伪狂犬病毒实时荧光定量PCR方法的建立

猪伪狂犬病病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用徐凯文;廖帆;雷磊;谭磊【期刊名称】《养猪》【年(卷),期】2022()6【摘要】当前猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)仍是猪场常见的病原之一,给我国生猪养殖业造成了巨大的经济损失。

为建立一种基于SYBR Green的PRV实时荧光定量PCR检测方法,以PRV-gE基因序列为靶标,构建pUCmT-gE重组质粒(并作为阳性质粒),针对该基因设计特异性引物,并评估该方法的灵敏性、特异性和可重复性等指标。

结果表明,该方法检测下限为4.545拷贝/μL,而普通PCR 检测下限为4.545×10^(2)拷贝/μL;在90.0℃出现单一的溶解峰,并与PCV2(圆环病毒2型)、PPV(细小病毒)、PRRSV(蓝耳病病毒)、PEDV(流行性腹泻病毒)和TGEV(传染性胃肠炎病毒)等不产生交叉反应。

此外,该方法对15份疑似感染伪狂犬病的临床样品检出率为20%(3/15),高于常规PCR检出率(13.33%,2/15)。

因此,该方法较传统PCR具有更高灵敏性,更适合用于PRV的临床早期诊断。

【总页数】4页(P97-100)【作者】徐凯文;廖帆;雷磊;谭磊【作者单位】湖南农业大学动物医学院【正文语种】中文【中图分类】S858.285.3【相关文献】1.Taq Man实时荧光定量PCR检测猪伪狂犬病病毒方法的建立与初步应用2.猪捷申病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立和初步应用3.实时荧光定量PCR检测伪狂犬病病毒方法的建立与初步应用4.同时检测猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪细环病病毒1型和2型的多重SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立5.伪狂犬病病毒TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量（Real Time quantitative PCR）是检测RNA或DNA的一种常用技术，通过检测特定目标的增加（或减少），可以用来测定RNA 或DNA的表达水平，或者基因等的转录水平。

下面我们就对实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的实验步骤进行具体介绍。

1.搭建实验
第一步是搭建实验，即准备实验所需的干燥试剂，第二步是准备RNA 样本，第三步是准备标准曲线，最后是根据实验需要准备实验板和实验试管。

2、RNA样品提取
在实验中，会使用到多种RNAs，一般情况下使用TRIzol或Phenol 抽提方法进行RNA抽提，不同的细胞、组织中RNA的杂质含量不一样，因此需要根据实验需求进行适当调整抽提浓度。

3、RT-qPCR反转录
在RT-qPCR反转录之前，首先要准备反转录试剂，一般采用qPCR反转录试剂盒，这种试剂盒含有足够的反转录荧光探针以及反转录引物，它可以有效帮助反转录过程。

反转录过程通过复制DNA片段的过程完成，最终转录出的cDNA存在细胞核中。

4、qPCR扩增实验
qPCR扩增实验是在反转录完成后进行，一般来说，这个步骤可以采用qPCR扩增试剂盒，该试剂盒中包含所需的扩增物质如DNA聚合酶、前驱核苷酸、dNTPs，检测细胞核中的cDNA。

±堡塞墼塑些匿瘟壹堂壅查塑！至！！旦箜丝鲞筮！塑Ｓ堕！堂』妞垦丛！啦！：墅苎堂！坚：！生：丝！堕！：！狂犬病病毒实时荧光定量ＰＣＲ检测方法的建立和阳性对照的制备王云龙，赵瑞红，李智涛，李玉林。

王国强，沈飞【摘要】目的建立狂犬病病毒实时荧光定量ＰＣＲ检测方法，制备狂犬病病毒（ｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ，ＲＶ）的假病毒颗粒阳性对照。

方法在ＲＶ的Ｎ基因保守区设计引物和探针，建立反转录实时荧光定量ＰＣＲ检测方法，克隆得到噬菌体ＭＳ２的装配蛋白和壳蛋白基因（ＭＳ２），将其重组到质粒ｐＥＴ．２８ｂ（＋）中，再将ＲＶ的Ｎ基因片段重组到ＭＳ２下游，经原核表达得到ＲＶ假病毒颗粒。

