共沉默Birc5和Hspa5的双干扰siRNA质粒载体构建及鉴定

烟草花叶病毒siRNA设计及其植物表达载体构建(英文)马欣荣;谈心;刘华玲;张义正【期刊名称】《应用与环境生物学报》【年(卷),期】2006(12)2【摘要】RNA干扰技术已广泛应用于沉默基因表达的研究.本文分析烟草花叶病毒(TMV)基因序列,选择设计编码小分子发卡结构RNA(hpRNA)的cDNA;并根据农杆菌双元载体质粒p2355多克隆位点区限制性酶切位点,两端分别加入XbaI和BamHI酶切位点;分别合成单链DNA复性后插入到p2355上,经PCR、测序验证,表明已成功构建了具有潜在表达烟草花叶病毒siRNA的植物表达载体.【总页数】4页(P151-154)【关键词】RNA干扰(RNAi);发卡RNA(hpRNA);小分子干扰RNA(siRNA);烟草花叶病毒(TMV);植物表达载体【作者】马欣荣;谈心;刘华玲;张义正【作者单位】四川大学生命科学学院;中国科学院成都生物研究所【正文语种】中文【中图分类】Q78;S435.72【相关文献】1.Cdc2/cdk1和survivin特异性siRNA真核表达载体的设计、构建和鉴定 [J], 朱俊;袁玉林;彭涛;陈树;黄铄;李双2.EGF和IGF-1受体特异性siRNA真核表达载体的设计、构建及鉴定 [J], 李卓先;周绪红;王蕾;方文敏;刘业军;张岑;袁玉林3.Bcl-xl和IGF-1受体特异性siRNA真核表达载体的设计、构建及鉴定 [J], 游兴松;王蕾;李卓先;方文敏;袁玉林4.用siRNA表达框架抑制CYP450 2E1基因转录筛选高效的RNA干扰位点及构建该位点的siRNA表达载体 [J], 徐芸;李继昌;万志红5.干扰烟草GA 20-氧化酶siRNA植物表达载体的构建及矮化烟草的产生 [J], 谈心;杨宏;乔定君;马欣荣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

论 著（基础研究）重组铜绿假单胞菌外毒素Ａ和ｐｃｒＶ基因质粒的构建及真核表达姜明子，冯旰珠 ［摘要］　目的　外毒素Ａ（ｔｏｘＡ基因编码）是铜绿假单胞菌毒力最强的因子之一，ＰｃｒＶ（ｐｃｒＶ基因编码）是铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统的关键调控因子之一。

文中旨在构建重组ｔｏｘＡ和ｐｃｒＶ基因的铜绿假单胞菌核酸疫苗，并在ＨＥＫ－２９３细胞中表达目的蛋白。

　方法　ＰＣＲ法从铜绿假单胞菌基因组基因中扩增出ｔｏｘＡ和ｐｃｒＶ基因，点突变法对ｔｏｘＡ基因进行减毒优化，随后将突变的ｔｏｘＡｍ基因和ｐｃｒＶ基因分别插入ｐＩＲＥＳ真核表达质粒的２个多克隆位点，构建真核双表达重组质粒ｐＩＲＥＳ－ｔｏｘＡｍ－ｐｃｒＶ。

脂质体法将ｐＩＲＥＳ－ｔｏｘＡｍ－ｐｃｒＶ瞬时转染入ＨＥＫ－２９３细胞，通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ｔｏｘＡｍ及ｐｃｒＶ在真核细胞中的表达。

