下载文档原格式
大鼠深静脉血栓模型深静脉血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）是一种严重威胁人类健康的常见周围血管疾病，因其与日益增高的发病率及诸多的并发症引起了全球的广泛关注。
DVT常形成于下肢或骨盆部位深处的静脉，若形成的血栓不稳定脱落后可引起肺栓塞（pulmonaryembolism，PE），死亡率较高。
DVT和PE二者合称静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism，VTE)，全球每年发病率约为0.1%。
据统计，90%以上的 PE 患者来源于深静脉血栓，全世界每年死于PE者超过 500 万。
1.实验动物SPF级Wistar大鼠，健康，雄性，体重为180g~200gWistar Rats(SPF class), healthy, male, body weight 180g~200g2.实验分组实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。
3.实验周期14d4.建模方法1.术前一晚禁食，自由饮水。
2.称量大鼠，腹腔注射水合氯醛（15%）350mg/kg麻醉，腹部正中剃毛后用碘酒及酒精擦拭手术区域。
3. 沿腹白线切开腹腔，钝性分离下腔静脉，用 5- 0 缝线线在肾静脉下方结扎下腔静脉和其主要分支，再用 5-0 缝线缝合内层，3-0缝线缝合外层，将大鼠置于加热垫维持肛温在37±0.5℃。
4. 待大鼠苏醒后自由饮水，正常饲养。
5.模型的评价1. 下肢肿胀观察：于造模处理1d时，肉眼观察大鼠下肢是否发生肿胀。
2. 术后7d时，肺部进行Micro CT检测，观察肺栓塞发生情况及严重程度。
3. 细胞因子的检测：血清中vWF、ICAM-1等细胞因子的表达显著升高，可以用ELISA 法检测。
图1 造模后下腔静脉形成的血栓图2 肺部Micro CT检测结果图。
左图是正常对照组大鼠，右图是模型组大鼠，显示DVT模型后的大鼠肺部的密度显著高于对照组，这表明DVT大鼠的肺部存在显著水肿、血栓。
深静脉血栓形成动物模型的建立方法及其进展作者：张侠陵熊国祚来源：《中外医疗》 2015年第6期张侠陵熊国祚南华大学第二附属医院，湖南衡阳 421000[摘要] 下肢深静脉血栓形成(deep vein thrombosis of lower extremity，DVT)作为血管外科的常见疾病，其动物模型的建立是研究疾病的发病机制和治疗方法的重要条件。
该文对近年来对于各种实验性深静脉血栓动物模型的方法及其利弊进行概述，为今后动物实验提供充足的参考依据。
[关键词] 深静脉血栓形成；动物模型；DVT[中图分类号] R725[文献标识码] A[文章编号] 1674-074２（２０１5）02（c）－０197-02随着医疗水平的进步，深静脉血栓形成因其高发病率、高致死率逐渐受到临床医生的重视。
目前对其病因的研究仍处于假设阶段。
动物模型为研究DVT的发病机制和评价对应的治疗方法提供了可能，迄今用于深静脉血栓动物模型约有50年的历史，现将各主流方法报道如下。
1 下腔静脉结扎法1.1 大鼠模型此为最经典的模型,1980年Reyers等[1]通过结扎大鼠下腔静脉第一次建立起深静脉血栓动物模型：将大鼠麻醉后，沿腹白线进腹，分离出下腔静脉，于左肾静脉下方结扎其下腔静脉，缝合后2~6 h打开腹腔，可见血栓形成。
此方法结扎后3 h约60%~80%的小鼠可形成血栓，6 h后血栓形成率可达100%。
在对于药物在体内抑制血栓形成的研究中，此法有广泛的应用。
也有学者在Reyers的方法的基础上做出许多改进，如张智辉等同时结扎下腔静脉和髂总静脉，建立的大鼠深静脉血栓模型,证明白细胞在DVT形成中起重要作用。
并将各种改良法进行比较，证实采用缩窄下腔静脉+阻断夹阻断+结扎肾静脉至髂静脉水平的下腔静脉各属支的方法，可以建立起稳定的大鼠DVT疾病模型[2]。