结果实时荧光定量ＰＣＲ检测Ｒｖ重组质粒最低检测限为１５拷贝，Ｉｌｌ，重组表达质粒经原核表达可形成耐ＲＮａｓｅ的ＲＶ病毒样颗粒。

结论建立了反转录实时荧光定量ＰＣＲ检测ＢＶ核酸的方法，成功构建了可耐受心蛳且无传染性的ＲＶ阳性对照。

【主题词】聚合酶链反应；狂犬病病毒；假病毒颗粒ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆａｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓａｎｄｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＲＮＡｐｅｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｓＷＡＮＧＹｕｎ－／ｏｎｇ’，ｚＨＡｏＲｕｉ－ｈｏｎｇ，ｕＺｈｉ－ｔａｏ．１２Ｙｕ－“ｎ，ＷＡＮＧＧｕｏ－ｑｉａｎｇ。

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Ｃｏｌｌｅｇｅｏｆ￡咖Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｓ，ＨｅｎａｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ４５３００７，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＷＡＧＮＹｕｎ－ｂｎｇ，Ｅ－ｍａ／／：６面伽“＠１２６．姗【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＥｓｔａｂｌｉｓｈｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲｎＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ（Ｒｖ）ａｎｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔＲＮａｓｅ．ｒｅｓｉｓｔａｎｔｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓ酗ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＡｎａｌｙｚｅｔｈｅｄａｔａｂａｓｅｉｎＧｅｎＢａｎｋ，ｔｈｅｐｒｏｂｅａｎｄｔｈｅｐｒｉｍｅｒＢｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄｉｎｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｒｅｇｉｏｎｏｆＮｇｅｎｅｏｆｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓａｎｄｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｒｅａｌ·ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ；ＯｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆＭＳ２ｐｈａｇｅ，ｗｉｔｈｔｈｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｇｅｎｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．ｐｒｅｐａｒｅｔｈｅＲＮ脚．ｒｅｓｉｓｔａｎｔｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｆｏｒＲＶｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｓ；ＲｅｓｕｌｔｓＲＮａｓｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｖｉｒｅｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄａｆｔｅｒｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥ．ｃｏｌｉ．１１ｌｅｄｅｓｉｇｎｅｄｐｒｉｍｅｒｓａｎｄｐｒｏｂｅｗｅｒｅｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｏｂｅｖｅｒｙｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｄＣＯｌｌＳｅｒｖａｔｉｖｅ，ａｎｄｂｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ１５ｃｏｐｉｅｓ／ｍ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＥｓｔａｂｈｓｈｅｄｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｄｅｔｅｃｔｉｎｇｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓｂｙｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｆｉｐｄｏｎｒｅａｌ－ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ，ｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｅＲＮａｓｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔａｎｄ１１０ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓ∞ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｈｏｆｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ；ＢａｂｉｅｓＶｉｒｕｓ；Ｖｉｒｕｓ－ＬｉｋｅＰａｒｔｉｃｌｅｓ狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种人畜共患急性传染病，一旦发病，病死率几乎为１００％，对攻击咬伤人或动物的狂犬病病毒可疑带毒者能否做出快速、准确的诊断，对保证人和动物的安全非常重要。

PCR快速检测伪狂犬病病毒野毒感染周斌;苏鑫铭;张素芳;贾赟;曹瑞兵;陈溥言【期刊名称】《中国病毒学》【年(卷),期】2004(019)006【摘要】根据已发表的伪狂犬病病毒(PrV)gE、gI基因的序列,设计并合成了一对引物,以PrV容A株细胞培养毒为模板,筛选最佳反应条件和试剂工作浓度,建立了区分PrV野毒株和疫苗弱毒的鉴别PCR方法.该方法能从PrV容A株(RA)、上海株(SH)、鲁A株(LA)中扩增出一条848bp的片段,但Bartha-K61株没有扩增出该片段.测序结果表明PCR扩增产物和方法的特异性.对正常细胞与其它6种引起猪病毒性疫病相关病毒进行检测,结果均为阴性,没有出现交叉反应.对PrV容A株细胞毒提取物DNA进行检测,其最低检出量为5pg.PCR对感染野毒的发病猪不同组织器官检测发现,淋巴结检出率最高,依次为脾、脑(海马角)、肺、肾、肝等.对2003～2004年期间江苏、浙江、安徽、福建、上海等省市的37个大中型猪场送检的172份病料进行PCR检测病料阳性率为20.34%(35/172),猪场阳性率为40.54%(15/37).实验结果表明所建立的PCR技术可用于伪狂犬病野毒感染的快速鉴定和流行病学调查.【总页数】4页(P612-615)【作者】周斌;苏鑫铭;张素芳;贾赟;曹瑞兵;陈溥言【作者单位】南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏,南京,210095【正文语种】中文【中图分类】R373.9【相关文献】1.鉴别伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒荧光定量PCR方法的建立 [J], 赵丽;崔保安;陈红英;魏战勇;郑兰兰;吕晓丽;贾艳艳;赵绪永2.鉴别猪伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒双重PCR检测方法的建立 [J], 赵丽;卢婷婷;李存法;陈忠杰;连瑞丽3.鉴别猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法的建立和应用 [J], 赵雪丽;闫若潜;吴志明;曹伟伟;王淑娟;谢彩华;马震原;周兵强;王东方4.伪狂犬病病毒野毒感染快速检测方法的比较 [J], 杨红杰;李雪明;于红欣;邹战明;杨倩;周双海5.猪伪狂犬病病毒野毒LNA探针real-time PCR检测方法的建立 [J], 李艳;李春玲;楚品品;雷雯;勾红潮;蒋智勇;蔡汝健;宋帅;卞志标;杨东霞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

