高效液相色谱( high performance liquid chromatography, HPLC

点是固定液层的耐溶剂冲刷性能差，固 定液易流失，从而导致柱效降低，被键 合相填料所取代。 3．正相色谱-固定液极性 > 流动相极性（NLLC） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱， 适于分离极性组分。 反相色谱-固定液极性 < 流动相极性（RLLC） 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适 于分离非极性组分。
1）硅胶： <>无定型硅胶 最早使用，传质慢、柱效低 <>薄壳型硅胶 直径为30~40μm的玻璃珠表面涂布一层1~2μm 厚的硅胶微粒，孔径均一、渗透性好、传质 快，但柱容量有限。 <>全多孔球型硅胶 粒度一般为5~10μm，颗粒和孔径的均一性都比 前两种好，柱容量大，为当今液固色谱固定相 的主体，也是键合固定相的主要基质。
2．进样系统 a 隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室） >GC系统压力较小，可以 >HPLC系统压力太大，须停泵进样（早期） b 阀进样：不必停泵，六通阀
3．分离系统-色谱柱 >直径4~6mm,柱长10~30cm,多为不锈钢材料 >柱效评价：色谱系统适应性试验 R，n，fs（拖尾因子） >色谱柱维护 >预柱和预饱和柱
（二）反相键合相固定相
1．分离机制：疏溶剂理论 正相——流动相与溶质排斥力强， 作用时间↑， k↑，组分tR↑ 反相——流动相与溶质排斥力弱， 作用时间↓， k↓，组分tR↓

二、HPLC与GC差别
1．分析对象的区别 GC：
适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品； 但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型 及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可 检测。(占有机物的20%)
HPLC： 适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶 液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分 子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测用途广泛。（占有机物 的80%）

《仪器分析》高效液相色谱法仪器分析是化学分析中的重要分支，是利用各种仪器设备对样品进行分析、测定和监控的科学方法。

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）作为仪器分析中的一种常用方法，具有快速、高效、灵敏度高等特点，在许多领域得到广泛应用。

高效液相色谱法是基于液相色谱原理发展起来的一种方法，其主要原理是利用色谱柱对样品中的化合物进行分离，再通过检测器对各个化合物进行定量测定。

高效液相色谱法相比传统的液相色谱法，具有流动相流速快、柱温控制稳定、色谱柱填充剂的粒径更小等优点，从而使样品得到更高的分离效果和更好的分辨率。

高效液相色谱法可以应用于多种不同类型的样品分析，例如药物分析、环境分析、食品安全监测等。

以药物分析为例，在药物研发和质量控制中，高效液相色谱法可以用于分析药物的纯度、含量和杂质等指标，从而保证药品的质量和安全性。

而在环境分析方面，高效液相色谱法可以用于检测水、土壤和空气中的有机污染物，为环境保护提供科学依据。

此外，高效液相色谱法还可以用于食品安全监测，检测食品中的农药残留和添加剂等有害物质，保障人民群众的身体健康。

高效液相色谱法的操作相对简单，但是在实际应用中也需要注意一些技巧和注意事项。

首先，需要选择合适的色谱柱和填充剂。

不同的分析目标和样品类型需要选择不同的色谱柱和填充剂，以获得最佳的分离效果和分辨率。

其次，需要合理选择流动相的组成和流速。

流动相的组成和流速会直接影响样品的分离效果和检测结果，因此需要经过调试和优化。

最后，还需要进行准确的定量分析。

在高效液相色谱法中，常用的定量方法包括外标法、内标法和标准曲线法等，可以根据实际情况选择合适的方法进行定量分析。

综上所述，高效液相色谱法是一种快速、高效、灵敏度高的仪器分析方法，具有广泛的应用领域和潜力。

在实际应用中，需要根据具体的分析目标和样品类型选择合适的色谱柱和填充剂，合理选择流动相的组成和流速，并进行准确的定量分析。

(3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而 高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。 总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱 与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改 进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱 法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重 大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨 基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药 物等物质的分离和分析。 高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作 严格，这是它的主要缺点。
3．流动相
在液液色谱中为了避免固定液的流失。对 流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固 定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越 显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极 性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配 色谱。如果采用流动相的极性小于固定相的极 性，称为正相分配色谱，它适用于极性化合物 的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性 大的后流出。如果采用流动相的极性大于固定 相的极性，称为反相分配色谱。它适用于非极 性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好 相反。
（l）紫外检测器 （2）荧光检测器 (3) 示差折光率检测器
几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此差示折 光检测器是一种通用型检测器。灵敏度可达10-7g· -3。主 cm 要缺点是对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。
（4）电导检测器 (5) 附属系统
它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集 以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱 仪中尤为重要的附属装置 .
柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料 （＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆， 然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱 内，经冲洗后，即可备用。
4．检测系统
在液相色谱中，有两种基本类型的检 测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分 离组分的物理或化学特性有响应，属于这 类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器 等。另一类是总体检测器，它对试样和洗 脱液总的物理或化学性质有响应，属于这 类检测器的有示差折光，电导检测器等。 现将常用的检测器介绍如下:

