伊文思蓝(EB)检测血脑屏障(BBB)通透性

低频超声开放大鼠血脑屏障的研究张震;夏春义;薛一雪;刘云会【期刊名称】《解剖科学进展》【年(卷),期】2007(13)4【摘要】目的探讨1MHz低频超声在不同功率、不同照射时间对大鼠脑细胞及血脑屏障的影响,寻求开放血脑屏障的最佳条件。

方法119只Wistar大鼠颅顶右前方开窗后超声照射,采用伊文思蓝(EB)法检测血脑屏障通透性的变化;应用透射电镜观察内皮细胞紧密连接的变化。

结果1MHz、12mW照射20s或30s,照射后3hrs,血脑屏障通透性均显著高于对照组(P<0.05),电镜下微血管内皮紧密连接呈开放状态,照射时间30s时,可见部分神经元核膜变形;照射后12hrs,与对照组相比血脑屏障通透性无明显差异(P<0.05),且部分神经元核膜的变形无明显恢复。

1MHz、8mW照射的各组与对照组比较血脑屏障通透性无明显差异(P<0.05)。

结论1MHz、12mW、照射时间20s可能是可逆性地开放血脑屏障的适宜条件。

【总页数】3页(P343-345)【关键词】低频超声;血脑屏障;通透性【作者】张震;夏春义;薛一雪;刘云会【作者单位】中国医科大学一院急诊科;中国医科大学二院神经外科;中国医科大学神经生物学教研室【正文语种】中文【中图分类】Q189;R338【相关文献】1.低频聚焦超声联合微泡开放大鼠血脑屏障的时间参数对比研究 [J], 陈芸;蔡有利;王峰;石宇;鲁树坤2.低频超声破坏微泡造影剂开放血脑屏障的实验研究 [J], 童林艳;胡长林;王志刚;冉海涛3.低频聚焦超声联合sonovue靶向开放小鼠血脑屏障的实验研究 [J], 蒋文军;谢明星;杨亚利;丁尚伟4.经颅低频聚焦超声联合微泡在开放血脑屏障中的研究进展 [J], 张留影;徐璇;陈茉弦;敖丽娟5.经颅低频聚焦超声联合微泡在开放血脑屏障中的研究进展 [J], 张留影;徐璇;陈茉弦;敖丽娟;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

睡眠剥夺动物模型具体方法及详细步骤原型物种人
来源物理单平台（倒置花盆平台）形成的睡眠碎片化
模式动物品系SPF级Balb/c 小鼠，健康，雄性。

实验分组实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组。

实验周期4-6 weeks
建模方法老年小鼠，将小鼠置于水池中的倒置花盆平台（直径2.5cm）上，该花盆被充满水的树脂玻璃室包围，可自由获取食物和水。

水温保持在30±1℃。

其中水位仅为表面下3cm。

时间为48~72h。

应用n/a
1.Morris水迷宫试验检测小鼠学习记忆能力
定位航行实验：小鼠连续接受5天的训练，每天4次，每次时间间隔30min，记录下小鼠从4个入水点和入水并找到平台所需要的时间，即逃避潜伏期。

4次潜伏期的平均成绩作为当日的最终结果进入到最后统计。

空间探索实验：实验的第6天，撤去平台，从距离平台的最远端入水后，将小鼠放入水中，记录下30s内小鼠的游泳轨迹，并观察分析小鼠在目标象限的停留时间，以及它的穿越平台的次数。

2.伊文思蓝(EB)检测血脑屏障(BBB)通透性
2% EB染料（4ml/kg）经小鼠尾静脉注射。

3h后待染料充分经过血循环后，用0.2ml戊巴比妥钠腹腔注射，并用50ml生理盐水通过左心室进行灌注后取全脑。

将全脑浸于1ml甲酰胺。

样品于37℃孵育2h后，甲酰胺混悬液经420000*g 离心20min，测量全脑在632nm的吸光度。

EB染料含量根据甲酰胺内EB的标准曲线计算（0~4μg/ml）。

免疫组织化学检测：取含海马体的全脑组织，石蜡包埋，每只切三片后做GFAP的免疫组化，对切片进行全景扫描。

Evans Blue资料检索一、Evans Blue使用原理伊文思蓝（evans blue，EB）是一种生物染料，经静脉注射后很快与血浆清蛋白结合，用EB外渗作为血浆蛋白外渗指标，可观察皮肤蓝色外渗的部位和范围。

