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重组质粒pGMLV-SC1RNAi的构建及其对猪卵巢颗粒细胞c-Fos的影响

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一
【 Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ 】 Ｏ ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｃ ｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ａ ｌ ｅ ｎ ｔ ｉ ｖ ｉ ｒ ａ ｌ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ｃ ａ ｒ ｒ ｙ ｉ ｎ ｇ ｓ ｗ ｉ ｎ ｅ ｃ — Ｆ ｏ ｓ ｇ ｅ ｎ ｅ ａ ｎ ｄ ｉ ｎ ｖ ｅ ｓ ｔ ｉ ｇ ａ ｔ ｅ ｉ ｔ ｓ ｅ ｆ ｅ ｃ ｔ ｓ ｏ ｎ
【 摘要 】 目的
构建慢病毒载体及观察其介 导的 Ｒ Ｎ Ａ干扰 猪 卵巢颗 粒细胞 ｅ — Ｆ ｏ ｓ 基 因表达情 况。方法
通过 在 线 软 件 设 计 猪 ｃ— Ｆ ｏ ｓ 基因ｓ ｈ Ｒ Ｎ Ａ序 列 ， 合 成、 退 火形 成 双 寡链 核 酸后 克 隆 到 Ｐ Ｇ Ｍ Ｌ Ｖ— Ｓ Ｃ １ 载体 ， 测序 。用
ｃ —Ｆ ｏ ｓ ｇ ｅ ｎ ｅ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ ｐ ｏ ｒ ｃ ｉ ｎ ｅ ｏ ｖ ａ ｉ ｒ ａ ｎ ｇ ｒ ａ ｎ ｕ ｌ ｏ ｓ ａ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ （ Ｇ Ｃ ｓ ） ． Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ Ｐ ｏ ｒ ｃ ｉ ｎ ｅ ｃ—Ｆ ｏ ｓ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ｈ ０ ｒ ｔ ｈ ａ ｉ ｒ ｈ ｉ ｎ Ｒ Ｎ Ａ
构建的慢病毒表达载体和 包装质粒共 转 染 ２ ９ ３ Ｔ细胞 ， 包装成 ４组 病毒 （ ｓ ｈ Ｒ Ｎ Ａ ｃ—Ｆ ｏ ｓ ｌ 、 ｓ ｈ Ｒ Ｎ Ａ ｃ—Ｆ ｏ ｓ ２ 、 ｓ ｈ Ｒ Ｎ Ａ
ｃ —Ｆ ｏ ｓ ３ 、 ｓ ｈ Ｒ Ｎ Ａ ｃ —Ｆ ｏ ｓ ４ ） ， 并测定滴度 。感 染猪 卵 巢颗 粒细 胞 ， 采用 Ｐ Ｃ Ｒ 和 Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂ ｌ ｏ ｔ 检 测 各 组 细 胞 ｃ—Ｆ ｏ ｓ ｍ Ｒ Ｎ Ａ和 蛋 白表 达 。结 果 重组 克 隆 中插 入 片段 序 列 与 设 计 的 Ｏ ｌ ｉ ｇ ｏ序 列 完全 一 致 。 滴度 为 １×１ ０ Ｔ Ｕ ／ ｍ Ｌ ， 感 染 复数 ３ ０时 ， 阴性 对 照 组 、 实验 ｓ ｈ Ｒ Ｎ Ａ ｅ—Ｆ ｏ ｓ ４ 、 ｓ ｈ Ｒ Ｎ Ａ ｃ —Ｆ ｏ ｓ ３ 、 ｓ ｈ Ｒ Ｎ Ａ ｃ —Ｆ ｏ ｓ ２ 、 ｓ ｈ Ｒ Ｎ Ａ ｃ— Ｆ ｏ ｓ １组 Ｃ—Ｆ ｏ ｓ ｍ Ｒ Ｎ Ａ 的
倍（ Ｐ＜ ０ ． ０ ５ ） ， ｃ— Ｆ ｏ ｓ 蛋 白的表达 下降。结论 实验 ｓ ｈ Ｒ Ｎ Ａ ｃ —Ｆ ｏ ｓ １组 ｃ —Ｆ ｏ ｓ 基 因下调最明显， 成功构建猪 卵巢颗