赛力克·马高维亚等[3]在备制大鼠深静脉血栓模型时，将普通交换导丝放置于左肾静脉与下腔静脉汇合处下方，与下腔静脉一并结扎，1 h后抽出导丝。
弥散性血管内凝血动物模型制作具体步骤及方法弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation, DIC)是临床上一种获得性综合征，它可由各种不同的原因引发。
临床上DIC主要表现为由微血管血栓形成和栓塞引起的多脏器功能障碍、出血、休克和微血管病性溶血性贫血。
DIC代表了临床病理的一系列连续的严重表现，其主要特征是血管内凝血机制激活后，其局限性或代偿性控制进行性丧失。
DIC的发生及发展机制十分复杂，许多影响因素至今仍未阐明。
无论在何种原发病或何种因素诱导下发生DIC，机体凝血系统活化均既存在顺序性级联反应的特征，也存在正、负反馈使凝血反应放大或受到限制的特征。
DIC时通常显示纤维蛋白分布在多种器官中，是导致器官功能衰竭的原因。
抗凝治疗是阻断DIC病理过程的重要措施之一，其目的在于抑制广泛性微血栓形成的病理过程，防止血小板及各种凝血因子进一步消耗。
为恢复其正常含量、重建正常的凝血与抗凝血平衡创造条件。
因此，建立理想的DIC动物模型，用于实验研究非常重要。
1高分子右旋糖酐诱导大鼠弥散性血管内凝血模型(1)复制方法体重为250～400g、10月龄雄性Wistar大鼠。
按30mg/kg体重的剂量经腹腔注射戊丨巴丨比丨妥丨钠麻醉，大鼠仰卧固定于手术台上，颈部皮肤常规消毒与去毛。
无菌手术暴露颈动脉、静脉，分别插管。
用130g/L高分子右旋糖酐(分子量为480000)按15ml/kg体重的剂量经颈静脉注射，1min或3min注完。
于给药*min 及给药后10、20、30min进行微循环观察，经显微电视录像观察回肠下段肠系膜血管(包括一二级微动脉和一二级微静脉)流态以及微血流流态、血细胞聚集情况；给药后30min时，经模型大鼠颈动脉取血作相关凝血功能指标的检测，并进行血浆鱼精蛋白副凝试验(3R试验)；主要观察指标：模型大鼠微循环积分值、全血黏度、血浆黏度、相对黏度、血小板黏附率和聚集率、血小板计数、血浆凝血酶原时间、纤维蛋白原水平、裂体细胞检查。
家兔微血栓栓塞中风模型的建立及应用王维亭;于冰;赵专友;汤立达【摘要】目的研究脑血栓模型的建立及应用.方法采用微血栓经颈内动脉栓塞兔大脑中动脉的方法 ,建立微血栓栓塞中风模型并观察应用巴曲酶的效果.结果微栓子量达到(0.63±0.57)mg时可使一半动物出现中风症状,模型科学、可靠.巴曲酶0.5 Bu/kg治疗后6 h能明显提高致半数卒中微栓子量(ES50),1.0 BU/kg作用更明显,治疗后6 h及24 h ES50分别提高了2.2倍、1.8倍;巴曲酶1.0 BU/kg给药后1 h可使组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)含量明显增加,较模型对照组增加了23.25%;巴曲酶0.5 BU/kg及1.0 BU/kg给药后可使纤维蛋白原(Fbg)含量明显降低,以给药后6 h最明显;巴曲酶0.5 BU/kg及1.0 BU/kg给药后对脑出血类型及出血率无明显影响.结论采用微血栓经颈内动脉栓塞大脑中动脉形成微血栓栓塞中风模型,方法成功,药物评价结果可靠.【期刊名称】《中国药业》【年(卷),期】2010(019)005【总页数】3页(P15-17)【关键词】兔;动物模型;微血栓;脑栓塞;巴曲酶【作者】王维亭;于冰;赵专友;汤立达【作者单位】天津药物研究院药效动力学重点实验室,天津,300193;天津药物研究院药效动力学重点实验室,天津,300193;天津药物研究院药效动力学重点实验室,天津,300193;天津药物研究院药效动力学重点实验室,天津,300193【正文语种】中文【中图分类】R965.1脑卒中发病率高、后果严重，是死亡与致残的最主要疾病之一。
