当前位置：文档之家 › 溶菌酶结晶的研究进展

溶菌酶结晶的研究进展

  • 格式：pdf
  • 大小：163.29 KB
  • 文档页数：4

下载文档原格式

  / 4

合集下载

配液结晶法制备溶菌酶蛋白质晶体的生长机理研究

配液结晶法制备溶菌酶蛋白质晶体的生长机理研究

配液结晶法制备溶菌酶蛋白质晶体的生长机理研究摘要：一、引言1.溶菌酶的重要性2.配液结晶法在制备溶菌酶蛋白质晶体中的应用二、生长机理探讨1.溶菌酶蛋白质晶体的生长过程2.生长机理及其影响因素a.溶液浓度b.温度c.pH值d.添加剂三、实验方法1.配液结晶法具体操作步骤2.实验结果分析四、结论与展望1.溶菌酶蛋白质晶体生长机理的研究意义2.未来研究方向与挑战正文：随着科学技术的不断发展，溶菌酶作为一种具有广泛应用前景的生物酶，引起了广泛关注。

溶菌酶具有催化细菌细胞壁水解的作用，因此在医药、食品、农业等多个领域具有重要的应用价值。

制备溶菌酶蛋白质晶体是研究其结构与功能的关键步骤，而配液结晶法是常用的制备方法之一。

本文将探讨溶菌酶蛋白质晶体的生长机理，并分析影响其生长的因素。

溶菌酶蛋白质晶体的生长过程可以分为两个阶段：初期生长阶段和后期生长阶段。

在初期生长阶段，溶菌酶分子在溶液中随机吸附形成不稳定的晶体结构；在后期生长阶段，晶体结构逐渐稳定，溶菌酶分子通过液相转化为晶体相。

这个过程中，溶菌酶分子的聚集状态、晶体结构的稳定性以及溶液环境等因素都会影响晶体的生长。

生长机理及其影响因素主要包括以下几个方面：1.溶液浓度：溶液浓度对溶菌酶蛋白质晶体的生长具有重要影响。

在较低浓度下，溶菌酶分子之间的相互作用较弱，有利于晶体生长；而在较高浓度下，溶菌酶分子之间的相互作用增强，可能导致晶体生长受阻。

2.温度：温度对溶菌酶蛋白质晶体的生长具有显著影响。

一般来说，在较低温度下，溶菌酶分子的热运动较慢，晶体生长速率较低；而在较高温度下，溶菌酶分子的热运动加剧，有利于晶体生长。

然而，过高温度可能导致溶菌酶分子结构发生改变，从而影响晶体生长。

3.pH值：pH值对溶菌酶蛋白质晶体的生长也具有重要作用。

不同的pH 值下，溶菌酶分子的电荷状态和空间结构会发生变化，进而影响晶体生长。

通常情况下，在中性条件下，溶菌酶蛋白质晶体的生长较为顺利。

溶菌酶结晶实验报告

溶菌酶结晶实验报告

一、实验目的1. 了解溶菌酶的性质和特性；2. 掌握溶菌酶的提取和纯化方法；3. 学习溶菌酶的结晶技术；4. 鉴定溶菌酶的纯度和分子量。

二、实验原理溶菌酶（lysozyme）是一种广泛存在于生物体中的碱性蛋白质，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。

溶菌酶能水解细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的-1,4糖苷键，导致细胞壁破裂，从而杀灭细菌。

本实验通过从鸡蛋清中提取溶菌酶，经过分离纯化后，采用硫酸铵盐析法进行结晶，并鉴定溶菌酶的纯度和分子量。

三、实验材料1. 实验仪器：高速离心机、冰箱、紫外可见分光光度计、显微镜等；2. 实验试剂：鸡蛋清、硫酸铵、NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4、pH 7.0 Tris-HCl缓冲液、SDS-PAGE电泳试剂等；3. 实验耗材：离心管、玻璃棒、滤纸、试管、移液器、培养皿等。

四、实验步骤1. 溶菌酶提取（1）取鸡蛋清2g，加入20ml pH 7.0 Tris-HCl缓冲液，搅拌溶解；（2）加入0.1mol/L NaCl溶液，使NaCl浓度达到0.5mol/L，搅拌30分钟；（3）加入1mol/L CaCl2溶液，使CaCl2浓度达到0.1mol/L，搅拌30分钟；（4）加入1mol/L MgSO4溶液，使MgSO4浓度达到0.1mol/L，搅拌30分钟；（5）用高速离心机以5000r/min离心15分钟，取上清液。