动物医学进展,２０１８,３９(１１):３５Ｇ４０P r o g r e s s i nV e t e r i n a r y Me d i c i n e 猪伪狂犬病病毒P C R ＧL F D 检测方法的建立及应用㊀收稿日期:２０１８Ｇ０１Ｇ２４㊀基金项目:天津市科技计划支撑项目(１８Y F Z C N C ０１１１０);天津市农业科技成果转化与推广项目(２０１６０１０７０);天津市生猪产业技术体系项目(I T T P R S ２０１７００３);中国农业科学院重大平台推进计划(Y ２０１７P T ５０)㊀作者简介:张㊀莉(１９７９－),女,河北邢台人,副研究员,硕士,主要从事畜禽疾病研究.∗通讯作者张㊀莉,任卫科,李秀丽,路㊀超,王利丽,郑㊀丽,池晶晶,田向学,韩㊀伟,鄢明华∗(１．农业部兽用药物与诊断技术天津科学观测实验站,天津３００３８１;２．天津市畜牧兽医研究所,天津３００３８１)㊀㊀摘㊀要:旨在将P C R 技术与可视化的横向流动试纸条(l a t e r a l f l o wd i p s t i c k ,L F D )相结合,建立猪伪狂犬病病毒野毒株的P C R ＧL F D 快速检测技术.依据猪伪狂犬病病毒g E 基因保守区域设计２条特异性引物和对应的特异性探针,其中下游引物和探针分别标记了荧光素(F I T C )和生物素(B i o t i n ).通过对P C R 退火温度㊁引物浓度㊁探针杂交温度的筛选,确定P C R ＧL F D 方法的最佳反应条件,并对其敏感性㊁特异性和重复性进行检测.结果显示,所建立的检测方法能够特异性的检测出猪伪狂犬病病毒野毒株,与猪伪狂犬病病毒B a r t h a ＧK ６１株㊁６种对照病毒和３种对照细菌均无交叉反应,其最低检测限为１００TC ID ５０/１００μL .该方法对同批次和不同批次猪伪狂犬病病毒D N A 分别进行５次重复检测,结果完全一致.该方法对５０份临床样品进行检测,P C R ＧL F D 方法和病毒分离培养法检测出１６份阳性样品,常规P C R 检测出１４份阳性样品,P C R ＧL F D 方法的敏感性高于P C R ,但两者间差异不显著P ＞０．０５.以上结果表明,所建立的方法具有良好的特异性㊁敏感性和重复性,且不需要琼脂糖凝胶电泳可直接判读结果,适合养殖场㊁基层实验室的现场检测.㊀㊀关键词:猪伪狂犬病病毒;聚合酶链反应;横向流动试纸条中图分类号:S ８５２．６５文献标识码:A文章编号:１００７Ｇ５０３８(２０１８)１１Ｇ００３５Ｇ０６㊀㊀猪伪狂犬病(P s e u d o r a b i e s ,P R )是由疱疹病毒科㊁αＧ疱疹病毒亚科的伪狂犬病病毒(P s e u d o r a b i e sv i u r s e ,P R V )引起的多种动物的一种高度接触性传染病[１].猪是自然宿主.该病可导致怀孕母猪的流产㊁死胎㊁木乃伊胎和种猪不育等症状;哺乳仔猪常出现神经症状和死亡;成年猪一般呈亚临床或隐性感染,成为病毒的贮存宿主,长期排毒,但是自２０１１年后,我国多地区猪场中出现伪狂犬病病毒变异毒株,一些成年猪也出现神经症状和高病死率等情况[２Ｇ３].猪伪狂犬病流行状况的变化给养猪业带来了巨大损失,因此,特异㊁敏感㊁快速的诊断方法对该病的防控至关重要.目前,伪狂犬病的诊断方法有很多种,其中g E ＧE L I S A 方法和g B ＧE L I S A 常用于猪群的免疫抗体监测和预警,P C R 方法和荧光定量P C R 则是病原学诊断的主要方法[４].P C R ＧL F D 技术是将P C R 技术㊁核酸探针杂交技术与横向流动试纸条(l a t e r a lf l o wd i p s t i c k ,L F D )三项技术相结合,应用试纸条直接检测P C R 扩增产物的技术.此项技术已在结核分支杆菌[５]㊁甲型H １N １病毒[６]㊁乙型肝炎病毒[７]㊁转基因黑曲霉[８]㊁口蹄疫病毒[９]等方面有了成功应用的报道.