随着对脑梗死治疗的研究进展，逐渐认识到了多功能、多作用靶点治疗药物对于临床预后的优越性，尤其是兼具溶栓、降纤、血小板聚集抑制等多功能的药物，但目前对该类药物的研发尚缺乏合理的、有针对性的实验模型。
本试验建立了一种可用于多功能药物药效学评价的新的微血栓栓塞中风模型，该模型适用于亚急性或慢性试验，并通过巴曲酶验证了其应用的可行性。
弥漫性血管内凝血症（兔）动物模型制作血液必须在凝固和纤溶两方面保持动态平衡的基础上流动。
所谓的弥漫性血管内血液凝血症（DIC）是这种平衡受到破坏而偏向了凝固，全身微小血管发生了栓塞凝固的疾病。
和红色血栓和白色血栓相比，本病是全身的血液凝固系统的生理功能发生亢进引起的，血栓以血纤维蛋白为主，出现于全身的细小血管，伴随凝固亢进纤溶也被活化，也会引起严重的出血。
本病多发生于细菌感染（特别是革兰阴性菌内毒素血症）、常位胎盘的早期剥离、死胎稽留、重度外伤、恶性肿瘤、大型手术及不适当的输血等。
发病率没有年龄和性别的差异，预后受原发病的影响，颅内出血和肾功能不全是直接致死的原因。
目前对弥漫性血管内凝血症的研究主要是：①凝固纤溶系统和阻抑凝固的纤溶因子的作用机制。
②血栓的形成和脏器损伤的形态表现。
③原发病和本病的因果关系。
④治疗方法。
关于凝固纤溶系统，积有较多的研究资料。
不同的病例所表现出的结果不一致，即使是同一病例，不同时期的表现也有明显差异。
在病理形态学方面，有人报道了血栓的全身分布情况和由此引起的出血和梗塞表现。
最近有人想要采用组织学和组织化学的方法去观察体内血栓的自然转归及其治疗修复的情况。
关于原发病和本病之间的关系，目前倾向于把容易引起本病的疾病和直接诱因相区别。
在治疗方面应以治疗原发病为主，如使用抗凝剂、抗纤溶剂和血栓溶解剂等。
这些药物的用法和用量尚无定论，同样是今后研究的课题之一。
一、模型制作研究中常使用动物来再现和人相同的原发病，如内毒素毒血症、死胎稽留病等。
其中最常用的方法是，对使用内毒素造成动物的全身性Schwatzman反应，这是皮肤的一种局部组织反应，即将肠伤寒菌的培养液注入家兔的体内，24 h后静脉注射相同液体，则在皮内注射部位出现出血和坏死。
通过这种实验方法，能够得到极类似于人的广泛性血管内血液凝固症的动物模型。
可用这个模型来观察各脏器（尤其是肾脏）的形态学变化、凝固纤溶性变化及对网状内皮系统的作用。
局灶性脑缺血动物模型制作步骤及方法大脑中动脉(Middle cerebral artery, MCA)是人类脑卒中的多发部位，大脑中动脉闭塞(Middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型被普遍认为是局灶性脑缺血的标准动物模型，主要方法有线栓法、电凝法、光化学法和血栓栓塞法。
1线栓法(thread occlusion of the middle cerebral artery)(1)复制方法雄性SD大鼠，体重为250～300g。
经腹腔注射水合氯醛(350～400mg/kg体重的剂量)或戊丨巴丨比丨妥丨钠(50～60mg/kg体重的剂量)麻醉，仰卧位固定，剃除颈部毛发，手术区域皮肤常规消毒。
切开右侧颈部皮肤，钝性分离胸锁乳突肌和胸骨舌骨肌，显露右侧OCA及迷走神经。
结扎CCA、颈外动脉(exterial cerebral artery, ECA)及其分支动脉。
分离右侧颈内动脉(interial cerebral artery, ICA)，至鼓泡处可见其颅外分支翼腭动脉，于根部结扎该分支。
在ICA 近端备线、远端放置动脉夹，在ECA结扎点(距颈内、颈外动脉分叉5mm处)剪一小口，将一直径为0.22～0.249mm(4-0号)的尼龙线经ECA上剪口插入。
插入前加热处理使插入端变钝(也可在尼龙线头端用L-多聚赖氨酸涂抹后置肝素中浸泡，使成功率增高，梗塞面积恒定)，并做好进入线长度标记。
扎紧备线，松开动脉夹，将尼龙线经ECA、ICA分叉处送入ICA，向前进入17～19mm时会有阻挡感，说明栓线已穿过MCA，到达大脑前动脉的起始部，堵塞MCA开口，造成脑组织局部缺血。
