高效液相色谱( high performance liquid chromatography, HPLC
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《仪器分析》高效液相色谱法仪器分析是化学分析中的重要分支,是利用各种仪器设备对样品进行分析、测定和监控的科学方法。
高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)作为仪器分析中的一种常用方法,具有快速、高效、灵敏度高等特点,在许多领域得到广泛应用。
高效液相色谱法是基于液相色谱原理发展起来的一种方法,其主要原理是利用色谱柱对样品中的化合物进行分离,再通过检测器对各个化合物进行定量测定。
高效液相色谱法相比传统的液相色谱法,具有流动相流速快、柱温控制稳定、色谱柱填充剂的粒径更小等优点,从而使样品得到更高的分离效果和更好的分辨率。
高效液相色谱法可以应用于多种不同类型的样品分析,例如药物分析、环境分析、食品安全监测等。
以药物分析为例,在药物研发和质量控制中,高效液相色谱法可以用于分析药物的纯度、含量和杂质等指标,从而保证药品的质量和安全性。
而在环境分析方面,高效液相色谱法可以用于检测水、土壤和空气中的有机污染物,为环境保护提供科学依据。
此外,高效液相色谱法还可以用于食品安全监测,检测食品中的农药残留和添加剂等有害物质,保障人民群众的身体健康。
高效液相色谱法的操作相对简单,但是在实际应用中也需要注意一些技巧和注意事项。
首先,需要选择合适的色谱柱和填充剂。
不同的分析目标和样品类型需要选择不同的色谱柱和填充剂,以获得最佳的分离效果和分辨率。
其次,需要合理选择流动相的组成和流速。
流动相的组成和流速会直接影响样品的分离效果和检测结果,因此需要经过调试和优化。
最后,还需要进行准确的定量分析。
在高效液相色谱法中,常用的定量方法包括外标法、内标法和标准曲线法等,可以根据实际情况选择合适的方法进行定量分析。
综上所述,高效液相色谱法是一种快速、高效、灵敏度高的仪器分析方法,具有广泛的应用领域和潜力。
在实际应用中,需要根据具体的分析目标和样品类型选择合适的色谱柱和填充剂,合理选择流动相的组成和流速,并进行准确的定量分析。
第十五章高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography,HPLC 15.1概述高效液相色谱又称为高压液相色谱(High Pressure Liquid Chromatography)、高速液相色谱(High Speed Liquid Chromatography)、高分离度液相色谱(High Resolution Liquid Chromatography)或现代液相色谱(Modern Liquid Chromatography),是在20世纪60年代末期在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上发展起来的一种新型分离分析技术。
由于其适用范围广,分离速度快,灵敏度高,色谱柱可以反复使用,样品用量少,还可以收集被分离的组分,特别是计算机等新技术的引入使其自动化与数据处理能力大大提高,高效液相色谱技术得到飞速发展。
高效液相色谱法和经典液相色谱法在分析原理上基本相同,但由于在技术上采用了新型高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相,而使经典的液相色谱法焕发出新的活力。
经过数十年的发展,高效液相色谱法在分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作自动化等方面,都达到了很高的程度,可以和气相色谱法相媲美,并保持了经典液相色谱对样品通用范围广、可供选择的流动相种类多和便于用作制备色谱等优点。
至今,高效液相色谱法已在生物工程、制药工业、食品行业、环境监测、石油化工等领域获得广泛的应用。
15.1.1与经典液相色谱法比较经典液相色谱法通常使用的固定相是多孔粗粒,装填在大口径长色谱柱(玻璃)管内,流动相是靠重力作用流经色谱柱的,溶质在固定相的传质速度缓慢,柱入口压力低,分析时间长,因此柱效低,分离能力差,难以解决复杂混合物的分离分析;而高效液相色谱法使用的固定相是全多孔微粒,装填在小口径、短不锈钢柱内,流动相是通过高压输液泵进入色谱柱的,溶质在固定相的传质、扩散速度大大加快,柱效可比前者高2~3个数量级,从而在短时间内获得高柱效和高分离能力,可以分离上百个组分。
高效液相色谱方法及应用摘要高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)也叫高压液相色谱(high pressure liquid chromatography)、高速液相色谱(high speed liquid chromatography)、高分离度液相色谱(high resolution liquid chromatography)等。
使用高效液相色谱时,液体待检测物被注入色谱柱,通过压力在固定相中移动,由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同,不同的物质顺序离开色谱柱,通过检测器得到不同的峰信号,最后通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物质。
高效液相色谱作为一种重要的分析方法,广泛的应用于化学和生化分析中。
高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别,它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相,适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。
本文着重以分析赖氨酸铜为例介绍高效液相色谱方法及应用。
关键词:高效液相色谱法的发展历史;特点及应用;赖氨酸螯合铜一、高效液相色谱法的发展历史[1]1960年代,由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性,为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质,气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。
1960年代末科克兰(Kirkland)、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪,开启了高效液相色谱的时代。
高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱,提高色谱柱的塔板数,以高压驱动流动相,使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书,标志着高效液相色谱法(HPLC)正式建立。
在此后的时间里,高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段,在有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。
高效液相色谱(HPLC:High Performance Liquid Chromatography )是化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术,是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可缺少的工具。
国际市场调查表明,高效液相色谱仪在分析仪器销售市场中占有最大的份额,增长速度最快。
高效液相色谱的优点是:检测的分辨率和灵敏度高,分析速度快,重复性好,定量精度高,应用范围广。
适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。
其缺点是:价格昂贵,要用各种填料柱,容量小,分析生物大分子和无机离子困难,流动相消耗大且有毒性的居多。
目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。
一、基本原理固定相流动相AB CCBA固定相——柱内填料,流动相——洗脱剂。
HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同,进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。
通常,按溶质(样品)在两相分离过程的物理化学性质可以作如下的分类:分配色谱:——分配系数亲和色谱:——亲和力吸附色谱:——吸附力离子交换色谱:——离子交换能力凝胶色谱(体积排阻色谱):——分子大小而引起的体积排阻分配色谱又可分为:正相色谱:固定相为极性,流动相为非极性。
反相色谱:固定相为非极性,流动相为极性。
用的最多,约占60~70%。
固定相(柱填料):固定相又分为两类,一类是使用最多的微粒硅胶,另一类是使用较少的高分子微球。
后者的优点是强度大、化学惰性,使用pH范围大,pH=1~14,缺点是柱效较小,常用于离子交换色谱和凝胶色谱。
最常使用的全孔微粒硅胶(3~10μm)是化学键合相硅胶,这种固定相要占所有柱填料的80%。
它是通过化学反应把某种适当的化学官能团(例如各种有机硅烷),键合到硅胶表面上,取代了羟基(-OH)而成。
它是近代高效液相色谱技术中最重要的柱填料类型。
高效液相色谱法原理
高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)是一种常用的分离和分析方法,其原理基于样品中的
化合物在液相流动载体中与固定在填料上的固定相相互作用,并因此在色谱柱上发生不同程度的分配和保留。
在高压下,样品通过色谱柱,各组分依据其与移动相和固定相的相互作用的不同,在柱中以不同速率进行分离。
高效液相色谱法的主要组成部分包括进样器、色谱柱和检测器。
样品首先通过进样器注入到移动相中,然后进入色谱柱。
色谱柱是由一种固定相填充而成的管状结构,固定相表面有一定数目的固定相基团,用于化合物的分离。
移动相则是一种液态溶剂,可以根据需要选用不同的组合,并通过高压泵以一定流速通过色谱柱。
化合物在色谱柱中与固定相发生相互作用,有选择性地被保留或分离。
不同的化合物在色谱柱中的相互作用程度不同,因此它们以不同的速率通过色谱柱。
通过控制柱温、移动相成分、流速和色谱柱填料等条件,可以调节分离效果。
最后,分离的化合物进入检测器进行检测和信号记录。
高效液相色谱法广泛应用于许多领域,包括药物分析、环境监测、食品安全等。
其优点在于对大多数化合物具有良好的分离选择性、灵敏度高、分析速度快、操作简便。
同时,该方法还可以与其他分离技术(如质谱联用)进行联用,以提高分析的灵敏度和准确性。
高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)也叫高压液相色谱(high pressure liquid chromatography)、高速液相色谱(high speed liquid chromatography)、高分离度液相色谱(high resolution liquid chromatography)等。
是在经典液相色谱法的基础上,于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀,小颗粒具有高柱效,但会引起高阻力,需用高压输送流动相,故又称高压液相色谱。
又因分析速度快而称为高速液相色谱。
高效液相色谱是目前应用最多的色谱分析方法,高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成,其整体组成类似于气相色谱,但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。
HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳;进样系统要求进样便利切换严密;由于液体流动相粘度远远高于气体,为了减低柱压高效液相色谱的色谱柱一般比较粗,长度也远小于气相色谱柱。
HPLC应用非常广泛,几乎遍及定量定性分析的各个领域。
使用高效液相色谱时,液体待检测物被注入色谱柱,通过压力在固定相中移动,由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同,不同的物质顺序离开色谱柱,通过检测器得到不同的峰信号,最后通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物质。
高效液相色谱作为一种重要的分析方法,广泛的应用于化学和生化分析中。
高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别,它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相,适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。
发展历史:
1960年代,由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性,为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质,气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。
1960年代末科克兰(Kirkland)、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪,开启了高效液相色谱的时代。
高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱,提高色谱柱的塔板数,以高压驱动流动相,使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书,标志着高效液相色谱法 (HPLC)正式建立。
在此后的时间里,高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段,在有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。
高效液相色谱同时还极大的刺激了固定相材料、检测技术、数据处理技术以及色谱理论的发展。
1960年代前,使用的填充粒大于100μm,提高柱效面临着困境,后来的研究人员便采用微粒固定相来突破着一瓶颈。
科克兰、荷瓦斯制备成功薄壳型固定相,这种在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄壳,实现了高速传质,为高效液相色谱技术的发展奠定了稳固的基础。
随着填料粒径的降低,更高的柱效也得以实现。
1960年代研制出气动放大泵、注射泵及低流量往复式柱塞泵,但后者的脉冲信
号很大,难以满足高效液相色谱的要求。
1970年代,往复式双柱塞恒流泵,解决了这一问题。
1970年代后科克兰制备出全多孔球形硅胶,平均粒径只有7μm,具有极好的柱效,并逐渐取代了无定形微粒硅胶。
之后又制造出的键合固定相使柱的稳定性大为提高,多次使用成为可能。
1970年后,适合分离生物大分子的填料又成为研究的热点。
1980年后,改善分离的选择性成为色谱工作者的主要问题,人们越来越认识到改变流动相的组成事提高选择性的关键。
高效液相色谱的特点:
高压——压力可达150~300 kg/cm2。
色谱柱每米降压为75 kg/cm2以上。
高速——流速为0.1~10.0 mL/min。
高效——塔板数可达5000/米。
在一根柱中同时分离成份可达100种。
高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。
同时消耗样品少。
HPLC与经典液相色谱相比有以下优点:
速度快——通常分析一个样品在15~30 min,有些样品甚至在5 min内即可完成。
分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。
灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng,荧光和电化学检测器可达0.1pg。
色谱柱可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。
样品量少,容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏,可以收集单一组分或做制备。