本研究根据猪伪狂犬病病毒的g E 基因设计一套引物和探针,建立了猪伪狂犬病病毒的P C R ＧL F D 特异性检测方法,为伪狂犬病的诊断提供了一种更为便捷的病原检测方法.１㊀材料与方法１．１㊀材料１．１．１㊀供试病毒株和菌株㊀猪伪狂犬病病毒(P R V )S C 株,由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪烈性传染病创新团队赠送;猪圆环病毒２型(P C V Ｇ２)㊁猪繁殖与呼吸综合征病毒(P R R S V )㊁猪细小病毒(P P V )㊁猪流感病毒(S I V )㊁猪伪狂犬病病毒(P R V )R １３０２８株㊁猪伪狂犬病病毒(P R V )R １３１３９株㊁猪肺炎支原体(M P )㊁副猪嗜血杆菌(H ps )均由天津市畜牧兽医研究所实验室保存;猪链球菌２型(S S ２)㊁猪伪狂犬病病毒(P R V )M i n A 株购自国家兽医微生物菌种保藏管理中心;猪伪狂犬病病毒B a r t h a ＧK ６１株(P R V g E 基因缺失株)㊁日本脑炎病毒(J E V )㊁猪瘟病毒(C S F V )疫苗株为市售疫苗.１．１．２㊀主要试剂㊀r T a q DN A 聚合酶㊁d N T P ㊁２X G C b u f f e r I ㊁D N A M a r k e rD L２０００,宝生物工程(大连)有限公司产品;核酸提取试剂盒,金瑞鸿捷生物科技有限公司产品;横向流动试纸条,杭州忧思达生物技术有限公司产品.１．２㊀方法１．２．１㊀引物设计与合成㊀根据G e n B a n k 数据库中猪伪狂犬病病毒g E 基因(G e n B a n k :A Y １７３１２４)中的一段保守核苷酸序列,采用P r i m e rP r e i m e r ５．０软件设计特异性P C R 引物和探针,由宝生物工程(大连)有限公司合成(表１).表１㊀引物序列T a b l e １㊀P r i m e r s e qu e n c e s 项目I t e m引物名称P r i m e r n a m e s序列(５ᶄＧ３ᶄ)S e qu e n c e s (５ᶄＧ３ᶄ)５ᶄ标记５ᶄL a b e l 扩增片段/b pA m p l i f i c a t i o n f r a gm e n t P C R P R V g E ２４７(上游)C C G G C C C A T C T G G T G A A C G T３３７P r i m e r sP R V g E ６２３(下游)C C C A C C G C C A C A A A G A A C A C GF I T CP C RP r o b eP r v ＧT Ｇb i oG A C C T G G T G C T G G G C C G C G C C T B i o t i n１．２．２㊀P C R ＧL F D 方法的建立㊀１．２．２．１㊀P C R 反应条件优化㊀P C R 反应体系为２０μL :１０μL２ˑG Cb u f f e r I ,０．５μLr T a q D N A 聚合酶(８U /μL ),２μL d N T P s (２．５mm o l /L ),１μL P R V g E ２４７(１０μm o l /L ),１μL P R V g E ６２３(１０μm o l /L ),５．０μL 模板D N A ,０．５μL 超纯水.P C R 反应程序为:９５ħ５m i n ;９４ħ３０s ,５３ħ至６０ħ３０s ,７２ħ３０s ,进行３０个循环;７２ħ延伸５m i n ,４ħ５m i n.１．２．２．２㊀退火温度的优化㊀固定其他条件不变,设定５３㊁５４㊁５５㊁５６㊁５７㊁５８㊁５９㊁６０ħ共８个温度梯度,分别进行扩增,同时设立空白水对照.P C R 反应结束,取８μLP C R 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像仪上观察并记录结果.１．２．２．