2. 溶菌酶分离纯化（1）取上清液5ml，加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达到80%，搅拌30分钟；（2）用高速离心机以5000r/min离心15分钟，取沉淀；（3）将沉淀溶解于10ml pH 7.0 Tris-HCl缓冲液中，加入0.1mol/L NaCl溶液，使NaCl浓度达到0.5mol/L，搅拌30分钟；（4）用高速离心机以5000r/min离心15分钟，取上清液。

3. 溶菌酶结晶（1）取上清液5ml，加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达到80%，搅拌30分钟；（2）用高速离心机以5000r/min离心15分钟，取沉淀；（3）将沉淀溶解于5ml pH 7.0 Tris-HCl缓冲液中，加入0.1mol/L NaCl溶液，使NaCl浓度达到0.5mol/L，搅拌30分钟；（4）用高速离心机以5000r/min离心15分钟，取上清液；（5）将上清液置于冰箱中过夜，观察结晶现象。

溶菌酶的研究现状及应用进展综述

溶菌酶的研究现状及应用进展综述

溶菌酶的研究现状及应用进展综述
溶菌酶是一种具有溶菌作用的酶类，能够分解细菌细胞壁，从而导致细菌溶解和死亡。

由于其独特的作用机制和广泛的应用前景，溶菌酶的研究受到了广泛关注。

本文将对溶菌酶的研究现状及应用进展进行综述。

其次，溶菌酶的应用进展主要涉及医药、食品、环境等领域。

在医药领域，溶菌酶具有潜在的抗菌活性，可作为替代抗生素的候选物。

研究人员已经通过体外实验和动物实验，证明了溶菌酶对多种细菌感染的治疗效果。

此外，将溶菌酶与其他抗菌药物联合应用，能够提高抗菌效果，显示出协同作用。

在食品领域，由于溶菌酶对致病菌的特异性作用，可作为一种天然的食品防腐剂。

在环境领域，溶菌酶可以用于废水处理，去除细菌和其他微生物，减少对环境和人体的危害。

此外，溶菌酶还在生物技术领域具有潜在应用价值。

溶菌酶可以用于细胞壁的降解，从而释放出目标物质，如蛋白质、核酸等，用于后续的分析和鉴定。

此外，溶菌酶还可以应用于基因工程和基因治疗中，用于特定基因的表达和传递，具有广阔的发展前景。

溶菌酶的结晶实验报告

溶菌酶的结晶实验报告

一、实验目的1. 掌握溶菌酶的提取和纯化方法。

2. 学习溶菌酶的结晶技术。

3. 鉴定溶菌酶的纯度和分子量。

二、实验原理溶菌酶是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶，主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。

溶菌酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。

本实验采用硫酸铵盐析法从鸡蛋清中提取溶菌酶，通过调节溶液的pH值和离子强度，使溶菌酶在适宜条件下结晶。

三、实验材料1. 鸡蛋清2. 硫酸铵3. 氯化钠4. 乙二胺四乙酸（EDTA）5. 考马斯亮蓝G-2506. 0.1mol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.0）7. 紫外可见分光光度计8. 离心机9. 实验室用具：烧杯、移液管、滴定管、玻璃棒、滤纸等四、实验步骤1. 溶菌酶的提取（1）取一定量的鸡蛋清，加入适量的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）进行稀释。

（2）将稀释后的鸡蛋清溶液置于4℃冰箱中过夜。

（3）次日，取上清液，加入适量的硫酸铵，使硫酸铵浓度达到50%。

（4）充分搅拌，使溶菌酶沉淀。

（5）离心，收集沉淀，并用适量的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤沉淀。

2. 溶菌酶的纯化（1）将洗涤后的沉淀溶解于适量的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）。

（2）加入适量的EDTA，使EDTA浓度达到0.5mol/L。

（3）用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度。

（4）将溶液加入适量的氯化钠，使氯化钠浓度达到0.5mol/L。

（5）调节溶液的pH值至6.0，观察溶菌酶的溶解情况。

3. 溶菌酶的结晶（1）将纯化后的溶菌酶溶液置于4℃冰箱中过夜。

（2）次日，观察溶菌酶结晶情况。

（3）收集结晶，并用适量的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤结晶。

4. 溶菌酶的鉴定（1）采用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度。

溶菌酶分离纯化的研究进展

溶菌酶分离纯化的研究进展

院（系）名称生命科学系专业名称生物技术学生姓名徐孝锋学号111344009完成时间2013年11月溶菌酶分离纯化的研究进展生命科学系生物技术徐孝锋111344009摘要对近年来最新的溶菌酶分离纯化的方法,如包括膜色谱法、离子交换法、双水相技术、反胶团萃取、膨胀床吸附法等进行了总结并对利用溶菌酶时存在的问题进行了分析总结，对溶菌酶的应用前景进行了展望。