　结果　构建的真核表达质粒ｐＩＲＥＳ－ｔｏｘＡｍ－ｐｃｒＶ，经脂质体转染ＨＥＫ－２９３细胞后，在其细胞内检测到目的蛋白的表达。

　结论　成功构建ｐＩＲＥＳ－ｔｏｘＡｍ－ｐｃｒＶ表达载体并在转染的真核细胞中得以有效的表达，为研究铜绿假单胞菌预防性疫苗奠定了实验基础。

［关键词］　铜绿假单胞菌；外毒素Ａ；核酸疫苗；ｐｃｒＶ基因 ［中图分类号］　Ｒ５６３ ［文献标志码］　Ａ ［文章编号］　１００８－８１９９（２０１４）０７－０６９４－０４基金项目：江苏省卫生厅面上项目（Ｈ２００９１１）作者单位：２１００１１南京，南京医科大学第二附属医院呼吸内科［姜明子（医学硕士研究生）、冯旰珠］通讯作者：冯旰珠，Ｅ－ｍａｉｌ：ｆｅｎｇｇｚ＠ｎｊｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｅｎｃｏｄｉｎｇＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｔｏｘＡａｎｄｔｙｐｅⅢｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｐｃｒＶＪＩＡＮＧＭｉｎｇ－ｚｉ，ＦＥＮＧＧａｎ－ｚｈｕ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ，ｔｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００１１，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＥｘｏｔｏｘｉｎＡ（ｅｎｃｏｄｅｄｂｙｇｅｎｅｔｏｘＡ），ｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｔｏｘｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓｅｃｒｅｔｅｄｂｙｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉ－ｎｏｓａ（Ｐ．ａ．），ａｎｄＰｃｒＶ（ｅｎｃｏｄｅｄｂｙｇｅｎｅｐｃｒＶ），ｋｅｙｃｏｍｐｏｎｅｎｔｔｏｔｙｐｅⅢｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆＰ．ａ．，ｂｏｔｈｍａｔｔｅｒｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｔｏｔｈｅｖｉｒｕｌｅｎｃｅｏｆＰ．ａ．ＴｈｅａｒｔｉｃｌｅｗａｓｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｎｏｖｅｌＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇａｍｕｔａｔｅｄｔｏｘＡｇｅｎｅａｎｄｔｈｅｐｃｒＶｇｅｎｅｏｆＰ．ａ．ａｎｄｉ－ｄｅｎｔｉｆｙｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｌｓ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＴｈｅｇｅｎｅｓｏｆｔｏｘＡａｎｄｐｃｒＶｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲ，ａｎｄｔｈｅｔｏｘＡｇｅｎｅｗａｓｍｕｔａｔｅｄｔｏｒｅｄｕｃｅｔｈｅｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆＥｘｏｔｏｘｉｎＡ．ＴｈｅｎｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｓｔｏｘＡｍａｎｄｐｃｒＶｗｅｒｅｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｐＩＲＥＳｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｐＩＲＥＳ－ｔｏｘＡｍ－ｐｃｒＶ．ＴｈｅｎｏｖｅｌｐｌａｓｍｉｄｗａｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏＨＥＫ－２９３ｃｅｌｌｓｂｙｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｔｏｘＡｍａｎｄｐｃｒＶｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｄｅｍｏｎ－ｓｔｒａｔｅｄｔｈｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｓｅｎｃｏｄｉｎｇＥｘｏｔｏｘｉｎＡａｎｄＰｃｒＶ．ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｅｘｈｉｂｉｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｅｎｃｏｄｅｄｔｏｘＡａｎｄｐｃｒＶｅｘｐｒｅｓｓｅｄｂｙＨＥＫ２９３ｃｅｌｌｓ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＩＲＥＳ－ｔｏｘＡｍ－ｐｃｒＶｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉ－ｃａｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｔｏｘＡｍａｎｄｐｃｒＶｉｎＨＥＫ－２９３ｃｅｌｌｓ．ＩｔｍａｙｂｅｕｓｅｄａｓａｐｏｔｅｎｔｉａｌｃａｎｄｉｄａｔｅｏｆｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅｖａｃｃｉｎｅｏｆＰｓｅｕｄｏ－ｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ． ［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；ＥｘｏｔｏｘｉｎＡ；ＤＮＡｖａｃｃｉｎｅ；ＰｃｒＶ０　引 言 铜绿假单胞菌（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，ＰＡ）是常见的条件致病菌，在各种医院感染中居于前位，也是慢性阻塞性肺疾病及气管扩张症反复感染者的常见的致病菌。

上海交通大学硕士学位论文沉默禽流感病毒NS1基因的pRNA-siRNA纳米嵌合体的构建姓名：***申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：孙建和;严亚贤20080101沉默禽流感病毒NS1基因的pRNA-siRNA纳米嵌合体的构建摘要世界许多国家和地区都有高致病性禽流感爆发，其不仅造成了养禽业的巨大经济损失，更因为存在禽流感病毒与人流感病毒重组的危险以及出现人际传播禽流感的可能性，因而如何有效防控禽流感倍受关注。

禽流感病毒的非结构蛋白（non-structural protein，NS）——NS1蛋白, 能抑制机体产生干扰素-α/β，利于禽流感病毒的进一步增殖，因此NS1基因是防控禽流感的重要靶基因之一。

siRNA（small interfering RNA, siRNA）是能特异性沉默靶基因表达的双链RNA，但要实现siRNA在感染细胞中发挥作用，必须解决一系列技术难题，如siRNA必须能顺利到达细胞内且不会降解。

应用噬菌体pRNA（packaging RNA）为导入载体，构建pRNA-siRNA纳米嵌合体为解决上述难题提供了可能。

本研究拟筛选能沉默禽流感病毒NS1基因的siRNA，构建pRNA-siRNA，为深入研究NS1蛋白的功能、研发有效防控禽流感的全新核酸药物提供技术储备。

为了构建pRNA-siRNA纳米嵌合体，根据siRNA设计原则，筛选出NS1基因编码区的siRNA作用靶序列；根据噬菌体pRNA序列，合成120个碱基的寡核苷酸作为模板；设计携带T7启动子和针对NS1基因的siRNA 靶序列的引物，应用PCR技术，扩增出DNA，DNA产物命名为dpRNA-siRNA(t)；应用T7 RNA聚合酶进行体外转录，获得携带针对NS1靶基因的pRNA-siRNA，命名为pRNA-siRNA(t)。

