不同比例激活剂对富血小板凝胶的生物学影响

收稿日期：2016-09-26∗基金项目：国家自然科学基金（No ：30973244）[通信作者]陈建苏，E-mail ：chenjiansu2000@ DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2017.20.004文章编号：1005-8982（2017）20-0016-05不同比例激活剂对富血小板凝胶的生物学影响∗戴静1，陈建苏2，招志毅1[1.广西省柳州市工人医院眼科，广西柳州545005；2.暨南大学医学院眼科研究室（再生医学教育部重点实验室），广东广州510632]摘要：目的比较不同比例激活剂对富血小板凝胶的生物学影响，研究其用于角膜基质再生的可行性。

方法抽取兔全血，经二次离心法制备富血小板血浆（PRP ），将PRP 与激活剂按不同比例激活，制备PRP 凝胶。

实验分为3个实验组，分别为9∶1组（PRP ∶激活剂=9∶1）、11∶1组（PRP ∶激活剂=11∶1）及5∶1组（PRP ∶激活剂=5∶1）。

将兔角膜基质细胞与PRP 凝胶共同培养，进行组织形态学观察，用细胞增殖-毒性检测试剂盒法，分别检测3个实验组PRP 凝胶释放的复合生长因子促角膜基质细胞的增殖作用。

对不同实验组制备的PRP 凝胶与双层猪角膜基质进行黏附性观察。

结果9∶1组制备的PRP 凝胶促进兔角膜基质细胞的增殖和活化作用强于其他实验组。

3个实验组中，只有9∶1组制备的PRP 凝胶苏木精-伊红染色法染色结果显示，呈有序的网状支架结构，能紧密黏附并固定双层猪角膜基质。

结论PRP 与激活剂以9∶1比例制备的PRP凝胶促角膜基质细胞增殖作用最强，同时具有有序网状结构和良好的组织黏附性及相容性，是一种可以用于角膜基质再生的良好支架。

关键词：激活剂；富血小板凝胶；角膜基质；中图分类号：R318.08文献标识码：AEffect of different proportions of activators on biologicalfunctions of platelet-rich gel ∗Jing Dai 1,Jian-su Chen 2,Zhi-yi Zhao 1(1.Department of Ophthalmology,Liuzhou Worker's Hospital,Liuzhou,Guangxi 545005,China;2.Research Room of Ophthalmology,Key Laboratory of Regenerative Medicine of Ministryof Education,Jinan University,Guangzhou,Guangdong 510632,China)Abstract:Objective To compare the effect of different proportions of activators on the biological function of platelet-rich gel and to reaserch the feasibility for the reconstruction of corneal stroma.Methods Rabbit blood was extracted and platelet-rich plasma (PRP)was prepared by two-step centrifugation.Platelet-rich gels were prepared by activation of PRP with thrombin activators in different proportions and divided into three groups.There were group 9:1(PRP :activators =9:1),group 11:1(PRP :activators =11:1)and group 5:1(PRP :activators =5:1).The rabbit keratocytes were seperately co-cultured with the three platelet-rich gels and the morphological features were K-8assay was used to analyze the influences of composite growth factors released from the platelet-rich gel on the proliferation of rabbit keratocytes in the three groups.The adhesive properties of the three platelet -rich gels were evaluated after adhesion to the double -layer porcine corneal stroma.Results The platelet-rich gel of the group 9:1had better effect on promoting cell proliferation than those of other two groups.HE staining displayed that only the platelet-rich gel prepared in the group 9:1formed an orderly network scaffold that could closely attach to the double-layer porcine corneal stroma.Conclusions The platelet-rich gel,prepared by combining PRP with activators in 9:1proportion,can第27卷第20期中国现代医学杂志Vol.27No.202017年9月China Journal of Modern MedicineSept.201716··第20期戴静，等：不同比例激活剂对富血小板凝胶的生物学影响富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）是一种全血提取后获得的血小板浓缩物，PRP与激活剂按一定比例激活后，就可得到PRP凝胶。

PRP凝胶制备方法中,多种因素都可能影响其生物效应的发挥，而不同激活剂及其比例的选择对PRP凝胶促组织再生有非常重要的作用[1-2]。

本文通过PRP与凝血酶激活剂按不同比例激活，制备PRP凝胶，比较不同比例的激活剂对富血小板凝胶生物学影响的差异，得出促进角膜基质再生所需激活剂的最佳比例，为临床治疗提供理论依据。

1材料与方法1.1试剂及仪器Ⅱ型胶原蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶购自美国Sigma公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、细胞培养基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）购自美国Gibico公司，活细胞计数法试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）（日本同仁化学研究所），多功能酶标仪（奥地利Tzcan公司），倒置显微镜（德国Leica公司），3111型二氧化碳CO2培养箱、置入-80℃冰箱冷冻保存备用，购自美国Forma公司，Universal32R型低温离心机（德国Hettich公司）。