３㊀引物浓度的优化㊀经上述筛选出最佳退火温度后,固定反应体系其他试剂的添加量,对引物浓度用量设定为０．５μL ㊁１μL ㊁１．５μL ㊁２μL ,并设立空白水对照.反应结束,用琼脂糖凝胶电泳检测结果.１．２．２．４㊀探针杂交反应条件优化㊀P C R 反应结束后,开盖加入１μLP r v ＧT Ｇb i o (１０μm o l /L ),增加一步杂交反应,９４ħ３０s ,５４ħ至６０ħ３０s ,４ħ５m i n .复性温度选择５４㊁５５㊁５６㊁５７㊁５８㊁５９㊁６０ħ分别进行杂交,摸索最佳反应条件.１．２．２．５㊀L F D 试纸条检测P C R 产物㊀杂交反应结束后,取P C R 产物１０μL 加入到１００μL 缓冲液,混合均匀;将L F D 试纸条插入缓冲液３m i n ;取出将试纸条水平放置,５m i n ~１０m i n 内读取结果.判定标准:质控线和检测线显现棕红色条带,为阳性;只有质控线显现棕红色条带,为阴性;只出现检测线为无效.１．２．３㊀特异性试验㊀用已优化的P C R 反应体系检测伪狂犬病病毒(P R V )S C 株㊁伪狂犬病病毒(P R V )R １３０２８株㊁伪狂犬病病毒(P R V )R １３１９３株㊁伪狂犬病病毒(P R V )M i n A 株㊁猪伪狂犬病病毒B a r t h a ＧK ６１株(P R V g E 基因缺失株)㊁猪瘟病毒(C S F V )㊁猪圆环病毒２型(P C V Ｇ２)㊁猪猪繁殖与呼吸综合征病毒(P R R S V )㊁猪细小病毒(P P V )㊁日本脑炎病毒(J E V )㊁猪流感病毒(S I V )㊁猪肺炎支原体(M P )㊁副猪嗜血杆菌(H ps )㊁猪链球菌２型(S S ２).探针杂交后,用琼脂糖凝胶电泳法和L F D 分别检测扩增产物,确定所建立方法的特异性.１．２．４㊀敏感性试验㊀将已知T C I D ５０的伪狂犬病病毒稀释为１０５~１０１个T C I D ５０,按常规方法提取D N A ,分别取５μL 作为模板,其他反应条件不变进行P C R扩增.探针杂交后,用琼脂糖凝胶电泳法和L F D 分别检测扩增产物,确定所建立方法的敏感性.１．２．５㊀琼脂糖凝胶电泳法和L F D 试纸条灵敏度比较㊀以伪狂犬病病毒S C 株D N A 为模板,按照优化后的P C R 条件进行扩增,反应结束后,测定P C R 扩增产物的核酸含量,并用纯水做１０倍㊁１００倍㊁１０００倍稀释.分别取出２０μL 稀释产物,加入１μL 核酸探针,探针杂交反应后,用琼脂糖凝胶电泳法和L F D 试纸条分别检测扩增产物,比较两种方法的差异.１．２．６㊀重复性试验㊀采用同一批次和不同批次提取的猪伪狂犬病病毒D N A 作为模板分别进行５次P C R 扩增,用琼脂糖凝胶电泳法和L F D 法检测扩增产物,确定所建立P C R ＧL F D 方法的重复性.１．３㊀临床样品的检测从养殖场采集５０份病料样品,用病毒分离培养法和P C R ＧL F D 方法同时进行检测,比较两种方法的符合率.６３动物医学进展㊀２０１８年㊀第３９卷㊀第１１期(总第３０５期)２㊀结果２．１㊀退火温度的优化选择５３ħ~６０ħ８个复性温度进行扩增,结果显示５６ħ和５５ħ均能扩增出特异的目的条带,而且５６ħ亮度最强,因此,最终确定５６ħ为最适反应温度(图１).１~８．６０ħ㊁５９ħ㊁５８ħ㊁５７ħ㊁５６ħ㊁５５ħ㊁５４ħ㊁５３ħ;９．阴性对照;M．D N A 标准D L２０００１Ｇ８．６０ħ,５９ħ,５８ħ,５７ħ,５６ħ,５５ħ,５４ħ,５３ħ;９．N e g a t i v ec o n Ｇt r o l ;M．D N A M a r k e rD L２０００图１㊀复性温度优化F i g ．１㊀O p t i m i z a t i o no f t h e a n n e a l i n g t e m pe r a t u r e ２．２㊀引物浓度的优化固定P C R 体系中其他试剂的添加量,将引物浓度用量设定为０．５㊁１㊁１．５㊁２μL 分别进行P C R 扩增,结果显示,加入０．