构建pRNA-siRNA（c），其靶序列与鼠、人、犬、禽及禽流感病毒基因组序列无同源性，作为评III估pRNA-siRNA沉默NS1基因效果的阴性对照。

S100A6 siRNA的构建及鉴定冯珊珊;杨博;刘爱琴;武婧;翟惠虹【期刊名称】《西安交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2016(37)5【摘要】目的利用小片段干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制S100A6蛋白的表达,为研究CacyBP/SIP核转位机制提供有利的工具.方法设计S100A6的siRNA序列,用脂质体LipofectamineTM 2000将siRNA转染至人结肠癌SW480细胞中,在荧光显微镜下观察转染效率,用Real-time PCR及Western blot方法检测S100A6在人结肠癌SW480细胞内的mRNA和蛋白表达.结果构建了3对S100A6-siRNA,荧光显微镜下检测转染人结肠癌SW480细胞成功;RT-PCR证明了在SW480细胞内S100A6的mRNA表达显著降低(P＜0.05);Western blot证明了SW480细胞内S100A6蛋白表达显著降低(P＜0.05);与S100A6 si-1、S100A6 si-3组相比,S100A6si-2组对S100A6的mRNA和蛋白抑制效果最明显(P＜0.05).结论成功构建了S100A6-siRNA,为CacyBP/SIP核转位机制研究提供了有利的工具.【总页数】5页(P754-757,761)【作者】冯珊珊;杨博;刘爱琴;武婧;翟惠虹【作者单位】宁夏医科大学总医院外科学研究室,宁夏银川750004;宁夏医科大学总医院消化内科,宁夏银川750004;宁夏医科大学总医院消化内科,宁夏银川750004;宁夏医科大学总医院消化内科,宁夏银川750004;宁夏医科大学总医院消化内科,宁夏银川750004【正文语种】中文【中图分类】R57【相关文献】1.人核糖核酸酶抑制因子siRNA慢病毒载体的构建及鉴定 [J], 丁宁;邱景剑;王定友;李劭恒;张云;李坤2.肺腺癌细胞 S100A6基因 siRNA 慢病毒载体构建及鉴定 [J], 李小龙;姜华;金发光;南岩东3.共沉默Birc5和Hspa5的双干扰siRNA质粒载体构建及鉴定 [J], 王强;潘丽红;吕丹;朱慧芬4.S100A6基因过表达慢病毒载体的构建、转染及鉴定 [J], 李洁;胡进;马力天;叶欣;南岩东;吴大方5.恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒载体的构建与鉴定 [J], 赵方;陈鹏;焦剑;胡明道;黄明;刘锋;许晔凯因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

非病毒siRNA分子纳米传递载体的研究进展RNA干扰是存在于哺乳动物与植物细胞中的基因沉默的自然机制，是指通过内源性或外源性的双链RNA于细胞内诱导靶基因mRNA产生降解，导致基因沉默。

小干扰RNA（siRNA）可与体内诱导产生RNA干扰的效应，但由于siRNA 易被降解，转染效率低，半衰期短，故需借助载体方可将siRNA递送入细胞。

由于病毒载体具有致突变、免疫原性等副作用，故非病毒siRNA分子纳米传递载体为研究热点。

本文对非病毒siRNA分子纳米传递载体的研究进展进行综述。

标签：非病毒；siRNA；纳米传递载体；研究进展随着基因技术的迅速发展，近年来不断涌现新的基因药物，其中siRNA由于其易包封、体积小、高效安全已成为较具前景的基因药物之一。

限制siRNA 的临床运用的主要问题包括：（1）siRNA的内吞效应与细胞摄取效应较低，易于失活；（2）siRNA需穿越的屏障较多方可到达靶细胞；（3）siRNA的非特异性分布可减少于靶组织的浓度，降低转染效率。

非病毒纳米传递载体具有易合成、免疫原性低、安全性较高、不受基因大小的限制等优势明显优于病毒载体给药技术。

现将非病毒siRNA分子纳米传递载体的研究进展进行综述。

1. siRNA的作用机制siRNA是RNA干扰的效应分子。

内源性或外源性的双链RNA于细胞质中被Dicer酶切成具有21-25个核苷酸的短链RNA，即为siRNA。

siRNA与细胞质中的蛋白质构成核酸蛋白复合物，siRNA解旋后以核酸蛋白复合物的siRNA序列为向导，寻找且结合具有特点序列的mRNA，对mRNA在酶的作用下进行剪切。

