芯片式流通池顺序注射可更新

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芯片式流通池顺序注射可更新表面反射光谱法用于酶反应检测王建雅 方肇伦3 徐淑坤(东北大学分析科学研究中心,沈阳110004)摘 要 将芯片式流通池顺序注射可更新表面反射光谱法用于酶反应检测。

HRP 催化H 2O 2氧化BPR 底物的反应用于对H 2O 2的检测。

此反应体系与葡萄糖氧化酶联用,用于对血清中葡萄糖的检测。

关键词 芯片式流通池,顺序注射可更新表面,反射光谱,酶反应 2001204220收稿;2001208210接受本文系教育部科学技术研究重点项目(N o.2000031)1 引 言将固体微珠做为试剂的载体,通过流动注射或顺序注射系统将微珠注入检测系统并随后排废的流动注射可更新表面技术(FI 2RST ,flow injection renewable surface technique )是流动注射分析的前沿领域之一1,该技术在痕量分析及生物分析中仍处于发展初期。

具有可对微珠进行截留和排放功能的流通池是FI -RST 系统的关键部件,适合于不同检测方法的流通池已见报道2~7。

本文提出了一种加工简便、结构简单的新型芯片式流通池,将其用于流动注射可更新表面反射光谱法检测。

以过氧化物酶催化,显色的氢授体底物与H 2O 2反应的分光光度法检测H 2O 2已被广泛地用于生物分析中。

近来文献报道了无偶联剂的偶氮萘酚衍生物8作为氢授体用于此类检测。

本文将溴代邻苯三酚红(brom opyrogallol red ,BPR )、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase ,HRP )、H 2O 2催化反应体系用于对H 2O 2的检测,并与葡萄糖氧化酶(glucose oxidase ,G OD )催化体系联用,用于检测葡萄糖。

2 实验部分2.1 试剂辣根过氧化物酶(E.C.1.11.1.7,268U/mg ,RZ >3.1,Sigma )。

葡萄糖氧化酶(115U/mg ,T oy obo C o.,Ltd .,Japan )。

血糖试剂盒(G LU K it ,北京北化精细化学品公司)。

溴代邻苯三酚红(上海试剂三厂)。

P olys orb ACT 21C 218微珠(Transgenomic ,Omaha ,US A ),微珠直径20~60μm 。

实验中所用试剂均为分析纯,去离子水经脱气处理。

2.2 仪器顺序注射(SI )系统由AS D 210注射泵(Bodenseewerk ,Perkin 2Elmer ,Uberlingen ,G ermany )和10位选择阀(Valco ,H ouston ,TX ,US A )组成,配5m L 针筒。

选择阀和注射泵的操作由计算机同步控制。

自制直径20mm 铜芯加热棒,30W ,X MT 2数显控温仪(CH NT G roup C orporation ,China )控温±1.0℃,加热棒密闭于套管中。

722型光栅分光光度计(山东高密分析仪器厂)。

LM142164型记录仪(上海大华仪表厂)。

自制的芯片式流通池(详见文献9)通过一根多股双岔光纤与检测器相耦合,流通池固定在分光光度计的液槽室中。

可更新反应表面的反射光在556nm 处检测。

流通池采用3层组合结构,上层有机玻璃片上设出入孔,与内径0.75mm 的聚四氟乙烯导管相接。

中间层500μm 厚的硅橡胶膜刻有宽1.8mm 流通池通道,通道中部嵌入孔径20μm 的多孔滤层。

多股双岔反射式光纤一臂将光源556nm 入射光导至流通池中微珠所在检测区,另一臂将微珠表面反射光导至检测器。

流通池与SI 系统用25cm 长、0.7mm i.d.的聚四氟乙烯管相连接。

贮存管HC 直径0.96mm ,长150cm ,体积为1100μL 。

废液贮存管WHC 直径0.96mm ,长56cm ,体积为400μL 。

多位阀与微珠悬浮液储瓶连接的管道直径为0.7mm ,长20cm 。

第30卷2002年3月 分析化学(FE NXI H UAX UE ) 研究简报Chinese Journal of Analytical Chemistry 第3期307~311图1 流动注射可更新表面检测系统 Fig.1 Flow injection renewable surface assay system a.SI 2RST 系统示意图(schematic diagram of the sequential injection 2renewable surface technique (SI 2RST )system )。