第十五章高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography，HPLC 15.1概述高效液相色谱又称为高压液相色谱（High Pressure Liquid Chromatography）、高速液相色谱（High Speed Liquid Chromatography）、高分离度液相色谱（High Resolution Liquid Chromatography）或现代液相色谱（Modern Liquid Chromatography），是在20世纪60年代末期在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上发展起来的一种新型分离分析技术。

由于其适用范围广，分离速度快，灵敏度高，色谱柱可以反复使用，样品用量少，还可以收集被分离的组分，特别是计算机等新技术的引入使其自动化与数据处理能力大大提高，高效液相色谱技术得到飞速发展。

高效液相色谱法和经典液相色谱法在分析原理上基本相同，但由于在技术上采用了新型高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，而使经典的液相色谱法焕发出新的活力。

经过数十年的发展，高效液相色谱法在分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作自动化等方面，都达到了很高的程度，可以和气相色谱法相媲美，并保持了经典液相色谱对样品通用范围广、可供选择的流动相种类多和便于用作制备色谱等优点。

至今，高效液相色谱法已在生物工程、制药工业、食品行业、环境监测、石油化工等领域获得广泛的应用。

15.1.1与经典液相色谱法比较经典液相色谱法通常使用的固定相是多孔粗粒，装填在大口径长色谱柱（玻璃）管内，流动相是靠重力作用流经色谱柱的，溶质在固定相的传质速度缓慢，柱入口压力低，分析时间长，因此柱效低，分离能力差，难以解决复杂混合物的分离分析；而高效液相色谱法使用的固定相是全多孔微粒，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相是通过高压输液泵进入色谱柱的，溶质在固定相的传质、扩散速度大大加快，柱效可比前者高2~3个数量级，从而在短时间内获得高柱效和高分离能力，可以分离上百个组分。

流动相的选择原则是： ①样品易溶，且溶解度尽可能大。 ②化学性质稳定，不损坏柱子。 ③不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。 ④粘度低，流动性好。 ⑤易于从其中回收样品。 ⑥无毒或低毒，易于操作。 ⑦易于制成高纯度，即色谱纯。 ⑧废液易处理，不污染环境。
硅胶 ( SiO2•n H2O) ： OH OH —Si—O—Si— ｜ ｜ 重要的键合相是：硅烷化键合相，它是硅胶与有机硅烷反应的产物。 最常用的键合相键型是： ｜ ｜ —Si—O—Si—C ｜ ｜ ｜ R1 ｜ R1 —Si—OH + X—Si—R —Si—O—Si—R + HX ｜ R2 ｜ R2 硅胶 有机硅烷 键合相 X ━ Cl，CH3O，C2H5O等。 R ━ 烷：C8H17（即C8填料），C10H21，C18H37等。 R1 、R2 ━ X、CH3等。
按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以作如下的分类： 分配色谱：—— 分配系数 亲和色谱：—— 亲和力 吸附色谱：—— 吸附力 离子交换色谱：—— 离子交换能力 凝胶色谱（体积排阻色谱）：—— 分子大小而引起的体积排阻
最常用的“万能柱”填料为“C18”，简称“ODS”柱，即十八烷基硅烷键合硅胶填料（Octadecylsilyl，简称ODS）。这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用，它可完成高效液相色谱70～80％的分析任务。由于C18(ODS)是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工作中应用的最为广泛，近年来，为适应氨基酸、小肽等生物分子的分析任务，又发展了CH、C3、C4等短链烷基键合相和大孔硅胶（20～40μm）。 按键合到基质上的官能团可分为： ⑴反相柱：填料为非极性，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、 C8、C4等。 ⑵正相柱：填料为极性，官能团为 －CN氰基、－NH2氨基等。 ⑶离子交换键合相： 阳离子官能团：－SO3H磺酸基、－COOH羧基等。 阴离子官能团：―R4N＋季铵基、-氨基等。 ( 由于硅胶基质的键合相只能在pH＝2～7.5的范围内使用，而离子交换色谱要求有更宽的pH范围，因此其基质现在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯。)