以往的研究表明内脏病变在相应脊髓节段的皮肤引起神经源性炎性反应，而穴位处体表的神经源性炎性反应伴随着局部血管通透性的改变可导致EB渗出点的出现，因而在进行了穴位与内在相关联系的神经机制一系列实验后，认为神经源性炎性反应（以EB渗出反映）可作为经脉显示的标志。

[3]二、Evans Blue的使用方法1、使用5%的Evans Blue( SIGMA) 溶液(0．9%氯化钠溶液配制)，按50 mg /kg剂量在大鼠尾静脉注射[6]成功标准为注射后大鼠眼睛即刻变蓝。

[1]2、腹部脱毛后，在鼠板上标记大鼠头、耳根、尾根的位置，将大鼠以仰卧位固定于鼠板上的同一位置，分别拍摄造模后5、10、15、20、25h的大鼠腹部图像。

拍摄照片要求:采用脑立体定位仪的三维支架，标定拍摄高度为25cm，造模后4h拍照。

[3]三、Evans Blue的观测指标及方法1、经纬网格计数法：①构建经纬网格:大鼠腹部照片构建以５ｍｍ×５ｍｍ为计数单位距离的经纬网格，该坐标系构建以胸骨上缘中点为原点，以腹部正中线及其垂直线为坐标轴（纵轴上至胸骨上缘，下至耻骨联合水平）②渗出点计数：（1）目标渗出点应隐于皮下，而在表皮且呈片状渗出或色泽鲜艳者乃表皮损伤所致，为假阳性点，需排除。

（2）无ＥＢ渗出点记为０；１个ＥＢ渗出点完整地出现在１个网格内，将其记为１；若１个渗出点横跨２个及以上网格时，则以“记上不记下，记右不记左”为计数原则将其记录。

（3）肋弓下缘为网格Ｌ，对Ｌ１—Ｖ１６网格内ＥＢ渗出点个数逐一进行记录，并将数据输入ＳＰＳＳ２２．０软件中（见图２）。

③统计学方法（1）聚类分析选取聚类树状图结果中分层级别最高且又独立的若干个坐标点，即“特征网格”（2）轮廓分析判定“特征网格”的渗出点数与不同芥子油浓度、时间的关系。

当归多糖对脑梗死大鼠血脑屏障通透性影响及MRI评价夏旺旭;徐露【摘要】目的研究当归多糖对脑梗死大鼠血脑屏障(BBB)通透性影响及MRI评价.方法采用线栓法制作大鼠脑梗死模型,采用伊文斯蓝(EB)法检测BBB的通透性,Western blot测定紧密连接蛋白Claudin-5、ZO-1的表达,MRI法检测梗死体积.结果大鼠脑梗死24 h后,当归多糖组缺血侧脑组织EB含量显著低于模型组(P＜0.01);当归多糖治疗组缺血侧脑组织Claudin-5及ZO-1表达显著高于模型组(P＜0.01);且当归多糖组梗死面积显著低于模型组(P＜0.01).结论当归多糖能降低脑梗死大鼠BBB通透性,与Claudin-5及ZO-1表达上调密切相关,从而减少脑梗死体积.【期刊名称】《遵义医学院学报》【年(卷),期】2014(037)006【总页数】4页(P601-604)【关键词】当归多糖;BBB;MRI【作者】夏旺旭;徐露【作者单位】重庆市长寿区人民医院放射科,重庆 400012;重庆医科大学生化与分子药理学重点实验室,重庆400016【正文语种】中文【中图分类】R285.5脑梗死是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病，其在老年人群体中发病率和致死率较高，严重威胁着广大老年人的健康，并给家庭和社会带来巨大的经济负担。

脑梗死后神经细胞代谢紊乱，血脑屏障 (blood-brain barrier，BBB)发生破坏，使得通透性增加，发生脑水肿[1]。

已有研究表明BBB的破坏将加重脑组织的缺血损伤[2]。

当归多糖(Angelica polysaccharide)是伞形科植物当归(Angelica sinensis)的主要有效成分，具有促进血液循环、抗炎及增强免疫力等作用。

由于当归多糖在神经系统的研究较少，而其活血化瘀作用在脑梗死等疾病中有重要的意义，因此本研究利用大鼠MCAO模型，检测大鼠脑梗死24 h后，当归多糖对脑梗死大鼠BBB及Claudin-5和ZO-1变化，并进行MRI评价。