1～3h后可缓慢退出尼龙线实施再灌注。
(2)模型特点线栓法的优点为：无须开颅，动物损伤小，MCA闭塞效果较为理想，目前该模型被认为是惟一能观察到再灌流的局灶性脑缺血模型，近年来较为常用。
注意点：线选择极为重要，较细时不容易穿到MCA，且缺血不明显；较粗时缺血重，容易造成实验动物的死亡。
《大鼠门静脉血栓模型构建和血栓动态观察》篇一大鼠门静脉血栓模型构建与血栓动态观察一、引言近年来，血管血栓类疾病已经逐渐成为一种高发的临床病症，对其病因及病程机制的研究已经成为众多科研人员的重点研究对象。
本实验的目的在于通过大鼠门静脉血栓模型的构建，进一步观察血栓的动态变化过程，以期为血栓类疾病的预防和治疗提供更为准确的实验依据。
二、材料与方法1. 材料实验所需材料包括：健康大鼠、手术器械、生理盐水、凝血酶、肝素等。
2. 方法（1）动物模型的建立：选用健康大鼠，在无菌环境下进行手术操作，制造门静脉部分闭塞的条件，模拟形成血栓模型。
（2）动态观察：使用特定方法在建模后的不同时间段对大鼠门静脉内血栓的形成和发展过程进行实时动态观察和记录。
三、模型构建及结果1. 模型构建手术操作时需细致操作，严格无菌环境处理，模拟真实条件下血栓的形成条件，同时做好标记以便进行后续观察。
术后使用合适的药物治疗控制动物的恢复状况。
2. 结果分析经过精心手术和恢复治疗后的大鼠表现出较为稳定的状态，成功地建立了门静脉血栓模型。
随后在不同时间节点进行了连续的观察，对实验数据进行详细的记录和统计，如对门静脉血流情况、血栓的大小及生长情况等进行全面的描述和比较。
四、血栓动态观察在成功构建大鼠门静脉血栓模型后，我们使用特定方法对血栓的动态变化进行了详细的观察和记录。
主要包括以下几个方面：1. 血栓的形态变化：随着时间的变化，我们观察到血栓的形态在不断发生变化。
开始时可能以一个小型的、容易溶解的软块为主，但随着时间的推移，软块会逐渐固化，颜色逐渐加深。
这种变化符合临床上对血管血栓生长变化的认知。
2. 血流的影响：门静脉的堵塞使得其内血液流速发生明显的变化。
在血栓形成初期，血液流速会明显减慢，随着血栓的逐渐增大和固化，血液流速会进一步降低甚至出现完全堵塞的情况。
这一过程与人体内血管血栓形成的过程相似。
3. 血栓的扩散：通过连续的观察和记录，我们还发现门静脉内的血栓会随着时间的发展逐渐扩散到其他血管中，这一过程也与临床上的血管栓塞现象相吻合。
血栓动物模型的建立首都医科大学病理解剖学教研室 刘 瑜3 董小黎 正常情况下,血液之所以能在血循环内呈液体状态,是由于机体存在着相互拮抗的凝血和抗凝血系统。
由于物理、化学、创伤、感染、免疫和代谢等因素造成凝血和抗凝血系统的功能紊乱,可导致血栓形成。
血栓形成涉及心血管内皮、血流状态和凝血反应3方面的改变[1]。
首先,血管内皮受损是血栓形成最重要的因素,内皮细胞损伤后,内皮下胶原纤维暴露,与血小板膜相互作用使得血小板活化。
各种不同的黏附蛋白分子如血管性血友病因子(vWF)和纤黏蛋白(FN)可富集在损伤区域。
其中vWF主要由血管内皮细胞合成,是血小板在基质或血管基底膜的主要黏附蛋白。
vWF可与血小板膜糖蛋白G p Ib/Ⅸ复合物结合,也可与活化血小板膜上的整和素αⅡbβ3结合。
它也含有与胶原和内膜下基质内糖胺聚糖的结构域,因此它通过架桥作用,促进血小板黏附,启动凝血过程,导致血栓形成。
其次,血流缓慢或有涡流时,血小板进入边流,黏附于内膜的可能性大为增加,同时凝血因子也容易在局部堆积和活化而启动凝血过程。
涡流产生的离心力和血流缓慢,都会损伤内皮细胞,使其产生的内皮细胞合成前列腺环素(P GI2)和组织型血浆素原活化因子(t PA)等物质减少,从而抗血小板凝集、抗凝血和降解纤维蛋白的能力降低,也是导致血栓形成的原因。
另外,血液的高凝状态如DIC、手术、创伤、妊娠等引起的血液凝固性增高是血栓形成的又一原因。