高效液相色谱仪一般可分为四个主要
部分：高压输液系统，进样系统，分离系
统和检测系统。此外还配有辅助装置：如
梯度淋洗，自动进样、馏分收集及数据处
理等。
1、高压输液系统
1 ） 贮 液 器 ： 1-2L 的 玻 璃 瓶 ， 配 有 溶 剂 过 滤 器 (Ni合金)，其孔很小约2 m，可防止颗粒物进
入泵内。 2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通 过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透 过膜从溶剂中除去（气泡会影响检测）。
高效液相色谱法是以液体作为流动相的色谱
法，它是利用样品中各组分在色谱柱中固定相和流 动相相间分配系数或吸附系数的差异，将各组分分 离后进行定性、定量分析。
发展历史
20世纪初，俄国植物学家茨维特提出经典液相色 谱法。
1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的 局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大 分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经 典液相色谱。
（使用较多）
ห้องสมุดไป่ตู้对流量变化敏感的检测器会有噪声
干扰，此时可连接一脉动阻尼器。
◆恒压泵--------压力恒定，但流量不恒定（现在已经较少使用）。
输液泵操作注意事项：
防止固体微粒进入泵体 流动相不应含有腐蚀性物质 防止溶剂瓶内的流动相被用完 不超过规定的最高压力 流动相一般应该先脱气
4）梯度淋洗装置：
3）高压泵
输液泵应具备如下性能：①流量稳定②流量范 围宽③输出压力高，一般应能达到150～300 kg/cm2；④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐蚀。
高压泵按排液性质可分为：恒压型和恒流型。
注射型泵------输出精确，无脉动，需更换溶剂而中断工作。
◆恒流泵

高效液相色谱方法及应用摘要高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）也叫高压液相色谱（high pressure liquid chromatography）、高速液相色谱（high speed liquid chromatography）、高分离度液相色谱（high resolution liquid chromatography）等。

使用高效液相色谱时，液体待检测物被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物质。

高效液相色谱作为一种重要的分析方法，广泛的应用于化学和生化分析中。

高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。

本文着重以分析赖氨酸铜为例介绍高效液相色谱方法及应用。

关键词：高效液相色谱法的发展历史；特点及应用；赖氨酸螯合铜一、高效液相色谱法的发展历史[1]1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。

1960年代末科克兰（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。

高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。

1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法(HPLC)正式建立。

在此后的时间里，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段，在有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。

高效液相色谱（HPLC：High Performance Liquid Chromatography ）是化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术，是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可缺少的工具。

国际市场调查表明，高效液相色谱仪在分析仪器销售市场中占有最大的份额，增长速度最快。

高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。

适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。

其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。

目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。

一、基本原理固定相流动相AB CCBA固定相——柱内填料，流动相——洗脱剂。

HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。

通常，按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以作如下的分类：分配色谱：——分配系数亲和色谱：——亲和力吸附色谱：——吸附力离子交换色谱：——离子交换能力凝胶色谱（体积排阻色谱）：——分子大小而引起的体积排阻分配色谱又可分为：正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。