C.载流(H 2O carrier );SP.泵(syringe pum p );HC.贮存管(holding coil );Heater.加热棒(heating rod );MPV.多位阀(multiposition valve );VSP.注入阀(syringe valve );FC.流通池(microchip flow cell );REC.记录仪(recorder );L.卤素灯(light );D.检测器(detector );WHC.废液贮存管(waste holding coil );Bead.微珠(2.4g/L bead suspension )。

b.样带顺序(schematic diagram of the sequence of z ones in HC when step 12ofT able 1)Pho.缓冲溶液(phosphate bu ffer );BHP.试剂(mixture of brom opyrogallol red (BPR ),horseradish peroxidase (HRP )and bu ffer )。

与其它试液储瓶间连接管道直径为0.5mm 。

微珠悬浮液储瓶置于45°倾角保持旋转以维持微珠的悬浮。

2.3 实验方法2.3.1 溶液的配制 HRP 储备液40U/m L ,G OD 储备液11.5U/m L ,BPR 储备液2×10-4m ol/L ,均在4℃冰箱中保存。

H 2O 2储备液以K MnO 4标定,H 2O 2溶液使用时新配。

磷酸盐缓冲溶液配制:34.0g KH 2PO 4溶于500m L H 2O ,加入90m L 0.5m ol/L K OH 并调节至pH 6.2。

C 218微珠悬浮液的配制:先将微珠以少量乙醇润湿,然后加水稀释成2.4×10-3g/m L 。

2.3.2 SI 2RST 检测系统及检测过程 SI 2RST 检测系统结构见图1a 。

SI 系统从流通池入口端将微珠悬浮液、试剂、试样等注入流通池,检测器实时监测微珠表面并记录。

检测结束后SI 泵以反向流将微珠及废液从此端吸出流通池并排废。

SI 系统计算机控制程序见表1。

反应液吸入HC 中区带排列顺序见图1b 。

检测过程中实时记录的吸光度2时间曲线见图2。

酶反应底物BPR 在微珠表面的吸附线性范围的测定过程按表1进行,但省去6222步,加一步吸入BPR 试样。

表1 SI 系统操作程序T able 1 Sequence of operation of the sequential injection system步序Sequence N o.MPV 阀位MPV positionVSP 阀位VSP position步 数Syringe steps 3体 积V olume 3(μL )时 间T ime (s )功能Function 11左Left 240 400 3吸水H 2O aspiration27右Right 1202002吸缓冲液Phosphate bu ffer aspiration34右Right 2103502吸微珠Bead suspension aspiration48右Right 1202001吸水H 20aspiration 55右Right -390-65010注微珠Flow cell washing ,bead loading61右Right 601001吸气Air aspiration 72右Right 18301吸入BPR +HRP aspiration 83右Right 18301吸入H 2O 2aspiration92右Right 12201吸入BPR +HRP aspiration 103右Right 12201吸入H 2O 2aspiration111右Right 601001吸气Air aspiration 128右Right 1202002吸水H 20aspiration 136右Right -120-2002推水H 20pushing142196右Right 26重复3次Repeat 12~13for 3times206右Right 1202005水吸入H 20aspiration 216右Right -174-2905水排废H 20and air waste 225右Right -70-1162进缓冲液Phosphate bu ffer loading 235右Right -120-20012进样Sam ple and air loading 245右Right 3005003反吸W aste bead back 2suction 256右Right -536-8935排废W aste and holding coil washing 3步数与体积正值为吸入,负值为推出(“+”for aspirating in HC ,“-”for pushing out HC )803 分析化学第30卷3 结果与讨论3.1 系统的建立与优化芯片式流通池及SI 2RST 系统的优化见文献9。

SI 2RST 系统操作程序采用将微珠悬浮液先注入流图2 FI 2RST 检测吸光度2时间曲线 Fig.2 Abs orbance 2time curve for FI 2RST assay A 0.检测A 0曲线(abs orbance 2time curve for determination of A 0);A .检测A 曲线(abs orbance 2time curve for determination of A )。

a.表1中1~4步(curve for step 1~4of T able 1);b.表1中5步(curve for step 5of T able 1);c.表1中6~22步(curve for step 6~22of T able 1);d.表1中23步(curve for step 23of T able 1);e.表1中24~25步(curve for step 24~25of T able 1)。