这3种条件往往合并存在,但常以某一条件为主。
由于血栓性疾病的巨大危害性,对于血栓形成机制、血栓的诊断和抗血栓药的研究便显得尤为重要,因此建立简单、快速、价格低廉而实用的动物血栓模型对于血栓性疾病的研究是十分必要的。
本文对近年来较为常用的一些血栓动物模型加以介绍。
1 物理损伤法1.1 机械损伤法[2]原理:刮匙搔刮损伤血管内膜,使内皮下细胞外基质(ECM)裸露,促使血小板与ECM(主要是胶原纤维)接触而被激活和黏附。
门静脉血栓动物模型的建立和应用刘壮1，2，陈纪宏1，3，祁兴顺1，许向波1，诸葛宇征41 北部战区总医院消化内科，沈阳 1108402 中国医科大学研究生院，沈阳 1101223 大连医科大学研究生院，辽宁大连 1160444 南京大学医学院附属鼓楼医院消化内科，南京 210008通信作者：祁兴顺，******************（ORCID： 0000-0002-9448-6739）摘要：门静脉血栓（PVT）是指在肝外门静脉主干和/或肝内门静脉分支内发生的血栓栓塞。
PVT是由多种因素共同作用的结果，但其发病机制尚未完全阐明。
建立动物模型是研究PVT病理生理机制的重要方法。
本文根据不同的动物种类，对现有PVT动物模型的建立方法、原理、优缺点和应用情况进行综述。
关键词：门静脉血栓；疾病模型，动物；发病机制基金项目：国家自然科学基金（8227034094）Establishment and application of animal models for portal vein thrombosisLIU Zhuang1，2，CHEN Jihong1，3，QI Xingshun1，XU Xiangbo1，ZHUGE Yuzheng4.（1. Department of Gastroenterology，General Hospital of Northern Theater Command， Shenyang 110840， China； 2. Graduate School of China Medical University， Shenyang 110122，China； 3. Graduate School， Dalian Medical University， Dalian， Liaoning 116044， China； 4. Department of Gastroenterology， Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School， Nanjing 210008， China）Corresponding author： QI Xingshun，******************（ORCID： 0000-0002-9448-6739）Abstract：Portal vein thrombosis （PVT）refers to thromboembolism that occurs in the extrahepatic main portal vein and/or intrahepatic portal vein branches. PVT is the result of the combined effect of multiple factors， but its pathogenesis remains unclear. Animal models are an important method for exploring the pathophysiological mechanism of PVT. Based on the different species of animals，this article reviews the existing animal models of PVT in terms of modeling methods，principles，advantages and disadvantages， and application.Key words：Portal Vein Thrombosis； Disease Models， Animal； PathogenesisResearch funding：National Natural Science Foundation of China （8227034094）门静脉血栓（portal vein thrombosis，PVT）形成是指在肝外门静脉主干和/或肝内门静脉分支内发生的血栓栓塞［1］。