反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。

用的最多，约占60～70％。

固定相（柱填料）：固定相又分为两类，一类是使用最多的微粒硅胶，另一类是使用较少的高分子微球。

后者的优点是强度大、化学惰性，使用pH范围大，pH=1～14，缺点是柱效较小，常用于离子交换色谱和凝胶色谱。

最常使用的全孔微粒硅胶（3～10μm）是化学键合相硅胶，这种固定相要占所有柱填料的80％。

它是通过化学反应把某种适当的化学官能团（例如各种有机硅烷），键合到硅胶表面上，取代了羟基（－OH）而成。

它是近代高效液相色谱技术中最重要的柱填料类型。

检测器，在灵敏度、选择性 、通用性及化合物的分子量和结构信息的提供等方面都有突出的优点。 但它的昂贵操作费用和复杂性限制了它的推广应用。
应用范围和主要特点
有紫外吸收的物质，大多数有机物都可以检测
梯 度
线性 范围
最小检测 量
紫外-可见
优点：噪声低，对流动相的温度变化不敏感，检测后不破坏样品， 可用于制备。 缺点：紫外吸收大的溶剂不能用做流动相 有紫外吸收的物质，大多数有机物都可以检测 优点：噪声低，对流动相的温度变化不敏感，检测后不破坏样品， 可用于制备。 缺点：紫外吸收大的溶剂不能用做流动相，价格较高 自身发荧光的物质或荧光衍生物 优点：适合生物样品痕量分析 缺点：易受背景荧光、ph值和溶剂影响 几乎所有溶质都可检测 优点：通用性广，没有紫外吸收的物质可以使用 缺点：灵敏度低，对温度敏感 挥发性低于溶剂的样品均可检测 优点：对温度变化不敏感，基线稳定，不依赖样品的光学特性 缺点：价格昂贵，需要载气 具有氧化还原特性的物质 优点：高灵敏度高选择性，离子色谱必备 缺点：对流速温度敏感，不适合有机溶剂体系，干扰较多
3.进样器 3.1 手动进样器 Rheodyne 7725i型 世界各大色谱制造商均选用此品牌，进样次数 可达30000次
3.2 手动进样针
针头为平头，容积以10或20ul最常见 品牌：瑞士hamilton，国产上海高鸽等
3.3 自动进样器
全自动进样，提高进样过程的稳定性，降低劳动强度，可满足几十个甚至上百 个样品的进样需求。有些自动进样器带有控温功能，适合热敏性样品。
5.3 荧光检测器（FLD）：同样属于选择性检测器，其灵敏度在目前常 用的HPLC检测器中是最高的，应用也较多，仅次于UVD。它适用于能 激发荧光的化合物。很多与生命科学有关的物质，如氨基酸、胺类、 维生素、甾族化合物及某些代谢药物都可以用荧光法检测。荧光检测 器在生物样品痕量分析中很有用，尤其在用荧光衍生后，可以检测很 微量的氨基酸和肽。

高效液相色谱法原理
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）是一种常用的分离和分析方法，其原理基于样品中的
化合物在液相流动载体中与固定在填料上的固定相相互作用，并因此在色谱柱上发生不同程度的分配和保留。

在高压下，样品通过色谱柱，各组分依据其与移动相和固定相的相互作用的不同，在柱中以不同速率进行分离。

高效液相色谱法的主要组成部分包括进样器、色谱柱和检测器。

样品首先通过进样器注入到移动相中，然后进入色谱柱。

色谱柱是由一种固定相填充而成的管状结构，固定相表面有一定数目的固定相基团，用于化合物的分离。

移动相则是一种液态溶剂，可以根据需要选用不同的组合，并通过高压泵以一定流速通过色谱柱。

化合物在色谱柱中与固定相发生相互作用，有选择性地被保留或分离。

不同的化合物在色谱柱中的相互作用程度不同，因此它们以不同的速率通过色谱柱。

通过控制柱温、移动相成分、流速和色谱柱填料等条件，可以调节分离效果。

最后，分离的化合物进入检测器进行检测和信号记录。

高效液相色谱法广泛应用于许多领域，包括药物分析、环境监测、食品安全等。

其优点在于对大多数化合物具有良好的分离选择性、灵敏度高、分析速度快、操作简便。

同时，该方法还可以与其他分离技术（如质谱联用）进行联用，以提高分析的灵敏度和准确性。

高效液相色谱法测定
高效液相色谱技术是现代分析检测的重要技术之一，在精确检测、毒理学研究、药物筛选等领域发挥着不可替代的作用。

本文对高效液相色谱技术进行了较为详细的介绍。

高效液相色谱技术（high performance liquid chromatography，简称HPLC）是一种物理化学分离技术，它可以将曲线性或非线性的有机及无机物质以及混合物进行分离。

它主要由一个采样泵、柱状体、温控器以及检测器等组成。

将采样物料通过泵注入导入柱状体，在不同的流速和温度条件下通过各种分离机理的作用及有机阳离子交换分离出组分物质，最后再通过检测器检测并量化比较分离出的物质。

高效液相色谱技术具有较高的分离效率、测定灵敏度，并且使用简单方便，实
用价值很高。

它常用于缺质分析、新药、制药中添加剂的测定等，在药学研究中，运用十分广泛，可用于各种有机物的分离及测定，如药效成分的研究与质量控制，比如，止咳糖浆中的止咳成分及添加剂的测定；山楂糖浆中的有效成分及添加剂的研判等等。

此外，它还被用于分析和研究乳剂、谷物和稻米及饲料中的有机物；用于检测及分析石油、油农副产品和石化产品中各种有机物；用于分离、分析油，水和气中的有机污染物；以及用于检测和分析水中有机物，如腐殖酸等等。