关键词溶菌酶; 膜色谱法; 分离; 纯化；应用The Research and Application of LysozymeAbstract In this article, the structure, properties, purification, activity measurement and renaturation of lysozyme are summarized. The application of the enzyme in food industry，biological engineering and medicine is also introduced．The encountered problems in application of lysozyme are pointed out, and the potential for further application of lysozyme is predicted．Keywords Lysozyme ；Structure and Properties ；Applications ；Purification ；Enzyme Activity溶菌酶(Ｌｙｓｏｚｙｍｅ)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,又称细胞壁溶解酶，是一种糖昔水解酶,水解组成细菌细胞壁的N一乙酞胞壁酸(NAM)和N一乙酞萄糖胺(NAG)之间的日一1,4糖昔键,广泛存在于自然界中[19]。

1922年弗来明(Ｆｌｅｍｉｎｇ)发现在人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶【4】。

溶菌酶应用及研究进展

溶菌酶应用及研究进展

溶菌酶应用及研究进展程时军１马立保２张伟１１．武汉新华扬生物股份有限公司，武汉４３００７４２．华中农业大学动物科技学院，武汉４３００７０摘 要：溶菌酶因具有蛋白质的本质及类似抗生素的作用的特点，受到了畜牧行业的普遍关注，近年来将其作为抗生素替代品研究也越来越多。

本文对溶菌酶作一简要介绍，并综述其生产、检测方法和在相关行业里的应用进展，为用户认识和使用溶菌酶提供参考。

关键词：溶菌酶；作用机制；生产；检测；应用；物及作用特点淀粉酶一样属Ｅ内部渗透ｓｕｓｈｉｍａ及．把质子传・ｙｎ＿＿Ｌ　ｌ；Ｕ－”．，热处理。

－些遗传证瑚拦争拙—｝＿登瞅利Ｊ冶困ｌＩ尤可增强其向ＩＦ两方面：｝某些含疏水巾＿＿．Ｌ，Ｊ“．口Ｊ一／Ｕ：一Ｌ慢叶４叫Ｉ口ＪＨＵ７丁糖甲基丙酸幽寅达９４％０帝Ｊ和法国在酒．），ＵＳＤＡ认，¨，Ｊ＝Ｌ…ｊ＾乜可能是随着次的小肽浓度出菌ｆｉｆｌ　Ｆｒｎｌｌ｝菌酶水平１肾脏机能是ｊＭｉｓｏｎ等，２同喂１７６ｍｇ／ｋｇ圉肠固有层变ｉ：，如毒性试验，，＇ｔｃａｔ　ｔｍｅｍｔｓｔＥ．ｏ｜ｌｅｙ．　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｈ　ｌｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｒ．　Ｐｈｉｈｐ　Ｇ．　ＥＩ（Ｄ． Ｉ，．，１１　｜ｔ￣ｌｌ　Ｉ￣　ＩＪｖｉｎｇ　ｄｉｅｔａｒｙ　ｃｌ，，－Ａｒｉａｓ　Ｌ　，　Ｒｏａｉｎｓｔ　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，　Ｓａｎｚ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｉｍｚｖｍｅ　ａｎｄ　Ｍｉｃｒｏｂｃｈａｎｇｅｓ　ｔｈａｔ￣ａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕ￣ｒｂｅｓ，　Ｍｉｃｈａ￣ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ　［，溶菌酶应用及研究进展作者：程时军， 马立保， 张伟作者单位：程时军,张伟(武汉新华扬生物股份有限公司,武汉430074)， 马立保(华中农业大学动物科技学院,武汉430070)本文链接：/Conference_7786207.aspx。

简述溶菌酶的研究现状

简述溶菌酶的研究现状作者：李红易建中刘成倩孙晓云严华祥来源：《国外畜牧学·猪与禽》2016年第06期摘要：溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶，是一种普遍存在于植物、动物和微生物中的盐基水解蛋白。