粒细胞 ｃ —Ｆ ｏ ｓ 基 因慢病毒 Ｒ Ｎ Ａ ｉ 表达载体并筛选出最佳 ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ序 列。为 ｃ —Ｆ ｏ ｓ 基 因的功能研 究提供 了研 究基础 。
ｚ ｈ ｏ ｕ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ，Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ ５１ ０ １ ８ ２，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ． Ｃ ｏ ｒ ｒ ｅ ｓ ｐ ｏ ｎ ｄ ｉ ｎ ｇ ａ ｕ ｔ ｈ ｏ ｒ ： ＭＡ Ｈｏ ｎ ｇ —ｘ ｉ ａ ． Ｅ —ｍａ ｉ ｌ ：ｄ ｏ ｃ ｔ ｏ ｒ ｍａ ｘ ｉ ａ １ ９ ７ ４ ＠ｙ ａ ｈ ｏ ｏ ． ｃ ｏ ｎ． ｃ ｎ
表达 分别为对照组的 ０ ． ８ ４ ２ ７± ０ ． ０ ６ ５ ６ 、 ０ ． ７ ９ ７ ６ － ４ ０ ． ０ ７ ３ ８ 、 ０ ． ６ ９ ４ １ ４ － ０ ． ０ ４ ８ ９ 、 ０ ． ６ ５ ３ ７± ０ ． ０ ４ ７ ０ 、 ０ ． ３ １ ２ ３－ ｔ － ０ ． ０ １ ０ ６
・
３ ３ ６・
广 东医学
２ ０ １ ４年 ２月 第 ３ ５卷第 ３期 Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｄ ｏ ｎ ｇ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ Ｆ ｅ ｂ ．２ ０ １ ４ ，Ｖ ｏ １ ．３ ５ ，Ｎ ｏ ．３
基 础 研
究
重组 质粒 ｐ Ｇ ＭＬ Ｖ—Ｓ Ｃ １ Ｒ Ａ ｉ 的构 建 及 其 对
【 关键 词】 ｅ —Ｆ ｏ ｓ ； Ｒ Ｎ Ａ干扰 ； 慢 病毒 ； 猪 卵巢颗粒 细胞
Ｃｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ａ ｎ ｔ ＲＮＡｉ ｐ ｌ ａ ｓ ｍｉ ｄ ｐ ＧＭ Ｌ Ｖ— — Ｓ ＣＩ ａ ｎ ｄ ｉ ｔ ｓ ｅ ｆｅ ｃ ｔ ｓ ｏ ｎ ｃ— — Ｆ ｏ ｓ ｇ ｅ ｎ ｅ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ ｐ ｏ ｒ ｃ ｉ ｎ ｅ ｏ －
猪 卵 巢 颗 粒 细 胞 ｃ—Ｆ ｏ ｓ的影 响 术
叶丹凤 ，郑艳 华 ，丁涛。 ，薛士鹏 ，马 红 霞
‘ 广 州医科大学研 究生院 （ 广州 ５ １ ０ １ ８ ２ ） ； 广州 医科 大 学附 属第 四医院 中 医科 （ 广州 ５ １ １ ４ ４ ７ ） ； 湖北 省荆 门市 第二人 民医院妇产科 （ ４ ４ ８ ０ ０ ０ ） ； 南阳医学高等专科学校科研处（ 河南南 阳 ４ ７ ３ ０ ６ １ ） ； 广州 医科大 学附属第 一医 院 中医科 （ 广州 ５ １ ０ １ ２ ０ ）
ｖ ａ ￣ ａ ｎ ｇ ｒ ａ ｎ ｕ ｌ ｏ ｓ ａ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ． Ｙ Ｅ Ｄ ａ ｎ－ ｆ ｅ ｎ ｇ ， Ｚ Ｈ Ｅ Ｎ Ｇ Ｙ ａ ｈ—ｈ ｕ ａ ， Ｄ Ｉ Ｎ Ｇ Ｔ ａ ｏ ， Ｘ Ｕ Ｅ Ｓ ｈ ｉ — ｐ ｅ ｎ ｇ ， ＭＡ Ｈ ｏ ｎ ｇ— ｘ ｉ ａ ． Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ —

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高效率构建包含内含子的hpRNAi植物载体

高效率构建包含内含子的hpRNAi植物载体

高效率构建包含内含子的hpRNAi植物载体高效率构建包含内含子的hpRNAi植物载体摘要在植物基因功能分析中广泛使用的双链RNA干扰（RNAi），是一种高效率的系统，对于制作发夹RNA（hpRNA）结构有一个很大的需求量。

在这里，我们描述了一种新的限制性连接方法，提供了包含内含子的hpRNA（ihpRNA）载体的一种简单而高效的建设。

该系统以优势型IIS的限制性内切酶BsaI和我们新的植物RNAi载体pRNAi-GG（GG）以GG克隆为基础。

这种方法需要有感兴趣的基因的BsaI 识别序列侧翼只有一个单一的PCR产物，然后可以克隆到pRNAi-GG 上在正方向和反方向同时形成ihpRNA的构造。

在这个过程中，在一个管与一个限制性连接步骤完成后，产生的重组ihpRNA具有高效率和零背景。

我们证明与pRNAi-GG载体向量生成的ihpRNA结构的效用有效沉默各种单独的内源和外源标志物基因以及同时沉默这两个基因。

此方法提供了植物功能基因组学的大规模分析的新颖的和高效率的平台。

介绍在双链RNA被发现作为一体的能触发RNA干扰（RNAi）之后[1]，RNA干扰也成为一个基因功能[2-4]分析的最强大的工具。

发夹RNA（hpRNA）结构通常用于通过RNA干扰[5]的机制来诱导靶基因的degra-dation。

在植物中，含有发夹RNA的内含子（ihpRNA）配有一个内含子作为间隔序列表示出了最高基因沉默效率[6]。

因此，ihpRNA结构已被广泛用于植物中的基因沉默。

与在植物中基因序列的爆炸性释放和基因组序列，高效率和成本制作ihpRNA结构系统需求量很大。

为了便于ihpRNA结构的产生，几种方法已经被报道。

传统的连接酶的载体如pHANNIBAL和pKANNIBAL首次使用生成ihpRNA结构[6]。

该方法需要几轮限制和连接，并且因此，比较乏味和耗时。

有一种可替代地方法，GATEWAY 克隆系统为基础的RNAi载体如pHELLSGATE系列和PIPK系列已被广泛用于产生ihpRNA结构[7-9]。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M基因重组腺病毒的构建及表达

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M基因重组腺病毒的构建及表达


猪繁 殖 与 呼吸综 合 征 （ ｏ ｃ ｅｒｐｏ ｕ ｔ ｅａ ｄ Ｐ ｒｉ ｅ ｒ ｄ ｃｉ ｎ ｎ ｖ ｒｓ ｉ ｔｒ ｙ ｄｏ ， Ｒ ） 由猪 繁 殖 与 呼 吸综 ｅｐｒ ｏ ｙｓ ｎ ｒ ｍｅ Ｐ ＲＳ 是 ａ
经 常存 在于腺 体 ， 第 １次 就 是从 腺 体 组 织 中分 离 且
病 毒 载体 。以腺 病 毒 为 载 体 构建 重 组 疫 苗 ， 达 主 表
蛋 白为核 蛋 白 ， 蛋 白为基 质蛋 白［６。 由 Ｏ Ｆ Ｍ ４￣ － Ｒ ５编 码 的 ＧＰ 蛋 白可 以诱 导机 体 产生 中和 抗体 ， 最 主 ５ 是 要 的 保 护 性 抗 原 ；由 Ｏ ６ 编 码 的 Ｍ 蛋 白 是 ＲＦ
２ｈ Ｐ Ｓ洗 涤 ３次 ； ，Ｂ 以荧光标 记 的羊抗 鼠的 ＩＧ为 二 ｇ 抗 ，７℃作用 ３ ｎ Ｐ Ｓ洗涤 ３ ， ３ ０ｍｉ， Ｂ 次 吹干 ， 加入 缓 冲 甘油 ， 荧光显微镜 下观察 。
ｇ ｎ 购 自 Ｒｏｈ ｅｔ ｃ ｅ公 司 ； 光 素 Ｆ ＴＣ 标 记 羊 抗 鼠 荧 Ｉ ＩＧ、 根标 记羊 抗 鼠 ＩＧ 购 自 Ｇｅ ｅ ｅ ｇ 辣 ｇ ｎ Ｔ ｘ公 司 ； 伊文 思蓝 购 自 Ｓｇ 公 司产 品 ； ｉｍａ 甲醇 、 吐温－０购 自北 京 ８ 北化精 细化 学 品有 限责任公 司 。
１ ２ ５ Ｗｅｔ ｎ ｂ ｔ分 析 将 接 种 重 组 腺 病 毒 ．． ｓ ｒ ｌ ｅ ｏ
ｒ ｄ－Ｐ 一 的 ２３ Ａ ｖＧ ５Ｍ ９ ＡＤ细胞 培养 ２ ， ４ｈ 用细胞裂解 液 裂解后 ， 心取 上清 进行 Ｓ ＳＰ ＧＥ 离 Ｄ － Ａ 。之 后转 印到 硝
摘 要 ： 为构 建猪 繁殖 与呼 吸综合 征病 毒 （ Ｒ Ｓ 重组腺 病 毒 活载体 疫 苗 ， Ｐ Ｒ Ｖ） 本研 究将 Ｐ ＲＳ ＧＰ Ｒ ｖ ５和
猪繁殖与呼吸综合征病毒E基因重组质粒的免疫效果研究的开题报告

猪繁殖与呼吸综合征病毒E基因重组质粒的免疫效果研究的开题报告

猪繁殖与呼吸综合征病毒E基因重组质粒的免疫效果研究的开题报告一、选题背景及意义猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是一种病毒性疾病，在猪产业中造成了严重的经济损失。