在酶的作用下进行剪切的mRNA被核酸酶进行讲解，使得蛋白无法正常表达，实现基因沉默。

siRNA较为稳定，可在细胞中稳定存在3天。

2. 非病毒siRNA分子纳米传递载体需具备的性质2.1 靶向性如靶细胞位于肝、脾等组织中，巨噬细胞可诱导纳米传递载体在肝、脾等组织聚集，传递载体无需靶向配体；若靶细胞位于肝、脾等之外的肿瘤细胞，可通过肿瘤组织的节流与高渗透效应实现被动靶向，传递载体也无需靶向配体；如八点不是以上两种情况，则传递载体上需修饰上特点的配体实现主动靶向。

RNA干扰技术在基因沉默中的应用基因沉默是一种重要的分子生物学现象，它可以通过RNA干扰技术得到广泛应用。

本文将介绍RNA干扰技术的原理、应用和最新研究成果。

一、RNA干扰技术的原理RNA干扰技术是一种通过特异的基因沉默来抑制目标基因表达的技术。

它基于RNA分子的特殊性质，通过两种主要的机制实现基因沉默：siRNA和miRNA。

1. siRNA机制siRNA（small interfering RNA）是双链RNA分子，它由外源性引物或内源性lncRNA（long non-coding RNA）产生。

siRNA通过一系列的酶切和融合反应，在细胞质中形成活性siRNA复合物。

然后，活性siRNA复合物将与靶标mRNA特异性结合并介导其降解，从而导致基因沉默。

2. miRNA机制miRNA（microRNA）是一种内源性短RNA，由基因转录产生。

与siRNA类似，miRNA也通过与靶标mRNA结合并介导其降解或抑制转录的方式来实现基因沉默。

不同的是，miRNA通常与靶标mRNA的3'非翻译区域结合，形成RNA诱导沉默复合物（RISC），从而抑制靶标mRNA的翻译或稳定性。

二、RNA干扰技术的应用RNA干扰技术已经被广泛应用于基因功能研究、疾病治疗和转基因生物的改良。

下面将分别介绍它们的具体应用。

1. 基因功能研究RNA干扰技术在基因功能研究中发挥着重要作用。

通过特异性抑制目标基因的表达，可以揭示基因在生物体内的功能和调控机制。

例如，科学家可以设计和合成特定靶标基因的siRNA，然后转染到细胞中，验证目标基因的功能。

此外，通过高通量筛选技术结合RNA干扰，可以快速鉴定和验证大量的候选靶基因。

2. 疾病治疗RNA干扰技术还被应用于疾病治疗。

因为很多疾病与基因表达异常相关，通过RNA干扰技术抑制病因基因的表达，可以改善相关疾病的症状。

例如，利用siRNA靶向抑制肿瘤相关基因的表达，可以抑制肿瘤细胞的增殖和转移。

2005；32(4) 生物化学与生物物理进展Pmg．B i∞hem．B i叩hy s．·377·两种高效RNA干涉载体系统的构建及应用串杨明付汉江铁轶朱捷江红郑晓飞”(军事医学科学院放射医学研究所，北京100850)摘要在真核细胞基因功能研究中，RNA干涉(IiNA i)已成为一种强有力的选择性沉默基因表达的实验工具．建立一套可在哺乳动物培养细胞中高效、经济地表达s iRN A的载体系统是RN A干涉研究的必要前提之一．从H印G2 细胞基因组DNA中克隆得到H1全长启动子(374 bp)，以之为基础构建了两套RNA干涉载体系统，p sL和带有绿色荧光蛋白(EG FP)标签的pEsL，并对p53基因进行了相应的RNA干涉研究．干涉质粒瞬时转染H印G2细胞后，分别利用半定量I盯．PCR和蛋白质印迹检测p53表达水平．与商品化载体pS如，lce，蹦3．1-Hlh)嘿即相比，psL 和pES L对p53基因表达具有更高的干涉效率．结果显示：干涉载体ps L和p Es L能高效特异地下调目的基因表达，可作为哺乳动物中基因功能分析的有效工具．关键词m叮A干涉，H1启动子，p53基因学科分类号Q782基因组计划的完成使人类深入理解自身生理和述限制．因此，相比之下，H1启动子更适于RN A 病理分子基础的梦想成为可能．但是直到目前，仍干涉载体的构建．本实验正是基于以上考虑，利用有至少15 000个到35 000个已知人类基因的功能全长374 bp的H1启动子序列构建了两种IⅢA干还不清楚[1】．为了加强人类对自身生物学过程的了涉载体pSL和带有绿色荧光蛋白(EGFP)标签的解，以及为制药工业提供更多新的药物靶点，对这pESL．以对呛干涉p53基因为例，并以只包含H1 些未知功能基因进行功能研究已显得越来越重要．启动子末端100 bp序列的商品化载体pS泷聊e，M RNA干涉方法的应用已经极大地影响了基因功能3．1．H1 hy掣。