溶菌酶的特征在于无毒、无害、无残留、安全性高，因此被广泛用于抗菌、抗炎、抗病毒、免疫力提升、促进有益菌增殖（双歧杆菌）等用途。

本文分析和归纳了溶菌酶的研究发展、活性影响因素和分类，并总结了其在食品、医药、畜牧业和酶工程等行业的应用价值。

关键词：溶菌酶；性质；分类；应用中图分类号：S852.2 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2016）06-0099-031 溶菌酶简介溶菌酶（Lysozyme，LYZ），又称胞壁质酶（muramidase），其化学名称为N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种稳定的碱性蛋白酶。

它可对细菌细胞壁肽聚糖中的N-乙酰葡萄糖胺、以及N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键进行水解，促进细菌细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，降低细菌细胞壁的稳定性，导致细胞壁裂解内容物溢出，并最终引起细菌溶解[1]。

在与带负电荷的病毒蛋白相互结合的情况下，溶菌酶能够与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐。

这种复盐具有使病毒失去活力的特性。

研究表明，溶菌酶能够在不破坏其他组织的前提下，有选择地对微生物的细胞壁进行分解。

这种特性就使得溶菌酶具有抗菌消炎、抗病毒、增强免疫力、促进双歧杆菌等有益菌增殖的独特功效[2-4]。

据研究，溶菌酶作为单核细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的产物，对革兰氏阳性菌有显著的抑菌效果。

而且，溶菌酶作为碱性蛋白酶，是生物体内重要的非特异性免疫因子，在抑杀病原体时不易产生抗药性。

溶菌酶的这种与抗生素不同的抑菌机制已经得到重视，并应用于食品级药品当中。

另外，有文献证明溶菌酶可作为免疫调节和免疫激活剂[5]，在免疫系统中起着重要作用。

溶菌酶蛋白结晶实验报告

一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取和纯化方法。

2. 掌握溶菌酶蛋白结晶技术。

3. 了解结晶样品的鉴定和表征。

二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于人体和动物组织中的碱性蛋白质，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。

本实验通过从鸡蛋清中提取溶菌酶，并利用硫酸铵盐析法进行纯化，最后采用硫酸铵饱和溶液进行蛋白结晶。

三、实验材料与仪器1. 材料：鸡蛋清、硫酸铵、氯化钠、氢氧化钠、硫酸铜、硝酸银、无水乙醇、正己烷等。

2. 仪器：冰箱、离心机、超速离心机、紫外-可见分光光度计、显微镜、结晶棒、玻璃棒等。

四、实验步骤1. 溶菌酶提取（1）取新鲜鸡蛋清，用无菌生理盐水稀释10倍，混匀。

（2）取稀释后的鸡蛋清溶液，加入1/10体积的1.0 mol/L氢氧化钠溶液，搅拌均匀。

（3）室温下静置1小时，使蛋白质充分溶解。

（4）将溶液转移至离心管中，以4 000 r/min离心10分钟，取上清液。

2. 溶菌酶纯化（1）取上清液，加入1/5体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀。

（2）室温下静置30分钟，使蛋白质充分沉淀。

（3）以4 000 r/min离心10分钟，弃去上清液。

（4）将沉淀用少量蒸馏水溶解，加入1/10体积的1.0 mol/L氢氧化钠溶液，搅拌均匀。

（5）加入1/5体积的饱和硫酸铵溶液，重复上述步骤，以去除杂质。

3. 溶菌酶结晶（1）取纯化后的溶菌酶溶液，加入1/5体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀。

