血游离DNA检测及肿瘤的基因诊断_文献综述_

󰀁综述和综合

血游离DNA检测及肿瘤的基因诊断

(文献综述)

(上海第二医科大学附属新华医院普外科,上海󰀁200092󰀁蒋蓓琦综述󰀁张一楚审校)

提要󰀁肿瘤病人血中有异常升高的游离肿瘤DNA,用分子生物学方法检测病人血游离DNA中肿瘤相关基因的异常表达,是无创伤性诊断肿瘤的新方法。关键词󰀁血游离DNA肿瘤󰀁基因诊断中图分类号:Q812󰀁文献标识码:A󰀁文章编号:1000-6877(2001)02-0065-03󰀁󰀁随着分子生物学的迅速发展,人们对肿瘤的认识已经发展到基因水平,并发现了许多肿瘤相关基因。检测这些基因序列或表达情况的改变,日益成为临床医生诊断肿瘤、分析预后的一种重要的辅助手段。近年的研究发现,从肿瘤病人血(血浆或血清)含有的游离DNA中,可以检测到多种肿瘤相关的异常基因,是一种无创伤性肿瘤诊断的新方法。痰液、尿液、粪便、胰液和胆汁中仅含有肿瘤原发灶来源的异常DNA,对这些分泌物进行基因检测仅能反应原发灶的情况。而血游离DNA来源于全身各处,用这种方法,即能早期诊断肿瘤,也能及时发现根治术后肿瘤的局部复发或远处转移,因而具有良好的临床应用前景(1)。1.肿瘤病人血中存在大量游离DNA60年代,首次在红斑狼疮(SLE)患者血浆中发现了游离DNA及其抗体,进一步研究表明,其他病理状态下的患者(如风湿性关节炎、肾小球肾炎、肝炎、胰腺炎、胆囊炎及其他消化道炎症)血中也有游离DNA。用更为敏感的检测手段发现,正常人血清和血浆中约有10~30ng/ml微量DNA(2)。Leon等(3)用放射免疫技术检测了173个不同种肿瘤病人和55个正常人的血清DNA含量,平均浓度分别是180ng/ml和13ng/ml。肿瘤病人的血游离DNA水平与肿瘤大小、部位无关,但有转移者明显增高。接受放疗的病人,血清DNA水平明显下降可达90%,特别是淋巴瘤、肺癌、卵巢癌、宫体癌和宫颈癌,而血清DNA水平持续偏高或上升者往往对放疗无反应。Shapiro等(4)又比较了一组消化道良、恶性疾病患者的血浆DNA水平,分别是118󰀁14ng/ml和412󰀁63ng/ml,统计学上有显著差异,良性疾病中仅胰腺假性囊肿瘤人的血浆DNA水平异常升高,与胰腺癌病人无统计学差异。2.肿瘤患者的血游离DNA来源于肿瘤细胞正常人的血游离DNA来源于淋巴细胞,而肿瘤病人的血游离DNA主要来源于肿瘤细胞。实验表明,肿瘤病人血游离DNA带有明显的肿瘤细胞DNA的生物学特征,即DNA链稳定性下降,表现为体外加入致癌物后,较正常细胞的DNA,肿瘤DNA合成速度加快,增色效应明显等(2)。另外,在肿瘤病人血游离DNA中可以检测到肿瘤相关基因的异常,如K-ras、p53基因的突变、p16高甲基化、微卫星不稳定(m-icrosatelliteinstability,MSI)杂合性缺失(lossofhet-erozygosity,LOH)等。肿瘤组织和脱落入血的游离肿瘤细胞(微转移)均可以直接向血中释放DNA,但是定量分析表明,血中游离DNA的含量远大于游离肿瘤细胞的DNA总量,所以血游离肿瘤DNA主要来源是肿瘤组织本身释放入血,而非血中游离的肿瘤细胞。体外实验证实,坏死或凋亡的肿瘤细胞可以向外释放DNA,而增生活跃的肿瘤细胞亦能通过某种机制向自动向外释放新合成的DNA,但这三种途径中,哪一种占主要地位,目前尚无定论,需更多的研究加以阐明(2)。另外,据最近的一些体内、外实验提示,细胞外游离的肿瘤DNA也有转染󰀁65󰀁2001年第28卷第2期正常细胞的可能性,但还没有证据证明已转染的细胞发生了恶变或形成肿瘤转移灶,所以肿瘤病人血游离肿瘤DNA能否引起转移尚进一步研究(5)。