PRRSV主要引起猪的繁殖障碍和呼吸道疾病，严重影响了猪的健康和生产能力。

研发有效的疫苗对于控制PRRSV病毒的传播和流行具有重要意义。

以往的疫苗研发主要采用灭活或弱毒化等方法，但这些方法存在一定的局限性。

基于分子生物学技术，重组质粒疫苗成为了疫苗研发的热门方向之一。

该方法可以将目标抗原的基因插入质粒中，通过基因工程技术，将质粒转化为细胞，从而在机体中产生特异性的免疫反应，提高免疫力。

本研究旨在构建PRRSV E基因重组质粒，并探究其在猪体内产生的免疫反应以及其对PRRSV病毒的抵抗和防御作用，为PRRSV疫苗的研发提供新思路和方法。

二、研究内容和方法1. 构建PRRSV E基因重组质粒选用适当的载体进行DNA序列克隆，将PRRSV E基因的序列插入质粒中，经过转化、筛选等步骤，构建获得PRRSV E基因重组质粒，确保其质量和稳定性。

2. 合成和纯化目标蛋白将重组质粒转化到宿主细胞中，使其在细胞内表达PRRSV E基因，并进行目标蛋白的合成和纯化。

采用SDS-PAGE和Western blotting等方法分析目标蛋白的亚细胞定位和纯度。

3. 猪体内免疫试验选用健康的猪，将纯化后的目标蛋白注射给猪，用ELISA等方法检测猪体内特异性免疫反应的产生和程度。

并且将注射后的猪进行PRRSV病毒的感染，观察猪体内的PRRSV病毒感染程度、病毒排除情况以及免疫效果。

三、预期成果及意义1. 成功构建PRRSV E基因重组质粒，实现目标蛋白的高效表达和纯化。

2. 观察到猪体内针对PRRSV E基因的特异性免疫反应的产生和程度，证明该疫苗具有一定的免疫效果和防御能力。

3. 提供了一种新的PRRSV疫苗研发方法和思路，为猪产业健康和高效发展提供了参考和帮助。

重组质粒pEGFP-N1-Twist的构建、表达及其对SKOV3细胞克隆形成能力的影响

重组质粒pEGFP-N1-Twist的构建、表达及其对SKOV3细胞克隆形成能力的影响

重组质粒pEGFP-N1-Twist的构建、表达及其对SKOV3细胞克隆形成能力的影响尉春艳;张熙;孙学军;彭慧霞;史玉霞;王桂贤【期刊名称】《西安交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2014(035)004【摘要】目的构建含有Twist基因的重组质粒pEGFP-N1-Twist,为进一步研究上皮性卵巢癌的发生及转移机制奠定基础.方法生物合成Twist cDNA基因序列,定向克隆至pEGFP-N1表达载体内,将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞系,用Real-time PCR和Western blot检测Twist基因的表达情况;通过克隆形成实验检测pEGFP-N1-Twist对SKOV3细胞的作用.结果 Twist基因的cDNA已克隆到真核细胞表达载体pEGFP-N1中,将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞后,Twist 基因/蛋白的表达明显上调,转染组较对照组克隆形成明显增加(P＜0.05).结论成功构建了Twist基因的真核表达载体并能在细胞内稳定表达,Twist基因能增强SKOV3细胞的克隆形成能力.【总页数】4页(P447-450)【作者】尉春艳;张熙;孙学军;彭慧霞;史玉霞;王桂贤【作者单位】西安交通大学医学院第二附属医院妇产科,陕西西安710004;西安交通大学医学院第二附属医院神经外科,陕西西安710004;西安交通大学医学院第一附属医院普外科,陕西西安710061;西安交通大学医学院第二附属医院妇产科,陕西西安710004;西安交通大学医学院第二附属医院妇产科,陕西西安710004;西安交通大学医学院第二附属医院妇产科,陕西西安710004【正文语种】中文【中图分类】R711.75【相关文献】1.重组质粒pEGFP-N1-Twist对SKOV3细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响 [J], 尉春艳;张熙;孙学军;彭慧霞;贺赛;王桂贤2.牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70的克隆与原核表达重组质粒的构建 [J], 王轶男;贾立军;薛书江;胡诗悦;钱年超;张守发3.猪白细胞介素18基因的克隆及真核表达重组质粒的构建 [J], 石昂;时庆贺;李新果;王玉国;杨利;李双双;陈陆;王川庆4.牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70的克隆与原核表达重组质粒的构建 [J], 王轶男5.猪ASC及Ub基因的克隆及真核表达重组质粒的构建 [J], 樊钰莹;华思红;王志鹏;孙永科;杨玉艾因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。