（2）室温下静置30分钟，使蛋白质充分沉淀。

（3）以4 000 r/min离心10分钟，弃去上清液。

（4）将沉淀用少量蒸馏水溶解，加入1/5体积的硫酸铵饱和溶液，搅拌均匀。

（5）将溶液转移至结晶棒上，置于冰箱中过夜。

4. 结晶样品鉴定（1）取结晶样品，加入少量无水乙醇，观察其溶解性。

（2）取结晶样品，加入少量硝酸银溶液，观察其反应。

（3）取结晶样品，加入少量硫酸铜溶液，观察其反应。

五、实验结果与分析1. 溶菌酶提取：成功从鸡蛋清中提取出溶菌酶，紫外-可见分光光度计检测结果显示蛋白质含量约为1.0 mg/mL。

溶菌酶的研究进展

溶菌酶的底物特异性很强 ,不同来源溶菌酶作用的 底物不同 。按溶菌酶的来源可分为蛋清溶菌酶 、动物溶 菌酶 、植物溶菌酶 、微生物溶菌酶和细菌噬菌体溶菌酶 。 按作用细胞壁不同分为细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞 壁溶菌酶 。细菌细胞壁溶菌酶又细分为两种 ,一种是作 用于 β21, 4 糖苷键的细胞壁溶解酶 ,另一种是作用于肽 链“尾 ”端和酰胺部分的细胞壁溶解酶 。真菌细胞壁溶 菌酶包括酵母菌细胞壁溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶 。 溶菌酶大体分为 5 种 : ( 1)内 N 2乙酰己糖胺酶 ,此酶同 于鸡蛋清溶菌酶 ,破坏细菌细胞壁肽聚糖中的 β2114 糖 苷键 。 ( 2)酰胺酶 ,切断细菌细胞壁肽聚糖中 N 2乙酰氨 基葡萄糖胺与肽“尾 ”之间的 N 2乙酰胞壁酸 2L 2丙氨酸 键 。 ( 3)内肽 酶 , 使 肽“尾 ”及 肽“桥 ”内 的 肽键 断 裂 。 (4)β2113、β2116葡聚糖酶和甘露聚糖酶 ,此酶分解酵母 细胞的细胞壁 。 ( 5)壳多糖酶 ,这是分解霉菌细胞壁的 一种溶菌酶 [5 ] 。 3 影响溶菌酶活力的因素与酶活力的测定方法 311 影响酶活的因素 : 包括温度 、pH 值 、化学物质 、络 合作用等 。 312 溶菌酶酶活力的测定方法通常有 3种 。
溶菌酶 (Lysozyme)是水解酶的一种 ,又称为胞壁质 酶 (muram idase)或 N 2乙酰 胞 壁质 肽 聚 糖水 解 酶 (N acetylmuram ideglycanohydrlase) 。溶 菌 酶 是 一 种 碱 性 蛋 白质 ,在酸性环境下 ,溶菌酶对热的稳定性很强 , pH 值 310时 96℃加热处理 15m in 仍能保持 87%的酶活性 。 在自然条件下 ,大多数溶菌酶化学性质稳定 ,即使当 pH 值在 112 ～1113 范围内剧烈变化 , 其酶结构仍维持不 变 ,活性也不受影响 。但碱很容易使酶活性遭到破坏 , 当处于碱性 pH 值范围时 ,溶菌酶的热稳定性就很差 [2 ] 。 溶菌酶在干燥条件下 ,室温可长期保存 ,其纯品为白色 或微黄色结晶体或无定型粉末 ,无嗅 ,味甜 ,易溶于水 , 不溶于丙酮 、乙醚 。 112 空间结构

浅谈溶菌酶的研究进展

期引言英国细菌学家弗莱明最早在人体的唾液、眼泪等分泌物中发现了溶菌酶，因为它能溶解细菌，故称为溶菌酶，它的作用机制是破坏细菌细胞壁肽聚糖层的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁破裂，使细菌溶解。

溶菌酶作为安全的抑菌剂已被应用于食品加工、疾病治疗等方面，需求量大，所以利用生物技术大量生产迫在眉睫。

此外，关于“淀粉样纤维”形成基于溶菌酶的研究较为热门，因此本文将从这两方面进行叙述。

1溶菌酶的结构及其与病理学相关的研究溶菌酶是蛋白质，具有高级结构，依靠疏水作用、氢键等次级键折叠形成一定的构象，发挥特殊功能。

目前，人类最了解的溶菌酶是鸡蛋清溶菌酶(HEWL)，它包含一条肽链，129个氨基酸。

4对半胱氨酸残基间形成4个二硫键，具有大量的α螺旋结构。

HEWL在体外一定条件的诱导下可以形成“淀粉样纤维”，研究人员发现PH值较低时，蛋白质逐渐去折叠，随着去折叠蛋白质浓度的增大，蛋白质之间的疏水作用加大，逐渐出现“淀粉样纤维”，具有成核效应。