3.血游离肿瘤DNA的定性检测及其临床应用由于血游离DNA定量检测缺乏足够的敏感性和特异性而难以应用于肿瘤的临床诊断(1),目前大多数学者更着眼于研究血游离DNA中的肿瘤异常基因序列及其临床价值(6)。对于常规方法诊断困难的肿瘤,如胰腺癌、胆管癌,用血游离肿瘤DNA检测可以代替活检或剖腹探查。PCR方法敏感、准确,选择特异性好的癌基因,可能在亚临床期及时发现肿瘤及其复发或转移;选择与肿瘤进程相关的癌基因,则可作为肿瘤患者分型分期、分析预后的指标。血浆或血清中的DNA均可做为PCR模板,但有作者认为,虽然血清DNA较血浆DNA量多、质纯,但是很易降解而降低异常基因检测的阳性率,且血凝固时血细胞裂解可向血清中释放正常DNA,从而有可能干扰微卫星序列的检测结果。3.1胰腺癌󰀁75%~90%胰腺癌组织中可累及K-ras突变。1994年,用RFLP-PCR技术,Sorenson等(7)首次报道了在3个胰腺癌患者的肿瘤和血浆中检测到了K-ras突变。随后,Yamada等(8)检测了21个胰腺癌患者的肿瘤和血清DNA,有K-ras突变者分别为71%(15/21)和42%(9/21)。血清阳性者往往瘤体偏大,手术不易根治,预后不良,但与性别、年龄、肿瘤病理类型、侵润方式和转移无关。其中67%患者术后血清DNAK-ras突变消失,持续阳性者经随访有早期复发或肿瘤无法根治而呈进展趋势。Mulcahy等(9)也检测了一组胰腺癌患者的血浆DNAK-ras变突,阳性率达81%(17/21),其中4个病人是早于临床诊断前5~14个月就检测到血浆K-ras突变。Theodor等(10)把血清K-ras突变与CA19-9做联合检测,将胰腺癌的诊断率分别从70%和65%提高到了95%。以上研究均未在慢性胰腺炎患者和正常对照组的血游离DNA中检测到的K-ras突变,而Castells等(11)报告在5%(2/37)慢性胰腺炎患者血清DNA检测到K-ras突变,且这2人随访9个月未发展成胰腺癌。所以,关于K-ras突变在胰腺癌中的诊断价值仍需更广泛的研究。3.2结肠癌󰀁目前已报道的用于结肠癌的血游离DNA的癌基因检测的有:K-ras、p53突变和一系列微卫星不稳定序列。在39个有转移或手术无法切除的结肠癌患者中,Kopreski等(12)报道,血清或血浆K-ras突变的检出率为39%,与患者性别、肿瘤原发灶及转移部位、接受化疗和手术到采血时间长短无关。另一组结肠癌患者中,血浆K-ras突变的检出率为43%(6/14),A-D期的均有(13)。Hibi等(14)在21%(7/33)的结肠癌患者血浆中检测到p53突变,包括DukesB期,这与Mayall的结论一致(15)。Kolble等(16)选取了用9个位点的微卫星序列(D1S243,D5S82,D8S264,D15S127,D17D796,D17S1813,D18S70,D12S1689,D15S129)作为肿瘤标志物进行血游离DNA检测,在结肠癌患者肿瘤组织和血清中至少一个位点呈MSI或LOH分别为96%和59%,经统计,这些位点的异常与肿瘤分期和临床预后无关。但是,Hibi等(14)所选用的8个位点(D18S55,D18S58,D18S61,D18S69,D17S786,D8S133,D8S254,CHRNB1),虽然肿瘤组织呈MSI或LOH有80%,但却没有在对应的血清中检测到相应的异常。3.3肺癌󰀁Anker等(17)首次报道在21个小细胞性肺癌(SCLC)患者的肿瘤组织和血浆DNA中有微卫星序列改变的有76%(16/21)和71%(15/21)。