1.2方法1.2.1激活剂的配制分别取1000u凝血酶，0.25g 10%氯化钙溶于2.5ml磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）中制成100g/L氯化钙与400u/ml 凝血酶的血小板血浆激活剂，0.22μm滤器过滤后离心管（eppendorf，EP）分装，置入-20℃冰箱冷冻保存备用。

1.2.2分组及不同组别PRP复合生长因子、兔富血小板凝胶的制备采用改良Curasan法二次离心制备富血小板血浆[3]。

取100μl制备好的PRP与血小板血浆激活剂分别按9∶1、11∶1及5∶1的比例混合，从而分为3个不同实验组，分别为9∶1组（PRP∶激活剂=9∶1）、11∶1组（PRP∶激活剂=11∶1）及5∶1组（PRP∶激活剂=11∶1）。

混合激活后可形成胶冻状物，得到3个不同实验组的兔PRP凝胶。

分别将上述3个实验组制备的兔PRP凝胶放置于4℃冰箱24h，4℃、5000r/min离心20min。

分别吸取析出的上清液，经0.22μm滤膜过滤后分装，得到3个不同实验组的兔PRP凝胶释放的复合生长因子萃取液。

1.2.3CCK-8法CCK-8法检测不同比例激活剂制备的PRP复合生长因子对兔角膜基质细胞增殖的影响。

采用胶原蛋白酶消化法获取第3代兔角膜基质细胞，以胰蛋白酶消化后，用含10%FBS的DMEM培养液制成10×103个/ml密度的兔角膜基质细胞悬液，以100μl/孔接种在96孔板中，在5% CO2、37℃恒温培养箱内孵育过夜后，弃原培养液，用无血清DMEM液洗涤2次，加入新的培养液[4]。

根据加入新细胞培养液的不同分为4组：将3个不同实验组的PRP复合因子萃取液用无血清DMEM配制成含5.0%兔PRP复合因子培养液的9∶1实验组、11∶1实验组及5∶1实验组，对照组培养液为未加入任何PRP复合因子的无血清DMEM液。

每组制备25孔，分别加入100μl/孔各自组的培养液，分别在培养第2、3、5、7和8天后，每组选取5孔加入10μl CCK-8，5%CO2、37℃恒温培养箱内培养2h。

用酶标仪测定450nm波长处的吸光度（optical density，OD），求出各组吸光度的平均值。

1.2.4生物角膜基质支架采用胶原蛋白酶消化法培养获得的第3代兔角膜基质细胞，以胰蛋白酶消化后，用含10%FBS的DMEM培养液制成5×105个/ml 密度的兔角膜基质细胞悬液40μl，分别接种于3个不同实验组的富血小板凝胶上，于5%CO2、37℃恒温培养箱内培养24h后，弃去培养基，分别在已贴壁细胞表面覆盖前步制备的3个不同实验组的富血小板凝胶，于5%CO2、37℃恒温培养箱内培养24h，倒置显微镜下观察细胞的生长状况和形态变化，并拍照记录。

取培养48h后的标本，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色。

1.2.5双层猪角膜基质的黏附从屠宰场猪尸体上获取新鲜猪眼球，用剪刀水平剪出全厚角膜片，解剖显微镜下撕去上皮层和后弹力层，环钻钻取并分离中央直径约7mm大小的角膜板层基质片，深度约effectively promote the proliferation of keratocytes,and has the nature of orderly network structure,effective adhesiveness and favorable biocompatibility.These properties indicate that the platelet-rich gel prepared by combining PRP with activators in9:1proportion is an excellent scaffold for the reconstruction of corneal stroma.Keywords:activator;platelet-rich gel;corneal stroma17··中国现代医学杂志第27卷附表PRP 复合生长因子培养兔角膜基质细胞不同时间的OD 值比较（x ±s ）对照组0.379±0.0320.353±0.0390.306±0.0530.324±0.0200.359±0.3229∶1组0.456±0.0350.749±0.611 1.963±0.771 2.501±0.188 2.900±0.1075∶1组0.324±0.0120.494±0.588 1.051±0.225 1.794±0.107 2.173±0.36311∶1组0.403±0.0550.609±0.0521.321±0.0231.983±0.1432.386±0.128图1各组培养兔角膜基质细胞OD 值的变化趋势对照组9∶1组5∶1组11∶1组时间/d123451：第2天；2：第3天；3：第5天；4：第6天；5：第8天为角膜基质厚度的1/2，在基质片上加入120μl 兔PRP ，分别以不同比例加入激活剂激活得到兔富血小板凝胶，根据实验组中制备凝胶的激活剂比例不同，分为9∶1组、11∶1组及5∶1组；在不同实验组凝胶表面覆盖一层直径约7mm 大小的猪角膜基质片，于5%CO 2、37℃恒温培养箱内静置过夜。