另外在蛋白质变性剂的存在下，溶菌酶的二级结构发生变化，可能出现“淀粉样纤维”，但是不同浓度的变性剂对“淀粉样纤维”的作用也不同，研究还有待深入。

陕西理工大学白瑜博士利用溶菌酶与朊蛋白结构上的相似性来研究淀粉样纤维的形成机制，为神经退行性疾病的研究带来福音[1]。

溶菌酶是一种小分子碱性蛋白，材料易取，一直被作为一种模型体系，用于研究蛋白质的空间构象、酶动力学及其与分子进化、分子免疫间的关系。

为优化食品加工过程、提高食品质量提供理论指导，并为神经系统等疾病建立了相关蛋白质模型。

目前有研究人员利用溶菌酶为模型研究盐浓度对蛋白质聚集的影响，对人类疾病的研究具有重要意义。

2基因工程载体表达溶菌酶的新进展溶菌酶的用处广泛，但直接从生物体内提纯效率低，所以其基因的重组和表达也成为研究热点。

鸡溶菌酶的外显子及内含子序列已经确定，人的溶菌酶基因也逐渐被解析清楚，为重组表达载体的构建和优化提供契机。

  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2006 年 9 月 第 20 卷第 3 期总 65 期
北京联合大学学报 (自然科学版) Journal of Beijing Union University(Natural Sciences)
Sep . 2006 Vol. 20 No. 3 Sum No. 65
溶菌酶结晶的研究进展
陶凤云1 ,张新妙2 ,马润宇2
对于生物大分子的具体结构的了解可以揭示 它们的功能 ,这在新药设计以及改变分子结构使之 具有更高的工业应用潜力方面是非常有用的 。X 射线 衍 射 是 确 定 蛋 白 质 三 维 空 间 结 构 的 有 效 方 法[1] ,但是只有当得到合适的晶体时才可以用这样 的方法 。结构测定常常由于得不到高质量的晶体 而受到阻碍 。质量较好的蛋白质晶体的获得是蛋 白质进行结构分析的重要前提 。
许多学者对溶菌酶的结晶条件及影响因素进 行了研究 ,探讨了最优结晶条件 。Lu 等[14] 研究了 沉淀剂 、温度和添加剂对溶菌酶的溶解度 、暴露成
核的临界过饱和度和晶体形状的影响 。结果表明 , 对于溶菌酶的结晶 ,氯化钠作为沉淀剂是更有效 的 ,溶菌酶的结晶和温度有很大关系 ,逐渐变化的 温度 能 导 致 溶 菌 酶 更 好 的 晶 习 和 质 量 。Sauter 等[15] 研究了 50 多种化合物作为添加剂时对溶菌酶 结晶的影响 。结果表明 ,海藻糖能够明显提高母鸡 蛋白溶菌酶 ( HEWL) 的成核率 ,短链醇和多羟基化 合物对晶习和成核率有中等程度的影响 。糖 、乙 醇 、离子 、聚胺 、表面活性剂等能提高分子稳定性 、 成核和生长及质量 。阴离子是决定溶菌酶溶解性 和结晶空间簇的主要沉淀类型 。研究发现小鸡蛋 白溶菌酶 (CEWL) 浓度在 60～190 mgΠmL 范围内时 , 在酸性和碱性 pH 下能从铵 、钠 、钾 、铷 、镁和锰的硫 酸盐里结晶出来[16] 。Forsythe 等[16] 在不同条件下 制备了四种不同晶形 (四角形 、三角形 、正交 、单斜 晶系) 的小鸡蛋白溶菌酶晶体 ,发现在酸性 pH 下 , CEWL 仅能从硫酸根阴离子溶液中结晶 ;在中性缓 冲溶液里 ,CEWL 能被各种无机硫酸盐结晶 。磷酸 盐 、醋酸盐 、碳酸盐 、氯化物 、溴化物 、柠檬酸盐 、硝 酸盐 、碘化物 、硫氰酸根盐等的阴离子 ,也能结晶小 鸡蛋白溶菌酶 。Fermani 等[17] 以包括可电离基团的 聚合体膜 、吸附了聚 L - 赖氨酸或聚 L - 天冬氨酸 盐的交联凝胶膜和吸附了聚 L - 赖氨酸或聚 L - 天 冬氨酸盐的蚕丝蛋白等作为蛋白质非均相成核的 表面 ,进行了小鸡蛋白溶菌酶的结晶实验 。