
3、化学方法破碎
分离：
1、离心：5000-20000g15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。 2、过滤或萃取方法：
洗涤：
由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM TrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。