口蹄疫病毒L、2B基因siRNA重组腺病毒质粒的构建贾俊涛;郭凤英;乌伦吉如嘎;张小宇;陈金顶【摘要】根据siRNA设计原则,分别选择O型FMDV的L和2B基因上保守序列作为可能的干扰位点,设计了2个siRNAs,并将siRNAs克隆到pSIREN-Shuttle中,获得2个siRNA重组表达载体pShuttle-L和pShuttle-2B.用限制性内切酶I-Ceu I和PI-Sce I双酶切siRNA重组表达载体和腺病毒质粒载体pAdeno-X,利用体外连接法获得了重组质粒.经PCR扩增、酶切鉴定及序列测定,成功构建了重组腺病毒质粒pAdeno-L和pAdeno-2B.%In this study, the conservative sequence in L and 2B gene of O type FMDV were chose as possible interference sites. Two siRNAs were designed and synthesized. These siRNAs were cloned into the plasmid pSIREN-Shuttle, then the siR-NAs recombined expression vectors were obtained including pShuttle-L and pShuttle-2B. The vectors and the adenovirus vec-tor pAdeno-X were digested with restriction endonuclease I-Ceu I and PI-Sce I and connected in vitro, then recombinant plasmids were obtained. The result of PCR, enzyme-cutting and sequencing suggested that the recombined adenovirus plas-mids pAdeno-L and pAdeno-2B were constructed successfully.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2017(056)016【总页数】3页(P3152-3154)【关键词】口蹄疫病毒;RNA干扰;重组腺病毒质粒【作者】贾俊涛;郭凤英;乌伦吉如嘎;张小宇;陈金顶【作者单位】内蒙古农业大学职业技术学院,内蒙古包头 014109;内蒙古农业大学职业技术学院,内蒙古包头 014109;内蒙古农业大学职业技术学院,内蒙古包头014109;内蒙古农业大学职业技术学院,内蒙古包头 014109;华南农业大学,广州510642【正文语种】中文【中图分类】S852.65+9.6口蹄疫（Foot－and－mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄类动物的一种急性、热性、高度接触性传染病［1］。

中文题目核盘菌SsMCM1转录因子互作蛋白RNA干扰载体的构建与鉴定英文题目Construction and identification of RNA interference vector of SsMCM1 transcription factor interacting protein in Sclerotinia sclerotiorum目录摘要 (1)Abstract (2)第一章前言 (3)1.1 核盘菌的生物学特性 (3)1.2 核盘菌病害的防治 (3)1.3 RNA干扰技术的历史背景 (4)1.4 RNAi的作用机制 (5)1.5 RNA干扰的诱导方法及载体构建 (6)1.6 RNAi在真菌基因功能研究中的优点和不足 (7)1.7 RNAi 技术在真菌中的应用前景展望 (8)第二章实验材料 (9)2.1 主要材料 (9)2.2 主要试剂 (9)2.3 主要仪器 (9)2.4 主要培养基 (9)第三章实验方法 (10)3.1 目的基因片段的选择和获取 (10)3.2 Ssste12基因RNA干扰载体的构建 (10)3.2.1 pSD-Ssste12干扰载体的构建 (11)3.2.2 pS1-Ssste12干扰载体的构建 (12)第四章Ssste12基因的RNA干扰载体的验证 (13)4.1 pSD-Ssste12干扰载体的验证 (13)4.2 pS1-Ssste12干扰载体的验证 (13)第五章结果 (15)5.1 pSD-Ssste12干扰载体的构建 (15)5.2 pS1-Ssste12干扰载体的构建 (16)结论 (17)致谢 (18)参考文献 (19)摘要核盘菌是一种对作物和蔬菜造成危害的世界性病原真菌,它的宿主范围遍布极其得广泛，能造成包含于至少75个科、278个属内的超过400种植物发生病理反应。