仅供科研版本号：170707伊文思蓝染色液(0.5%)【产品组成】【保存条件】4℃，避光，6个月【产品概述】伊文思蓝(Evans Blue)又称偶氮蓝，分子式C34H24N6Na4O14S4，分子量为960.80，CAS号为314-13-6。

伊文思蓝属于一种常用的偶氮染料制剂，因其分子量大小不血浆白蛋白相近，而且在血液中不血浆白蛋白有很高的亲和力，因此在神经科学研究中常被用于示踪观察血脑屏障(BBB)的完整性，也用于细胞染色区分活细胞、死细胞，亦可测定血容量。

伊文思蓝作临床药物用于测定血浆和血容量，也可作动脉插管的定位。

正常情况下血浆白蛋白无法透过血脑屏障，所以染色后如果神经系统血脑屏障完整，不血浆白蛋白结合的依文思蓝无法使其着色。

相反，如果神经系统血脑屏障被破坏，依文思蓝就可以进入神经系统并使其着色。

在荧光波长470nm、540nm处有强峰，680 nm处有弱峰。

可以使用化学透析法和比色法进行检测。

伊文思蓝不台盼蓝都是细胞活性染料，常用于检测细胞膜的完整性和细胞是否存活。

活细胞不会被染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。

伊文思蓝染色后，通过显微镜下直接计数或显微镜下拍照后计数，就可以对细胞存活率进行比较精确的定量，其中0.5%为最常用的浓度。

活细胞因有外排功能而无法被伊文思蓝染色，因此可以通过此方法在显微镜下区分死细胞不活细胞，但无法区分死亡不坏死。

【使用方法】(一)血脑屏障通透性1、取处理后的实验动物(以小鼠为例)，静脉注射Evans Blue Stain (0.5%)数秒至1分钟内，小鼠眼睛、皮肤出现蓝色。

0.5～1h后处死小鼠，取目的脑组织。

2、脑组织置于1.5ml离心管中，加入1ml PBS，迅速用组织匀浆器将脑组织制成匀浆1000g离心15min。

3、取上清，加入等量三氯乙酸，4℃孵育18～24h。

该步骤亦可采用如下操作: 取上清，按上清:丙酮=3:7比例加入丙酮，室温孵育24h。

4、1000g离心20～30 min或2000g离心15min。

脑缺血再灌注论文：脑缺血再灌注乌司他丁基质金属蛋白酶9 血脑屏障明胶酶谱【中文摘要】背景与脑梗死是危害人类健康的常见病、多发病,以病死率、致残率和复发率高为特点,给社会、家庭及个人带来了严重的经济与精神负担,因此积极寻找有效的治疗措施成为当前研究重点。

为挽救缺血半暗带内损伤较轻的脑组织,及早溶栓重新恢复缺血组织灌注给脑梗死患者带来了希望,但同时也带来了更严重的再灌注损伤问题。

目前研究认为血脑屏障(BBB)通透性在脑缺血再灌注损伤的病理生理过程中起重要作用。

血脑屏障位于脑实质和其供血血管之间,由毛细血管内皮细胞及其之间的紧密连接、连续的基底膜和基底膜外侧的星形胶质细胞终足构成。

血管基底膜由细胞外基质分子(ECM)组成,对维持BBB的完整性起重要作用,而ECM正是基质金属蛋白酶(MMPs)的主要作用底物。

近年来研究发现脑缺血及再灌注后出现MMPs 表达增加,尤其是MMP-9与血脑屏障通透性的增加有关。

MMP-9基因敲除可减小鼠缺血后的脑梗死体积；MMP-9可降解ECM,导致BBB受损引起出血和水肿,并能促进中性粒细胞浸润,引起局部炎症反应,加重组织损伤。

因此寻找以MMP-9为作用靶点,减轻血脑屏障通透性进而减轻脑损伤的神经保护剂意义重大。

乌司他丁是一种蛋白酶抑制剂,已有许多研究证实乌司他丁对肝、肾、心、肠、肺等组织缺血再灌注损伤有器官保护作用。

在脑缺血再灌注损伤方面也有少量研究,多侧重于减轻炎性因子、清除自由基对机体的损伤方面,但对BBB通透性及MMP-9活性的影响方面还不清楚。

本实验采用大脑中动脉线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,检测损伤侧脑组织MMP-9活性与BBB通透性的变化,并观察乌司他丁治疗后的效果,探讨乌司他丁对脑缺血的神经保护作用机制,为脑梗死的治疗开辟一条新的途径。