血栓动物模型的建立首都医科大学病理解剖学教研室 刘 瑜3 董小黎 正常情况下,血液之所以能在血循环内呈液体状态,是由于机体存在着相互拮抗的凝血和抗凝血系统。
由于物理、化学、创伤、感染、免疫和代谢等因素造成凝血和抗凝血系统的功能紊乱,可导致血栓形成。
血栓形成涉及心血管内皮、血流状态和凝血反应3方面的改变[1]。
首先,血管内皮受损是血栓形成最重要的因素,内皮细胞损伤后,内皮下胶原纤维暴露,与血小板膜相互作用使得血小板活化。
各种不同的黏附蛋白分子如血管性血友病因子(vWF)和纤黏蛋白(FN)可富集在损伤区域。
其中vWF主要由血管内皮细胞合成,是血小板在基质或血管基底膜的主要黏附蛋白。
vWF可与血小板膜糖蛋白G p Ib/Ⅸ复合物结合,也可与活化血小板膜上的整和素αⅡbβ3结合。
它也含有与胶原和内膜下基质内糖胺聚糖的结构域,因此它通过架桥作用,促进血小板黏附,启动凝血过程,导致血栓形成。
其次,血流缓慢或有涡流时,血小板进入边流,黏附于内膜的可能性大为增加,同时凝血因子也容易在局部堆积和活化而启动凝血过程。
涡流产生的离心力和血流缓慢,都会损伤内皮细胞,使其产生的内皮细胞合成前列腺环素(P GI2)和组织型血浆素原活化因子(t PA)等物质减少,从而抗血小板凝集、抗凝血和降解纤维蛋白的能力降低,也是导致血栓形成的原因。
另外,血液的高凝状态如DIC、手术、创伤、妊娠等引起的血液凝固性增高是血栓形成的又一原因。
这3种条件往往合并存在,但常以某一条件为主。
由于血栓性疾病的巨大危害性,对于血栓形成机制、血栓的诊断和抗血栓药的研究便显得尤为重要,因此建立简单、快速、价格低廉而实用的动物血栓模型对于血栓性疾病的研究是十分必要的。
本文对近年来较为常用的一些血栓动物模型加以介绍。
1 物理损伤法1.1 机械损伤法[2]原理:刮匙搔刮损伤血管内膜,使内皮下细胞外基质(ECM)裸露,促使血小板与ECM(主要是胶原纤维)接触而被激活和黏附。
同时裸露的胶原纤维激活Ⅻ因子以及损伤的内皮细胞释放出组织因子,启动了内源性和外源性凝血过程,导致血栓形成。
步骤:麻醉家兔后,分离其股深动脉,选择直径为1mm的股深动脉血管段,用微型血管夹夹住上下两端,使其中间留有1.5cm长的血管段为手术部位。
在实体镜下,用7号针头从血管段上端沿血管向下刺入血管段内并顺势注入生理盐水冲净血管内的血液,后抽出针头,再用6号微型刮匙沿刺破孔送入血管内,反复搔刮血管内膜。
搔刮深度以0.5～0.7cm为宜。
搔刮面积尽可能大些,以刮出少量血管内膜为宜。
稍等片刻,轻轻松动血管段远端血管夹,使血液充盈血管。
待刺孔不渗血时,取下血管段两端血管夹(不能自行止血时可用0号无损伤线缝合刺破孔一针)。
触摸家兔膝内侧皮下支动脉搏动示血管已通畅。
然后逐层缝合,关闭皮肤切口。
评价:此法依据血栓形成基本原理,在动物体内形成血栓,方法简便、易行,成功率100%,术后24h即开始有血栓形成,也可用于制备静脉血栓模型。
主要适用于:1)动态观察血栓形成过程中血栓形态及血栓变化规律的研究。
2)评价药物溶栓作用的实验研究。
3)与形成和溶解血栓有关的其他实验研究。
1.2 股动脉异物法[3]原理:股动脉内放置螺旋钢丝线圈,造成动脉内膜损伤,局部血流动力学改变,激活凝血系2002年 9月第23卷 第3期首都医科大学学报Journal of Capital University of Medical SciencesSep.2002Vol.23 No.3收稿日期:2001211214北京市卫生局基金资助课题 3首都医科大学2000级硕士研究生统,促血小板凝集、释放一系列活性物质,致血栓形成。