RNA干扰(RNAi)作用是生物体内的一种通过双链RNA在mRNA水平上关闭特异性序列的基因表达或者使其沉默的过程，即RNA序列特异性转录后基因沉默。

针对丝聚合蛋白基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建及筛选党宁宁;逄曙光;宋海燕;张敏;王彦;边胜男【期刊名称】《中国现代医学杂志》【年(卷),期】2014(24)8【摘要】目的构建丝聚合蛋白(FLG)基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体.方法设计针对人FLG基因的mRNA干扰靶序列,合成相应双链DNA,通过BamH I和EcoRI酶切后的PGLV/H1/GFP载体连接产生shRNA载体,并与pHelper 1.0、pHelper 2.0两种载体共转染293T细胞培养,获得重组慢病毒载体后,转染目的细胞,实现针对FLG基因的RNA干扰.结果经鉴定该实验的慢病毒载体,对人正常皮肤细胞HACAT干扰效果达75％～95％,以RNAi3的沉默效应最佳.结论重组的慢病毒载体为有关FLG基因的进一步研究奠定良好实验基础,并能广泛用于体内基因治疗及基因功能研究.【总页数】4页(P8-11)【作者】党宁宁;逄曙光;宋海燕;张敏;王彦;边胜男【作者单位】山东大学附属济南市中心医院皮肤科,山东济南 250013;山东大学附属济南市中心医院皮肤科,山东济南 250013;山东大学附属济南市中心医院皮肤科,山东济南 250013;山东大学附属济南市中心医院皮肤科,山东济南 250013;山东大学附属济南市中心医院皮肤科,山东济南 250013;山东大学附属济南市中心医院皮肤科,山东济南 250013【正文语种】中文【中图分类】Q782【相关文献】1.西农萨能羊BTN基因RNA干扰序列的筛选及重组腺病毒载体的构建与鉴定 [J], 赵旺生;罗军;王伟;滕炎玲;王桢;林先滋2.siRNA干扰人BMP9重组腺病毒载体的构建及其促进乳腺癌SK-BR-3细胞增殖[J], 刘月红;王科;孙笑笑;万绍恒;王维;陈莹莹;张彦3.大鼠CREB结合蛋白RNA干扰重组慢病毒载体的构建与鉴定 [J], 杨简;江洪;陈思思;陈静;徐盛开;王继春4.HPV16-E7H2P融合钙网蛋白基因重组腺病毒载体疫苗的构建与免疫学鉴定 [J], 刘瑞林;马永臻;张永东;马春玲5.含心脏阿霉素反应蛋白基因的重组慢病毒过表达和RNA干扰载体的构建及鉴定[J], 梁春梅;许旭三;余华军;周霞;温霞;李友;KOJIC Snezana;汪亚君;马国达因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

靶向BIRC5,Bcl-2siRNA慢病毒表达载体最佳干扰序列的筛选饶国洲;李昂;苟建重;朱永进;孙慧玲;张引成【期刊名称】《现代检验医学杂志》【年(卷),期】2011(026)006【摘要】目的针对设计合成构建的BIRC5和Bcl-2小分子干扰RNA(siRNA)的慢病毒质粒表达载体进行有效靶序列筛选,探讨其对靶基因的封闭和抑制作用.方法将BIRC5和Bcl-2 siRNA慢病毒质粒表达载体通过脂质体介导,分别转染体外培养的Tca-8113细胞.采用半定量RT-PCR检测转染细胞BIRC5和Bcl-2 mRNA表达及Western blot检测蛋白表达水平.结果 BIRC5和Bcl-2 mRNA抑制率分别为35%～76%和30%～72%,所设计的siRNA序列不同程度降低和下调其mRNA及相应的蛋白表达,实验组与对照组比较差异有统计学显著性意义(P<0.05),阴性对照组无此作用(P>0.05).结论设计合成的siRNA干扰序列能抑制其靶基因mRNA和蛋白的表达,不同的干扰靶点其抑制效果不同,本实验成功筛选出两对最佳干扰序列作为对肿瘤细胞基因治疗的实验研究.【总页数】4页(P33-36)【作者】饶国洲;李昂;苟建重;朱永进;孙慧玲;张引成【作者单位】西安交通大学医学院口腔医院中心实验室,西安,710004;西安交通大学医学院口腔医院中心实验室,西安,710004;西安交通大学医学院口腔医院牙周科,西安,710004;西安交通大学医学院口腔医院中心实验室,西安,710004;西安交通大学医学院口腔医院中心实验室,西安,710004;西安交通大学医学院口腔医院颌面外科,西安,710004【正文语种】中文【中图分类】R373;Q786【相关文献】1.鸡miR-133a靶向调控BIRC5基因的表达 [J], 王星果;邵芳;龚道清;卢祥云;顾志良2.TNFAIP8干扰质粒的构建及最佳干扰效率质粒的筛选 [J], 刘文明;杨晶晶;胡如意;邱兴烽;石春燕;齐忠权;刘忠臣;庄国洪3.促红细胞生成素受体干扰RNA慢病毒表达载体的构建及干扰细胞的筛选 [J], 呼格吉乐4.靶向人多药耐药基因 mrp1特异性小分子干扰 RNA 有效序列筛选 [J], 王新平;严律南;韩雷;李德华;赵兰英;苟兴华;潘光栋;夏冬;刘江文;严茂林5.ALR siRNA慢病毒载体最佳干扰序列的筛选及构建 [J], 郭虹利;吴传新;郭晖;刘杞;杨超;孙航因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