综上，高效液相色谱技术的应用不仅拓宽了我们的实验研究范围，而且使精密
检测变得更加易于实现，对于未来的化学研究具有十分重要的作用。

b. 光电二极管阵列检测器
紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测 特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
c. 示差折光检测器
（differential refractive index detector）
原理：利用样品池溶液折射率的变化以测定流动相中样品的浓度。 溶液的折射率是流动相和样品的折射率乘以各物质的摩尔浓度 之和。因此溶有样品的流动相和纯流动相之间折射率之差，即 反映了流动相中样品的浓度。 除紫外检测器之外应用最多的检测器； 通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）； 灵敏度低、对温度敏感、对流速的波动敏感， 不能用于梯度洗脱； 分为偏转式、反射式和干涉型三种；
在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。 一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分 的物理或化学特性有响应，属于这类检测 器的有紫外、荧光、电化学检测器等。 另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液 总的物理或化学性质有响应，属于这类检 测器的有示差折光，电导检测器等。
a. 紫外检测器
应用最广，对大部分有机化合物有响应。
原理：基于被分析试样对特定波长紫外或可见光的选择 性吸 收，试样浓度与吸光度的关系，服从朗伯 －比 耳定律。
特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm × 10mm ，容积 8μL）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 只对样品组分有响应，而对 流动相基本没有响应， 对可用于梯度洗脱。
一、液-固吸附色谱
二、液-液分配色谱 三、离子交换色谱 四、离子色谱
ion chromatograph liquid-solid adsorption chromatograph liquid- liquid partition chromatograph

⏹高效液相色谱High Performance Liquid Chromatography型号：Agilent 1100生产厂家：美国安捷伦四元梯度泵：流速范围：0.001～10.00ml/min,可以以0.001ml/min为增量；流速精度：≤0.15%RSD；适用pH范围：1.0～12.5；操作压力：0～40MPa。

检测器●光电二极管阵列检测器：波长范围：190～950nm；光源：氘灯和汞灯；波长准确度：≤1nm；光谱分辨率：1.2nm。

●荧光检测器：光源：氙灯；水的拉曼光谱：≥400；激发波长：200～700nm；发射波长：280～900nm；波长重现性：±0.25nm；波长准确度：±3nm；流通池：8uL。

●示差折光检测器：RI范围：1.00～1.75 RIU；温度控制：5～55°C；基线噪音：±1.5×10-9RIU；漂移：≤±2.0×10-7RIU/hr。

在有机化学、生化、医学、药物临床、化工、食品卫生、环保监测、商检和法检等方面都有广泛的应用，可以从一些复杂的混合物中排除干扰物质，并分析其中微量成分。

放置地点：实验楼114负责人：王晴联系电话：55191648⏹全自动不锈钢发酵罐Automatic Stainless Steel Fermenter型号：L1523生产厂家：瑞士比欧微生物发酵工业是一个重要的工业部门，其产品广泛应用于医药、食品、化工、环境等领域，发酵罐是发酵工业的核心设备。

L1523型发酵罐是瑞士比欧公司生产的实验室专用发酵罐，采用原位灭菌方式，配备有pH、溶氧、温度、消泡电极和专用控制器，可实现参数设定、显示和发酵过程全自动控制，运行稳定、参数采集方便可靠。

该设备适用于微生物好氧发酵和细胞培养的小型试验和科学研究。

罐体：玻璃罐体，12.8升总体积，8.6升工作体积。

驱动：交流变频马达，转速范围100~1500转/分。

液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定 液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性 （反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的 游离羟基上。反相键合相色谱柱最常用的就是ODS柱，也就是C18柱。
流动相
• 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度 H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇 ＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃
• 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序 正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇
液相色谱图相关术语(1)
• 色谱图相关术语:
–色谱峰(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生 的响应信号的微分曲线
–峰底(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线 –峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距离 –峰宽(Peak Width):在峰两侧拐点处所作切线与峰
◆ 荧光检测器（FLD） 原理：某些溶质在紫外光激发后能发射可见光（荧光）的性质检测。 特点：选择性检测器、灵敏度高（10-12g）、对流量和温度敏感性低。
检测器简介（三）
◆ 蒸发光散射检测器（ELSD） 原理：通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。
色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气 （氮气）喷成雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流 动相不断蒸发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微 小颗粒，被载气载带通过检测器。在检测器中，光 被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量。 特点：消除了溶剂的干扰，不受温度变化影响，灵敏 度高，是通用型检测器。