戴等[18] 用动态光散射法研究了 NaCl 为沉淀剂时 ,不同浓 度的 NaCl 对液 - 液扩散法生长溶菌酶晶体的影 响 ,并测量了晶体生长前后体系的 Zeta 电势 。结果 表明 ,NaCl 浓度较高时 ,溶液中一直存在较大的聚 集体 ,生长出的晶体质量较差 。在合适的 NaCl 浓 度下 ,溶液中溶菌酶的大的聚集体发生解聚集 ,生 长出的晶体质量较高 。2005 年 ,Curcio 等[19] 又研究 了不同洗脱液流速下溶菌酶的动态膜结晶 ,并进行 了结晶动力学分析 。结果表 明 , 温 度 为 5 ℃、3 % NaCl ( WΠV ) 、10 %MgCl2 ( WΠV) 时 ,在 1 100 μmΠs 的 洗脱液流速下 ,晶体生长速率达到最大值 。由于蛋 白质溶液的成核及结晶过程被不断变化的浓度控 制 ,因此 , Pullara 等[20] 尝试通过控制液 - 液分层区 的不规则波动来控制溶菌酶的结晶速率 ,取得了很 好的效果 。 21213 结晶机理的研究
2 溶菌酶结晶的研究进展情况
211 溶菌酶的早期研究 1946 年 Alderton 报道生长出四方晶系的溶菌
[ 收稿日期 ] 2006 - 02 - 23 [ 作者简介 ] 陶凤云 (1970 —) ,女 ,北京市人 ,北京联合大学生物化学工程学院讲师 ,主要研究方向为生物化工 、天然产 物生物活性 。
1) 显微镜观测法 。显微镜是最直接的观测方 法 ,通过显微镜可以观测晶体形貌 ,确定结晶诱导 时间 、成核及生长速率和晶体尺寸分布等 。原子显 微镜可以观测物体表面的形貌 ,其分辨率达到纳米 级 ,是研究生物样品形貌极为有用的工具 。显微镜 观测方法简单易行 ,但是存在一定的人为和系统误 差[25 ] 。
溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织 中的非特异性免疫因素 ,具有多种药理作用 ,它具 有抗菌 、抗病毒 、抗肿瘤的功效 。目前日本已生产 出医用溶菌酶 ,其适应症为出血 、血尿 、血痰和鼻炎 等 。溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能 ,以此 酶处理 G+ 细菌得到原生质体 ,是基因工程 、细胞工 程中细胞融合操作必不可少的工具酶 。溶菌酶是 一种无毒 、无副作用的蛋白质 ,又具有一定的溶菌 作用 ,因此可用作食品防腐剂 。现已广泛应用于水 产品 、肉食品 、蛋糕 、清酒 、料酒及饮料中的防腐 ;还 可以添入乳粉中 ,使牛乳人乳化 ,以抑制肠道中腐 败微生物的生存 ,同时直接或间接地促进肠道中双 歧杆菌的增殖 。此外 ,还能利用溶菌酶生产酵母浸 膏和核酸类调味料等 。
(1. 北京联合大学 生物化学工程学院 ,北京 100023 ; 2. 北京化工大学 生命科学与技术学院 ,北京 100029)
[ 摘 要 ] 溶菌酶作为一种重要的模型蛋白被广泛应用于蛋白质结晶机理和方法的研究 。概括 了溶菌酶的结构 、性质及应用 ,总结了溶菌酶的常用结晶方法 ,探讨了近年出现的新的结晶方法 , 介绍了结晶条件 、结晶机理及主要的观测方法 ,展望了溶菌酶结晶过程的发展前景 。 [ 关键词 ] 溶菌酶 ;结晶 ;蒸发扩散 ;膜结晶 [ 中图分类号 ] Q 814 [ 文献标识码 ] A [ 文章编号 ] 100520310 (2006) 0320037204
结晶机理包括晶核形成和晶体生长机理 。 成核包括初级成核和二次成核 ,初级成核按照 经典成核理论给出了临界晶核形成速率[21] ;对于二
© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