Spl基因RNA干扰载体的构建及鉴定Spl基因RNA干扰载体的构建及鉴定目的:构建干扰载体pSilencer 3.1-spl,并初步研究其对Spl基因的干扰作用.方法:根据Spl cDNA编码序列,设计并合成针对Spl基因的特异性RNA干扰片段,并将其克隆入pSilencer 3.1-Hl neo干扰载体中,构建Spl基因小干扰RNA(siRNA)真核表达载体pSilencer 3.1-Spl;分别将阴性对照载体pSilencer 3.1与重组载体pSilencer 3.1-Spl经脂质体LipofectAMINE2000介导转染HeLa细胞,采用RT-PCR、Western blot方法分别检测Spl基因的转录与表达水平.结果:构建了Spl基因siRNA真核表达载体pSilencer 3.1-Spl,经酶切、测序鉴定证实克隆正确,并在mRNA水平和蛋白水平证实了载体的干扰效果.结论:特异性siRNA能明显抑制Spl基因在HeLa细胞中的表达,为进一步研究Spl的生物学功能和作用机制奠定了实验基础.作者：曲璇陈苏宁吴琳申亮亮林伟赵华栋刘新平张健 QU Xuan CHEN Su-Ning WU LinSHEN Liang-Liang LIN Wei ZHAO Hua-Dong LIU Xin-Ping ZHANG Jian 作者单位：曲璇,吴琳,申亮亮,林伟,赵华栋,刘新平,张健,QU Xuan,WU LinSHEN,Liang-Liang,LIN Wei,ZHAO Hua-Dong,LIU Xin-Ping,ZHANG Jian(第四军医大学,基础部生物化学与分子生物学教研室,国家肿瘤生物学重点实验室,陕西,西安,710032)陈苏宁,CHEN Su-Ning(第四军医大学,基础部生物化学与分子生物学教研室,国家肿瘤生物学重点实验室,西京医院药剂科,陕西,西安,710032)刊名：生物技术通讯ISTIC 英文刊名：LETTERS IN BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)： 2008 19(4) 分类号： Q78 关键词：RNA干扰 Spl基因小干扰RNA。

siRNA干扰人核糖核酸酶抑制因子在HeLa细胞中的表达鉴定李坤;丁宁;李琳【期刊名称】《中国医药导报》【年(卷),期】2014(000)025【摘要】目的：鉴定已构建的干扰人核糖核酸酶抑制因子(hRI)的siRNA表达载体pKD-dsRI的干扰效果。

方法用脂质体法将所构建的pKD-dsRI与充当报告基因的重组绿色荧光蛋白融合hRI的逆转录病毒载体(pLNCX-EGFP-C1-hri)共转染到人宫颈癌HeLa细胞中。

实验设4组院空白细胞组(未转染组)、pLNCX-EGFP-C1-hri转染组(对照组1)、pKD+pLNCX-EGFP-C1-hri共转染组(对照组2)及pKD-dsRI+pLNCX-EGFP-C1-hri共转染组(干扰组)。

采用RT-PCR和Western blotting检测egfp-hri基因在转录后基因水平和蛋白质水平的表达。

结果干扰组egfp-hri基因的mRNA转录水平和蛋白表达水平较对照组1与对照组2分别下降了91%、85%和83%、81%(P<0.05)。

结论已成功构建了针对hRI的siRNA表达载体。

%Objective To identify the silencing effect on human HeLa cells of a siRNA plasmid pKD-dsRI targeting the gene of human ribonuclease inhibitor (hRI), which is capable of expression in mammalian cells. Methods The vector of pKD-dsRI was co-transfected into HeLa cells with the reporter plasmid of pLNCX-EGFP-C1-hri (transfection group), using the cells transfected with the reporter plasmid of pLNCX-EGFP-C1-hri (control group 1), empty plasmid of pKD together with pLNCX-EGFP-C1-hri (control group 2), and those untransfected (no transfection group) ascontrols. The silencing effect was determined by RT-PCR, and the expression level of egfp-hri protein was determined by Western blotting respectively. Results The transcription level of the egfp-hri fusion gene in cells co-transfected with pKD-dsRI and reporter plasmid decreased by91%and 85%, while the expression level of the egfp-hri fusion gene decreased by 83% and 81%, as compared with control group 1 and control group 2 respectively (each P<0.05). Conclusion The plasmid of siRNA targeting hRI is successfully constructed and the protein of hRI can be inhibited in cytomatrix of HeLa cells correctly.【总页数】4页(P8-10,25)【作者】李坤;丁宁;李琳【作者单位】大连大学医学院检验系，辽宁大连116021;大连大学医学院检验系，辽宁大连 116021;大连市妇幼保健院检验科，辽宁大连 116021【正文语种】中文【中图分类】R78【相关文献】1.人核糖核酸酶抑制因子siRNA慢病毒载体的构建及鉴定 [J], 丁宁;邱景剑;王定友;李劭恒;张云;李坤2.荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子基因在人肝癌细胞中的表达 [J], 李琳;李坤;王福强;丁宁;常明3.绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子表达载体pEGFP-C1-hri的构建及鉴定[J], 李坤;田余祥;于丽华;樊建慧;杨帆;崔秀云4.重组人核糖核酸酶抑制因子基因的siRNA表达载体构建及B16细胞中基因沉默的鉴定 [J], 李坤;田余祥;陈海波;杨帆;樊建慧;赵宝昌;崔秀云5.高表达人核糖核酸酶抑制因子的乳腺癌细胞株的建立及其鉴定 [J], 樊建慧;刘鹏;崔秀云;田余祥因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

