葡萄糖供应速率对大肠杆菌表达及分泌人表皮生长因子的影响
- 格式：pdf
- 大小：195.62 KB
- 文档页数：5
华东理工大学学报(自然科学版)Journal of East C hina U nivers ity of S cience and Tech nology (Natural Science Edition)Vol.32No.122006-12收稿日期:2005-11-28基金项目:863资助项目(2002AA217021)作者简介:张海毅(1980-),女,山东人,硕士研究生,主要研究方向为基因工程菌发酵。
通讯联系人:叶 勤,E-mail:qye@ecus 文章编号:1006-3080(2006)12-1404-05葡萄糖供应速率对大肠杆菌表达及分泌人表皮生长因子的影响张海毅1, 李志敏1, 钱 悦2, 张 倩2, 甘人宝2, 叶 勤1(1.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;2.中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所,上海200230) 摘要:采用一株大肠杆菌BL 21(DE 3)[pBLM VL 2EGF ]生产人表皮生长因子(hEGF ),其中hEGF 表达由P L 启动子控制并通过p hoA 信号肽分泌到胞外。
实验结果表明:诱导阶段以恒定比供应速率流加葡萄糖时,流加速率对hEGF 的表达和分泌有很大影响。
当葡萄糖比供应速率为0.122g/(g ·h)时,hEGF 表达水平最低,分泌效率最差,只有37.5%;随着葡萄糖比供应速率的增加,胞外和胞内hEGF 比生产速率明显增加,当葡萄糖比供应速率为0.196g/(g ·h)时,单位菌体产生的hEGF 水平最高(121.6mg /g ),其中分泌至胞外的hEGF 占42%。
此外,诱导前补充有机氮源有利于提高诱导初始hEGF 的生产速率。
关键词:人表皮生长因子;P L 启动子;分泌;大肠杆菌中图分类号:T Q92文献标识码:AInfluence of Specific Glucose Provision Rate on the Expression and Secretion of Human Epidermal Growth Factor in Escherichia coliZH A N G H ai -y i 1, L I Zhi -min 1, QI A N Yue 2, ZH A N G Qian 2, GA N R en -bao 2, YE Qin 1(1.S tate K ey L aboratory of Bioreactor E ngineering ,E ast China Univer sity o f Science andT echnology ,Shanghai 200237,China ; 2.I nstitute of B iochemistry and Cell B iology ,Shanghai I nstitute f or B iological Sciences ,Chinese Academy of Sciences ,Shanghai 200230,China )Abstract :A reco mbinant str ain,Escherichia coli BL21(DE3)[pBLMV L2EGF],was used fo r the secr etor y productio n o f human epidermal g row th factor (hEGF).The expressio n of the gene coding for hEGF ,w hich w as inserted behind the p hoA signal sequence ,w as under the co ntrol o f P L pro moter .During the ex pression phase,gluco se was added at constant specific prov ision r ates,w hich had a g reat influence on the production and secretion of hEGF .When fed w ith g lucose at a specific pro vision rate of 0.122g /(g ・h),the hEGF pro duction level w as the lo west,and only 37.5%o f the produced hEGF w as secreted.With the increase of specific gluco se prov ision r ate,the specific productivities of extra-and intra-cellular hEGF w ere enhanced significantly.T he highest to tal hEGF production per biomass w as 121.6mg /g w ith a specific glucose provisio n rate of 0.196g /(g ・h ),and the ex tracellular