意大利的 Curcio 等对膜结晶法结晶溶菌酶作 了一系列研究 。2002 年 ,Curcio 等[11] 将渗透膜结晶 的方法用于溶菌酶溶液的结晶 ,制得了溶菌酶晶 体 。实验中以 NaCl 为沉淀剂 ,MgCl2 溶液为洗脱 液 ,以醋酸钠缓冲溶液调节溶菌酶溶液的 pH 值 。 用静态膜结晶 , 温度为 4 ℃,MgCl2 浓度为 16 %～ 22 % ( WΠV ) ,NaCl 浓度高于 115 %时 ,一天后可见 溶菌酶晶体生成 ;而连续式膜结晶中 ,数小时后就 得到了大量溶菌酶晶体 。2003 年 ,Curcio 等[12] 在上 述基础上 ,考察了沉淀剂浓度 、洗脱液浓度 、蛋白质 溶液温度对溶菌酶膜结晶过程中通量的影响 。实 验主要研究了静态膜结晶 ,得到了适合于衍射分析 的四角形溶菌酶晶体 。当 NaCl 和 MgCl2 浓度分别 在 2 %～415 % 和 16 %～22 % 范围内时 ,24 h 内得 到了尺寸在 013～015 mm 范围内的晶体 。然而 ,将 静态膜结晶得到的结晶条件用于连续式膜结晶 ,仅 得到了大量尺寸较小 ( < 011 mm) 的溶菌酶晶体 。 同年 ,Profio 等[13] 用混浊度评价了微孔疏水膜的溶 菌酶结晶动力学 ,探讨了 NaCl 和 MgCl2 浓度对晶体 成 核 和 生 长 速 率 的 影 响 。在 20 ℃, 20 mgΠmL HEWL ,2 %和 215 % NaCl ,24 %MgCl2 条件下 , 得到 了适合于衍射分析的溶菌酶晶体 。 21212 结晶条件的优化
鸡蛋清溶菌酶占蛋清总蛋白的 314 %～315 % , 作为溶菌酶类的典型代表 ,是目前重点研究的对 象 ,也是了解最清楚的溶菌酶之一 。它是由 18 种
129 个氨基酸残基组成的一条单肽链 ,分子形状呈 扁长 椭 圆 体 , 具 有 4 对 S —S 键 , 其 分 子 量 为 14 307 Da[3] ,最 适 pH 为 6 ～ 7 , 等 电 点 PI 1015 ～ 1112 。在 pH 4～7 、100 ℃处理 1 min 不失活性 ,是一 种比较稳定的碱性球蛋白 。溶菌酶产品活力 ≥118 万 UΠmg ,溶于稀盐水 ,在丙酮和乙醇作用下生成沉 淀 。在酸性溶液中比较稳定 ,加热至 55 ℃也不会受 到影响 ,可以耐热至 100 ℃。在碱性溶液中则随浓 度 、温度的升高而丧失其酶活力 。溶菌酶的水溶液 在 6215 ℃、30 min 会完全失活 。
溶菌酶是一种在食品 、医学、生物工程等多种领 域中用途非常广泛的蛋白质 ,目前实际应用的、业已 商品化的是鸡蛋清溶菌酶 。鸡蛋清溶菌酶容易生长 出单晶 ,自 1946 年 Alderton 报道生长出四方晶系的 溶菌酶晶体后 ,溶菌酶作为一种重要的模型蛋白已 被广泛应用于蛋白质结晶机理和方法的研究 。
1 溶菌酶的结构 、性质 、稳定性及应 用
溶菌酶又称胞壁质酶 ,味甜 、易溶于水 ,不溶于 有机溶剂[2] ,常与 Cl - 结合成氯化物 。溶菌酶分子 带 10 个正电荷 ,分子中精氨酸 、天冬氨酸和色氨酸 的含量高 ,酪氨酸的比例则低 。溶菌酶广泛地分布 于自然界中 ,以鸡蛋清中含量最多 。根据来源不 同 ,其性质及作用机制略有差异 ,可分为以下几种 : 1) 鸡蛋清溶菌酶 ;2) 人及哺乳动物溶菌酶 ;3) 植 物溶菌酶 ;4) 微生物产生的溶菌酶 。
目前 ,对溶菌酶结晶的研究主要集中在结晶方 法的创新 、结晶条件的优化 、结晶机理的研究和观 测方法等方面 。 21211 结晶方法的创新
结晶方法很多 ,可分为批量结晶 、蒸发扩散结 晶 (悬滴法Π座滴法) 、液Π液扩散结晶和透析结晶[7] 。 另外 ,还有凝胶扩散结晶 、水热法及溶剂热法结晶 、 升华结晶[829] 和膜结晶[10] 等 。溶菌酶结晶的常用方 法主要是批量结晶和蒸发扩散结晶 。近几年 ,人们 尝试用膜结晶法结晶溶菌酶 ,结果制得了质量较好 的适合于衍射分析的溶菌酶晶体 。