沉默HepG2细胞核糖核酸酶抑制因子的shRNA逆转录病毒载体的构建及鉴定李琳;李坤;王福强;丁宁【期刊名称】《中国医药导报》【年(卷),期】2014(11)14【摘要】目的构建针对人核糖核酸酶抑制因子(hRI)的shRNA逆转录病毒载体,为探讨hRI抗肿瘤作用机制打下基础.方法用亚克隆法将目的片段pkd-dsRI和pkd 从表达载体pKD-dsRI克隆到pLNCX上,用双酶切筛选得到阳性克隆后,用脂质体法将其转染到人肝癌细胞HepG2细胞中,用800 mg/L G418筛选2周,产生稳定的细胞克隆后,用RT-PCR检测细胞中核糖核酸酶抑制因子mRNA表达的变化.结果双酶切鉴定为阳性克隆.RT-PCR表明,对比空白组(0.790±0.014)和空载体组(0.904±0.027),干扰组hri基因表达(0.361 ±0.048)明显下调,差异有统计学意义(P ＜0.05).结论成功构建了针对hRI的shRNA逆转录病毒载体.【总页数】4页(P14-16,27)【作者】李琳;李坤;王福强;丁宁【作者单位】大连市妇幼保健院检验科,辽宁大连116021;大连大学医学院,辽宁大连116021;大连海洋大学,辽宁大连116021;大连大学医学院,辽宁大连116021【正文语种】中文【中图分类】R394.33【相关文献】1.靶向人核糖核酸酶抑制因子双抗性的 shRNA 逆转录病毒载体构建及鉴定 [J], 李坤;丁宁2.细胞信号转导抑制因子3特异性shRNA的构建及鉴定 [J], 廖立红;郑锐丹;王成斌;应艳琴;罗小平3.人核糖核酸酶抑制因子的 shRNA逆转录病毒载体的鉴定 [J], 覃尚珠;李坤;丁宁;王福强;李琳4.绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子逆转录病毒载体pLNCX-EGFP-C1-hri 的构建及鉴定 [J], 李坤;李琳;王福强;田余祥;曲淑贤;崔秀云5.重组人核糖核酸酶抑制因子基因的siRNA表达载体构建及B16细胞中基因沉默的鉴定 [J], 李坤;田余祥;陈海波;杨帆;樊建慧;赵宝昌;崔秀云因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

RNA干扰技术在基因沉默中的应用基因沉默是一种生物调控机制，它通过抑制基因表达来对特定基因进行控制。

近年来，RNA干扰技术作为一种强大的工具，被广泛应用于基因沉默研究中。

本文将介绍RNA干扰技术的原理、应用和前景。

一、RNA干扰技术的原理RNA干扰技术是一种通过RNA分子介导的基因沉默机制。

它主要通过两种形式实现：小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA) 和microRNA (miRNA)。

这两种RNA分子都能选择性地与靶标mRNA结合，从而降低或抑制其表达。

1. 小干扰RNA (siRNA)小干扰RNA是由外源的双链RNA分子通过酶切或化学合成得到的。

siRNA能够与特定mRNA序列互补结合，并通过RNA诱导的靶向降解机制将其降解。

这种特异性降解的能力使得siRNA成为一种有效的基因沉默工具。

2. microRNA (miRNA)miRNA是一类内源性的非编码小RNA分子，它们通过与mRNA靶标的3'非翻译区域结合，调控基因表达。

miRNA主要通过两种机制实现基因沉默：一种是通过RNA诱导的靶向降解，另一种是通过抑制翻译过程。

二、RNA干扰技术的应用1. 基因功能研究RNA干扰技术被广泛应用于基因功能研究。

通过设计合适的siRNA或miRNA，研究人员可以选择性地抑制目标基因的表达，进而观察目标基因沉默对生物体的影响。

这为我们揭示基因在细胞或整个生物体中的功能和调控机制提供了有力工具。

2. 潜在药物靶点筛选RNA干扰技术在药物研发中具有重要意义。

通过使用siRNA或miRNA，我们可以模拟潜在药物分子对基因的作用，从而筛选出具有治疗潜力的药物靶点。

这种筛选方法能够高效且准确地寻找到与疾病相关的关键基因，为药物研发提供了新的思路和方向。

3. 基因治疗RNA干扰技术也被广泛用于基因治疗领域。

通过合适的siRNA或miRNA，我们可以直接干扰病理基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。