在非小细胞性肺癌(NSCLC)的研究中,Sozzi等(18)仅用2个微卫星序列(D21S1245和FIHT位点)在87个󰀁~󰀁期NSCLC患者肿瘤组织和血浆中检测到MSI和LOH的达56%(49/87)和40%(35/87),血浆阳性者包括43%(17/40)󰀁期的肺癌患者和45%(9/20)肿瘤直径󰀁2cm的患者。Sanchez-Cespedes等(19)用第3条染色体长臂3p上的4个微卫星序列(D3S1038,D3S1611,D3S1067,D3S1284)检测22个行根治术的󰀁~󰀁a期NSCLC患者的血清DNA,28%(6/22)的血清中有微卫星序列的异常,其中包括1个󰀁期患者。DNA甲基化异常同样可作为肿瘤标记物用于血游离肿瘤DNA的检测。用甲基化特异性PCR法,Es-teller等(20)检测了22个NSCLC患者p16、死亡相关蛋白激酶(DAPK)、GSTP1和DNA修复基因O0-甲酰鸟苷-DNA-甲基转移酶的甲基化程度,肿瘤和血清中至少一个基因有异常高甲基化的分别为68%(15/22)和50%(11/22),各期患者均有血清阳性者,表明血清异常DNA可发生于肿瘤的早期而有利于早期诊断。3.4头颈部肿瘤、肝癌󰀁同样用以上p16、DAPK等4个基因,检测到一组头颈部肿瘤患者的瘤组织中有异常高甲基化的占55%(52/95),其中42%(21/50)患者在血清中能检出到相应异常(21)。另据报道,80%肝癌组织可累及p16的异常高甲基化,Wong等(22)在一组肝癌患者的肿瘤组织和血清/血浆中检测p16高甲基化,阳性率分别为73%(16/22)和55%(13/22)。正常对照组、慢性肝炎和肝硬化患者血游离DNA中则未󰀁66󰀁国外医学外科学分册检测到p16异常。3.5乳腺癌󰀁在乳腺癌患者的血游离肿瘤DNA的研究中,有选用p53突变、p16甲基化和不同的微卫星序列作为肿瘤分子标志物进行单独和联合检测,联合检测能较大地提高诊断的敏感性和特异性。Chen等(23)将62个乳腺癌患者分成3组,用不同的微卫星序列检测血浆和血清中肿瘤DNA,筛选出了敏感性较高的微卫星序列组合,将血游离肿瘤DNA检出率从15%提高到48%。而Silver等(24)联合检测了p53突变、p16甲基化和6个微卫星序列(D17S855、D17S654、D16S421、TH2、D10S197、D9S161),90%(56/62)的肿瘤组织至少累及一个位点的异常,66%(41/62)患者的血浆DNA中有相应的异常。比较血浆DNA异常和正常的两组患者,在临床分期、肿瘤血管浸润、淋巴结转移、浸润性导管癌发生率及K-i67阳性率上均有统计学上差异。3.6肾癌、卵巢癌󰀁Goessl等(25)在40个肾癌患者血浆中检测第3条染色体长臂3p上的4个微卫星位点(D3S1307,D3S1289,D3S1560,D3S1300),至少一个位点呈现LOH的为63%(25/40),35%有一个以上位点的LOH,MSI则仅在一个患者的血浆DNA检测到。正常对照组的血浆中未检测到这些位点异常。Hickey等(26)用6个微卫星序列在85%(17/20)的卵巢癌患者的血清中检测到MSI或/和LOH,其中包括3个󰀁a期的患者,占󰀁a期的患者50%,但8个正常人对照中有1个也检测到微卫星序列异常。4.小结与展望以上一系列的研究已清楚表明,在肿瘤病人的血清或血浆中的确存在游离的肿瘤DNA。检测肿瘤相关的异常基因序列,能够一定程度上诊断肿瘤。目前从血清或血浆中所检测的癌基因或异常序列,大多与临床分期、病理学参数、淋巴结转移及远处转移无关,也有些报道认为,K-ras突变对胰腺癌,p53、K-ras对结肠癌,DAK-激酶对头颈部肿瘤与临床分期有关。因各研究刚起步,缺乏长期随访的统计资料,也无法判断血游离肿瘤DNA的异常情况与预后的关系。