步骤:麻醉雄犬后,分离其股动脉约7cm,从股动脉远心端向近心端方向安插自制单股螺旋钢丝(直径0.5cm,长度1.5cm),进入血管内腔后,行血管缝合术,再用医用生物黏合胶黏合。
去动脉夹,确定血管再通充盈和手术视野无渗血,逐层缝合,术毕。
评价:此法可靠易行,重复性好,血栓由血小板、白细胞及纤维蛋白构成。
目前多用于血栓放射免疫显像方面的研究。
1.3 电流损伤法[4]原理:1.5mA直流电刺激颈动脉壁可使血管损伤,血管内膜变得粗糙不平,引起血小板黏附聚集及释放一系列活性物质,激活内源性凝血系统,同时受损内膜释放的组织凝血活素可激活外源性凝血系统,于是动脉管腔内逐渐形成肉眼可见的混合血栓。
步骤:麻醉大鼠后,颈部正中切口,剥离其右侧颈总动脉约15mm长,用小块塑料布遮盖伤口附近的组织,防止组织温度影响血管壁表面温度及刺激电极与周围组织接触。
刺激电极由2根直径为1.3mm,间距1.7mm的不锈钢棒组成,把刺激电极和温度探子钩于动脉内膜上。
电流用1.5mA,刺激时间为7min。
当血栓阻断血流后,远心端动脉温度骤降,记录从电刺激开始到温度骤降所需时间,称堵塞时间(occlusion time,O T),即为血栓形成时间。
评价:一般认为,动脉血栓产生的决定因素是内皮损伤及高切率血流(如狭窄),在高切率区血栓成分以血小板为主,而低切率区以纤维蛋白和红细胞为主[5]。
静脉血栓产生的决定因素是内皮损伤,血液淤积呈高凝状态,血栓主要成分是纤维蛋白、红细胞和少量的血小板及白细胞[6]。
此实验中形成的血栓成分在电刺激区以血小板及纤维蛋白为主,有少量红细胞及白细胞,而在电刺激远端以纤维蛋白及红细胞为主,所以1.5mA直流电刺激动脉壁形成的血栓在形态结构上与人类动脉血栓相似,有较好的可比性,适用于抗血栓形成药物的筛选,抑制血栓形成的药物能延长O T值。
此模型操作简单,但受动物年龄、环境温度等的影响较大,标准差较大,因而应用时有一定局限性。
1.4 结扎法[7,8]原理:粗丝线结扎下腔静脉,引起局部血流淤滞、缺氧,导致血管内皮细胞损伤,启动内源性凝血系统。
此外,黏聚的血小板与局部形成的凝血因子也因血流受阻停留在局部,致使血栓形成。
步骤:麻醉大鼠后,开腹,分离其下腔静脉,于左肾静脉下方用粗丝线结扎下腔静脉,缝合腹壁,结扎2～6h重新打开腹腔,在结扎线下方2cm处夹闭血管,剖开管腔,取出血栓,60℃烘干后称量血栓质量,以血栓质量或血栓形成百分率为指标。
评价:一般在结扎后2h血栓形成率约为60%～80%,此时处死动物主要观察血栓形成百分率。
6h后血栓形成率为100%,此时应观察血栓质量。
此方法多用于判定溶栓药物的体内抗血栓作用。
2 化学损伤法2.1 胰蛋白酶血栓形成法[9,10]原理:胰蛋白酶具有蛋白水解作用,使血管内膜和部分肌层脱落,血小板黏附、聚集,致血栓形成。
步骤:麻醉家兔后,暴露右侧颈总动脉约2.5cm,用显微外科动脉夹夹住近心端和远心端,两端分别插入8号针头,于针头进入部位结扎血管,两结扎线相距1.5cm,经近心端针头用输液泵匀速(0.6mL/min)灌注1.0%胰蛋白酶15min。
随后以相同速度灌注生理盐水冲洗,灌注液经远心端排出,拔出针头并用无创伤性针线缝合针孔,打开动脉夹使血流复通。
评价:所形成的血栓富含血小板和纤维蛋白,类似于临床上动脉血栓的形成。
方法可靠,重复性好。
用于抗血栓药物的筛选和研究。
2.2 过氧化氢(H2O2)血栓形成法[11]原理:过氧化氢损伤血管内膜,引起血小板黏附聚集,致血栓形成。
步骤:家兔局麻后,分离其一侧颈总动脉,872首都医科大学学报第23卷以2个动脉夹夹闭此动脉,夹间距离约2.5 cm,用4号针头刺入动脉并固定,迅速抽出动脉段内残留血液,并以生理盐水反复冲洗3～4次至动脉段内无残血。