材料与方法健康清洁级SD大鼠72只,体重250g-300g,根据Zea Longa 线栓法并加以改进制作大脑中动脉栓塞再灌注损伤模型。

作者：闫明俞陈虹杨赞章刘斐【摘要】目的通过观察帕金森病（pd）大鼠在不同时间点脑组织中伊文斯蓝(eb)含量变化来探讨急性和慢性pd大鼠血脑屏障（bbb）通透性的变化。

方法脑立体定向将6 羟基多巴胺（6 ohda）注入大鼠右侧纹状体建立pd模型。

将大鼠随机分成对照组和模型组，后者又分为6 h，12 h，24 h，4周组，最后一组为慢性pd组。

按belayev法使用eb测定bbb通透性。

结果急性pd大鼠bbb通透性在6 h达到高峰（p&lt;0.01），12 h逐渐下降（p&lt;0.05），持续至24 h（p&lt;0.05），慢性pd大鼠（4周）与对照组相比无明显差异（p&0.05）。

结论急性pd时伴有bbb的通透性增加，而慢性pd时bbb的通透性未见改变。

【关键词】帕金森病；血脑屏障；伊文斯蓝1 仪器与材料1.1 仪器和试剂脑立体定位仪（美国bas公司 sas-4100型），牙科钻（韩国 strong 90），varioskan flash 4.00.51型酶标仪（美国thermo electron公司），hm 202型十万分之一天平，hhs精密电热恒温水浴锅(江苏金坛市医疗仪器厂)，高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；6 ohda(sigma 公司)，阿朴吗啡(sigma 公司)，甲酰胺（天津富宇精细化工有限公司），伊文斯蓝(上海新中化学厂生产)，millipore超纯水系统。

2 方法2.2 行为学检测筛选慢性pd模型第4组实验鼠（4周组）术后第2周开始经皮下注射新鲜配制的阿朴吗啡（apo）（按0.5 mg/kg给药），检测大鼠旋转行为。

每周1次，直至术后4周。

手动记数每分钟旋转次数及30 min内旋转总次数。

恒定向损伤对侧旋转且旋转圈数超过7 r/min（30 min，210圈）的大鼠视为阳性，连续4周阳性者为合格的慢性pd动物模型。

2.3 伊文斯蓝（eb）测定实验鼠在相应的时间点麻醉后，经股静脉注入2%eb生理盐水溶液（2 mg/kg）,几秒钟后大鼠眼球、结膜、四肢等均显示蓝色，表明注入成功。

利用伊文思蓝的荧光显示肾上腺素诱发的血脑屏障开放
邝芳;王百忍;王凌;杨志军;段晓莉;鞠躬
【期刊名称】《神经解剖学杂志》
【年(卷),期】1997(13)4
【摘要】本文采用伊文思蓝静脉注射，在荧光显微镜下观察了不同剂量的肾上腺素诱发的大鼠血脑屏障开放状况，结果发现：（1）伊文思蓝在血脑屏障开放局部呈现出鲜艳明亮的荧光斑；（2）随着肾上腺素剂量加大，光斑数量增加；（3）光斑在实验组全脑的分布，以下丘脑、丘脑、小脑和尾壳核内密度最高。

上述结果表明利用伊文思蓝的荧光染料性质观察血脑屏障的开放具有简便易行、灵敏度高等优越性．
【总页数】4页(P417-420)
【关键词】伊文思蓝;血脑屏障;荧光;神经解剖学;方法技术
【作者】邝芳;王百忍;王凌;杨志军;段晓莉;鞠躬
【作者单位】第四军医大学全军神经科学研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R322.8－33
【相关文献】
1.伊文思蓝、zo-1评估血脑屏障损伤的应用研究 [J], 石向群;杨金升;石莉;刘秀峰;包仕尧
2.静脉注射脂多糖和小剂量肾上腺素后血脑屏障的开放 [J], 邝芳;王百忍;鞠躬
3.伊文思蓝灌注染色技术在微波辐射致大鼠血脑屏障通透性改变中的应用 [J], 高亚兵;李翔;王水明;王丽峰;赵黎;董霁;姚斌伟;彭瑞云
4.伊文思蓝灌注染色技术在微波辐射致大鼠血脑屏障通透性改变中的应用 [J], 高亚兵;李翔;王水明;王丽峰;赵黎;董霁;姚斌伟;彭瑞云
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