在目前已知的有机化合物中,
若事先不 进行化学改性, 只有20%的化合物用气 相色谱可以得到较好的分离, 而80% 的 有机化合物则需HPLC 分析。目前, HPLC 在有机化学、生化、医学、药物 临床、化工、食品卫生、环保监测、商 检和法检等方面都有广泛的用途, 而在 生物和高分子试样的分离和分析中更是 独领风骚。
高效液相色谱（high
performance liquid chromatography, HPLC）也叫高压液相色谱 （high pressure liquid chromatography）、 高速液相色谱（high speed liquid chromatography）、高分离度液相色谱（high resolution liquid chromatography）等。使用 高效液相色谱时，液体待检测物被注入色谱柱， 通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物 质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离 开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后 通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物 质。
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1971年科克兰等人出版了《液相色谱的
现代实践》一书，标志着高效液相色谱 法（HPLC）正式建立。在此后的时间 里，高效液相色谱成为最为常用的分离 和检测手段，高效液相色谱同时还极大 的刺激了固定相材料、检测技术、数据 处理技术以及色谱理论的发展。
1960年代前，使用的填充粒大于100μm，
尚可
可
可
可
可
可
分析鉴定
分析灵敏度
可
低
可
低
否
-
否
-
可
高
可
高
可
高
（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度， 防止产生沉淀并在柱中沉积。 （4）流动相同时还应满足检测器的要求。 当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外 吸收。

高效液相色谱使用方法高效液相色谱使用方法⒈简介⑴色谱技术概述高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种基于物质在固定相和流动相之间分配行为的色谱分离技术。

它广泛应用于药物分析、食品检测、环境监测等领域。

⑵仪器设备在进行高效液相色谱分析之前，需要准备好以下仪器设备：●高效液相色谱仪●进样器●色谱柱●柱温箱●检测器●数据处理系统⒉样品制备在进行高效液相色谱分析之前，必须进行样品制备。

样品制备的方法根据具体领域和分析目的的不同而有所差异。

常见的样品制备方法包括：●样品浸提：通过浸提操作从固体样品中提取分析物质，并将其溶解到适当的溶剂中。

●样品过滤：将样品中的不溶物或杂质去除，使样品更纯净。

●样品稀释：根据样品的浓度情况，选择合适的溶剂将样品稀释到适当的浓度范围内。

⒊方法优化在进行高效液相色谱分析之前，应对方法进行优化，以获得更准确、灵敏的分析结果。

方法优化的主要步骤包括：●流动相优化：选择合适的流动相组成，使分析物质在色谱柱中得到良好的分离。

●色谱柱优化：选择合适的色谱柱，以满足分析要求，如色谱柱的选择应考虑分析物质的特性和目标分离效果。

●进样量优化：确定适当的进样量，以保证在检测器中能够获得合适的信号。

⒋实验操作步骤⑴仪器准备●打开高效液相色谱仪和相关仪器设备的电源。

●检查仪器连接情况，确保各仪器之间的连接正常。

●准备好所需的溶剂和试剂，并验证其质量。

⑵色谱条件设置●设置流动相的组成和流速。

●选择适当的柱温。

●配置适当的检测器参数，如波长、灵敏度等。

⑶样品进样●将样品溶液注入到进样器中。

●设置进样器的参数，如进样量、进样模式等。

●冲洗进样器，使其准备好下一次进样。

⑷数据采集与处理●打开数据处理系统，并设置合适的参数，如采集时间、信号积分方式等。

●开始进行数据采集。

⒌结果解释与分析根据采集到的数据，进行结果解释和分析。

根据对样品的分析目的，对结果进行合理解释，并得出相应的结论。

高效液相色谱法 （high performance liquid
chromatography HPLC）
2019/5/9
一、HPLC 与GC的比较 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别
1．分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%
2019/5/9
2019/5/9
（七）、 亲和色谱(AC)
Affinity chromatography
原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性 亲和力，进行选择性分离。
先在载体表面键合上一 种具有一般反应性能的所 谓间隔臂(环氧、联胺等)， 再连接上配基(酶、抗原等) ，这种固载化的配基将只 能和具有亲和力特性吸附 的生物大分子作用而被保 留。改变淋洗液后洗脱。
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（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
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201HBr
2019/5/9
离子色谱的优点
（1）分析速度快
可在数分钟内完成一 个试样的分析； （2）分离能力高
在适宜的条件下，可使 常见的各种阴离子混合物 分离；例：使用双柱法， 在十几分钟内，可使七种 阴离子完全分离。
（3）分离混合阴离子的最有效方法 （4）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