血游离肿瘤DNA的检测的应用前景,最终还需依赖于对肿瘤分子生物学更深入的研究,以筛选出各种肿瘤特异性和敏感性较好的基因谱来提高血液学诊断率及早期诊断率。另外,也许更有临床意义和应用价值,医生可以通过这种无创伤性的检查,判断患者的治疗效果及分析预后,并在随访中,有可能在患者缺乏体症和常规检查阴性的情况下,及时发现肿瘤局部复发或远处转移,最终提高肿瘤的治愈率和延长患者的生存期。同时,着眼于癌前病变和早期肿瘤与血游离异常DNA的关系的研究,也将有助于明确这种检测手段在肿瘤的普查和诊断中的作用。

参󰀁考󰀁文󰀁献1.MulcahyH,etal.Lancet1996;348(9028):628.󰀁2.AnkerP,etal.CancerMetastasisRev1999;18(1):65-73.󰀁3.LeonSA,etal.CancerRes1977;37(3):646-650.󰀁4.ShapiroB,etal.Cancer1983;51(11):2116-2120.󰀁5.Garcia-OlmoD,etal.HistolHistopathol1999;14(4):1159-1164.󰀁6.Fleis-chhackerM.EurJMedRes1999;22:4(11)488-490.󰀁7.SorensonGD,etal.CancerEpidBiomarkersPrevention1994;3:67-71.󰀁8.YamadaT,etal.ClinCancerRes1998;4(6):1527-1532.󰀁9.Mulc-ahyHE,etal.ClinCancerRes1998;4(2):271-275.󰀁10.TheodorL,etal.DigDisSci1999;44(10):2014-2019.󰀁11.CastellsA,etal.ClinOncol1999;17(2):578-584.󰀁12.KopreskiMS,etal.BrJCan-cer1997;76(10):1293-1299.13.AnkerP,etal.Gastroenterology1997112(4):1114-1120.󰀁14.HibiK,etal.CancerRes1998;58(7):1405-1407.󰀁15.MayallF,etal.JClinPathol1998;51(8):611-613.󰀁16.KolbleK,etal.LabInvest1999;79(9):1145-1150.󰀁17.ChenXQ,etal.NatMed1996;2(9):1033-1035.18.SozziG,etal.ClinCancerRes1999;5(10):2689-2692.󰀁19.Sanchez-CespedesM,etal.AnnOncol1998;9(1):113-116.󰀁20.EstellerM,etal.CancerRes1999;59(1):67-70.󰀁21.Sanchez-CespedesM,etal.CancerRes2000;15;60(4):892-895.󰀁22.WongIH,etal.CancerRes1999;59(1):71-73.󰀁23.ChenX,etal.ClinCancerRes1999;5(9):2297-2303.󰀁24.SilvaJM,etal.CancerRes1999;59(13):3251-3256.󰀁25.GoesslC,etal.CancerRes1998;58(20):4728-4232.󰀁26.HickeyKP,etal.BrJCancer1999;80(11):1803-1808.󰀁67󰀁2001年第28卷第2期