然后以10%H2O2溶液0.4mL分4～5次注入动脉段内连续作用10 min,再以生理盐水冲洗2～3次后,用黏合胶黏合针孔,放开血流。
评价:所形成的血栓以白色血栓为主,符合动脉血栓的特征,可以用来探索防止血栓形成的方法。
2.3 角叉菜胶血栓形成法[12]原理:角叉菜胶是从海藻中提取的含硫酸多糖物质[13],是一种较强的致炎物质,其诱发的尾动脉局部血栓与血管内炎症密切相关,炎症时释放的大量炎症介质,如白介素21、肿瘤坏死因子等可破坏正常内皮细胞维持凝血与纤溶之间的平衡作用,从而促发血栓形成;此外,内皮细胞损伤时舒血管物质如乙酰胆碱等分泌减少,缩血管物质如内皮素等增多,使局部血管痉挛,加重局部血管缺血缺氧状况,进一步促进血栓形成及血管内皮损伤。
步骤:昆明种雄性小鼠或SD雄性大鼠,角叉菜胶用生理盐水配制成0.1%和1%,皮下注射。
小鼠注射部位在腰背部,大鼠为后肢足跖部。
注射3～14h后,多数动物尾尖部出现暗红色血栓形成区,并逐渐向尾根部扩大。
48～72h后局部从发绀变为黑色,随后尾部干细断落。
评价:24h实验动物尾部小静脉和毛细血管内含有大量纤维素和少量白细胞及血小板,血管内皮细胞核浓缩呈骰子状,血管内壁中性粒细胞靠边。
72h可见较大血管呈炎症改变,伴有混合性血栓形成。
由于血栓发生在尾部,界限明显,可从体表观察血栓形成出现的时间与发展过程,测量其波及的范围或长度,可为研究体内血栓形成全过程提供一个简便、直观的动物模型。
2.4 三氯化铁(FeCl3)血栓形成法[14,15]原理:铁离子侵入血管壁造成血管内膜损伤,血小板黏附聚集,血栓形成。
步骤:大鼠麻醉后侧卧固定,自眼眦和外耳道中线处剪一切口,暴露及除去颧弓,再暴露颞前窝及鳞状骨大部分,然后在颧弓和鳞状骨前联合的前下方约2mm处钻孔,开一约2mm 直径的小颅窗,暴露大脑中动脉,置一小片塑料薄膜保护血管周围组织。
将吸有50%三氯化铁(FeCl3)溶液10μL的小片滤纸敷在该段大脑中动脉上20min,共敷2次后去掉滤纸。
再用生理盐水冲洗局部组织,逐层缝合。
评价:方法简单、可靠,重复性好,形成的动脉血栓成分为血小板、红细胞及纤维蛋白等,为混合血栓。
而且此方法仍保留有大脑中动脉,可进行血管观察,较接近于临床,且此模型既能反映抗栓药又能反映溶栓药的药效,用已知的抗栓药物阿司匹林和溶栓药物尿激酶均验证了这一点。
该模型还可以利用TTC染色技术直观地观察脑梗死程度。
其不足之处是动物的颧弓被去除,影响动物进食,不利于作长期观察等,此法还有待改进。
2.5 光化学法[16]原理:利用虎红B(四碘四氯荧光素钠)在单色绿光下产生并释放单态氧,使血管内皮细胞膜上的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应,不仅使细胞膜的通透性改变,Ca2+内流增加,而且脂质过氧化物增加可破坏前列环素(P GI2)与血栓素B2(TX B2)的平衡,促进血小板聚集与黏附,激活凝血过程,形成血栓并进一步阻塞血管导致缺血;同时凝血过程中产生大量血管活性物质及神经毒性物质,破坏脑细胞尤其是血2脑脊液屏障,与人类脑梗死发生极为相似。
步骤:麻醉大鼠后,经左侧颞部入路,于左眼外眦和左耳外耳道连线上近眼外眦1/3处作一垂直的长约2cm的弧形切口,分离颞肌,去除颧弓,用拉钩拉开下颌关节,在卵圆孔前上方用牙科钻作一直径为5mm的骨窗,切开硬脑膜即可见大脑中动脉(MCA),选择MCA的近端(起始部)和从嗅束至大脑下静脉间的一段MCA为光照部位,自制L G2150B冷光源的光纤端口距离MCA表面血管约5mm,将光纤所射出的光束垂直对准MCA,光照分2步,首先将光纤移至MCA起始部,经股静脉注入1.5%972 第3期刘 瑜等:血栓动物模型的建立虎红B(2mL/kg)5min后,持续光照10min,然后将光纤移到嗅束至大脑下静脉段MCA血管表面,再注入半量虎红B,仍持续照射10 min,至此血栓模型制作完毕。