hEGF accounted fo r about 42%of the total hEGF pro duced.T he pr einduction nutrient condition had a pro found influence on hEGF pro-duction;supplem entation of co mplex nitrog en sources g reatly improv ed the initial production rate of hEGF .1404 Key words:hum an epidermal gro wth factor;P L prom oter;secretio n;Escherichia coli 人表皮生长因子(hEGF)是由53个氨基酸残基组成的单链多肽,具有刺激蛋白转运,激活胞外大分子的合成和促细胞增殖等作用[1]。
因此,hEGF在医药、化妆品工业中具有广泛应用前景。
到目前为止,用于生产重组hEGF的表达系统大多采用IPT G诱导[2～3]和低磷诱导方式[4],利用温度诱导表达系统分泌表达hEGF尚未见文献报道。
温度诱导表达系统具有启动子强,诱导过程简单,不需添加诱导剂等优点,已被广泛用于外源基因的表达,但是外源蛋白多不能分泌而积累于细胞质中,且易以包涵体的形式存在,不利于形成活性蛋白[5],而利用信号肽将重组蛋白分泌到胞外可以避免胞内蛋白酶的降解及后续复性的步骤。
在含有丰富有机氮源的复合培养基中,葡萄糖主要作为能源为菌体生长和外源基因的表达提供能量[6],因此,在发酵过程中控制葡萄糖的流加速率对菌体生长和外源基因的表达影响很大。
本研究采用重组大肠杆菌BL21(DE3)[pBLM VL2EGF]分泌表达hEGF,其表达通过温控型P L启动子调控。
诱导表达阶段葡萄糖供应对hEGF生产和分泌有重大影响,本文主要考察了不同葡萄糖比供应速率和有机氮源对hEGF生产速率的影响。
1 材料与方法1.1 菌株本研究采用的菌种为E.coli BL21(DE3) [pBLM VL2EGF],由中科院生物化学和细胞生物学研究所构建。
质粒pBLM VL2EGF携带温度敏感的阻遏蛋白cIts857基因,hEGF的表达受K P L启动子的调控并由p hoA信号肽引导分泌。
1.2 培养基种子培养基:LB培养基(蛋白胨10g/L,酵母抽提物5g/L,NaCl5g/L),灭菌后加入100mg/L 氨苄青霉素钠。
补料分批发酵培养基:初培养基为补充葡萄糖5g/L的LB培养基,补料液为250g/L的葡萄糖。
1.3 种子培养从冷冻甘油管中取出0.7mL菌液,接入装有25m L种子培养基的250m L摇瓶,于摇床250r/ min,30°C下培养12h,为一级种子;将一级种子按2.8%的接种量转接到3个各装有50mL种子培养基的500m L摇瓶,同样条件下培养10h,为二级种子。
1.4 发酵罐培养将二级种子按6%的接种量接入到5L发酵罐(华东理工大学RIBE-5)中。
培养液装量为2.5L,生长阶段控制温度30°C,pH7.0,通气量为4L/ m in,初始搅拌转速为400r/min,发酵过程中转速逐渐提高,使溶氧(DO)不低于30%。
发酵开始以分批方式进行,当初糖耗尽后,以恒pH方式流加浓度为250g/L的葡萄糖溶液,即当pH超过7.0时自动补入葡萄糖。
发酵14h后升温至38°C进行诱导。
诱导阶段比较了两种葡萄糖流加方式,即恒比供应速率流加和恒速流加。
前者以恒比供应速率(Q G)流加250g/L葡萄糖,根据菌体浓度和设定的Q G不断调整葡萄糖的流加速率(每小时根据菌体浓度调整一次),Q G分别为0.122、0.135、0.167和0.196g/(g・h),诱导前半小时一次性加入相当于LB培养基浓度的有机氮源;后者以12.6mL/h的速率恒速流加100mL含葡萄糖(250g/L)和酵母抽提物(200g/L)的混合溶液,诱导前不补充有机氮源。
1.5 测定方法菌体浓度测定采用浊度法,测定波长600nm 处的光密度(OD600),根据标准曲线计算菌体干重。
葡萄糖测定采用葡萄糖测定试剂盒(上海生物制品研究所),按说明书方法测定。
乙酸测定采用气相色谱法(GC112A,上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂)。
hEGF的测定采用三(羟甲基)甲基甘氨酸(U= 0.15)-SDS-聚丙烯酰胺三层胶系统[7]分离目的蛋白,凝胶用考马斯亮蓝染色,用图像分析系统(上海复日)和分析软件(Smart View analy sis pro gram)进行扫描定量。
取发酵液于10000r/min,4°C下离心10min,得到的菌体和上清液分别用于胞内和胞外hEGF的测定。
将离心后得到的菌体用T ris-HCl 缓冲液(0.05m ol/L,pH7.0,4°C)洗涤,然后溶解到上样缓冲液中(pH6.8,T ris-HCl25mm ol/L,甘油(U=0.08),SDS(20g/L),巯基乙醇(U=0.05),溴酚兰(0.5g/L)),使其终浓度与初始菌浓一致。
发酵上清液与上样缓冲液混合后,直接用于电泳分析。
1405第12期张海毅,等:葡萄糖供应速率对大肠杆菌表达及分泌人表皮生长因子的影响 2 结果与讨论2.1 葡萄糖比供应速率对hEGF 生产水平的影响图1a 、b 分别给出了以不同比供应速率流加葡萄糖时胞内和胞外hEGF 的变化情况。