５μL 引物时,扩增条带稍浅;加入１㊁１．５㊁２μL 引物时,扩增条带均清晰,无明显引物二聚体,因此,１μL 为最佳引物添加量(图２).１．２μL 引物(阳性对照);２．２μL 引物(阴性对照);３．１．５μL 引物(阳性对照);４．１．５μL 引物(阴性对照);５．１μL 引物(阳性对照);６．１μL引物(阴性对照);７．０．５μL 引物(阳性对照);８．０．５μL 引物(阴性对照);M．D N A 标准D L２０００１．２μL p r i m e r (p o s t i v e c o n t r o l );２．２μL p r i m e r (n e g n a t i v ec o n t r o l );３．１．５μL p r i m e r (p o s t i v e c o n t r o l );４．１．５μL (n e g n a t i v ec o n t r o l );５．１μL p r i m e r (p o s t i v ec o n t r o l );６．１μL (n e g n a t i v ec o n t r o l );７．０．５μL p r i m e r (p o s t i v ec o n t r o l );８．０．５μL (n e g n a t i v ec o n t r o );M．D N A M a r k e rD L２０００图２㊀引物浓度优化F i g ．２㊀O pt i m i z a t i o no f t h e p r i m e r c o n c e n t r a t i o n ２．３㊀探针杂交反应条件优化P C R 反应液中加入标记B i o t i n 的探针,复性温度选择５４㊁５５㊁５６㊁５７㊁５８㊁５９㊁６０ħ分别进行杂交,然后用L F D 试纸条检测,结果５４㊁５９㊁６０ħ试纸条检测线未出现阳性条带,５５㊁５６㊁５７ħ时检测线有明显阳性带,但５５ħ和５６ħ的检测线较浅,５７ħ检测线最为明显,因此认为９４ħ３０s ,５７ħ３０s ,４ħ５m i n为最佳的探针杂交反应程序(图３).１~７．５４ħ㊁５５ħ㊁５６ħ㊁５７ħ㊁５８ħ㊁５９ħ㊁６０ħ;８．阴性对照１Ｇ７．５４ħ,５５ħ,５６ħ,５７ħ,５８ħ,５９ħ,６０ħ;８．N e gn a t i v e c o n t r o l 图３㊀探针杂交温度筛选试验结果F i g ．３㊀T e m p e r a t u r e s c r e e n i n g te s t r e s u l t s of p r o b eh yb r i d i z a t i o n r e ac t i o n ２．４㊀特异性试验本试验建立的猪伪狂犬病病毒P C R ＧL F D 检测方法检测伪狂犬病病毒(P R V )S C 株㊁伪狂犬病病毒(P R V )R １３０２８株㊁伪狂犬病病毒(P R V )R １３１９３株㊁伪狂犬病病毒(P R V )M i n A 株㊁猪伪狂犬病病毒B a r t h a ＧK ６１株(P R V g E 基因缺失株)㊁猪瘟病毒(C S F V )㊁猪圆环病毒２型(P C V Ｇ２)㊁猪繁殖与呼吸综合征病毒(P R R S )㊁猪细小病毒(P P V )㊁日本乙型脑炎病毒(J E V )㊁猪流感病毒(S I V )㊁猪肺炎支原体(M P )㊁副猪嗜血杆菌(H p s )㊁猪链球菌２型(S S ２).从图４可见所建立的P C R ＧL F D 方法只能检测到伪狂犬病病毒S C 株㊁R １３０２８株㊁R １３１３９株㊁M i n A 株,伪狂犬病病毒B a r t h a ＧK ６１株和其他对照菌毒株均为阴性,采用琼脂糖凝胶电泳和试纸条方法观察的检测结果完全一致.２．５㊀敏感性试验从图５可见,所建立的P C R 方法的最低检测病毒滴度为１０２T C I D ５０/１００μL ,且采用琼脂糖凝胶电泳和试纸条方法的检测结果完全一致.２．６㊀琼脂糖凝胶电泳法和L F D 试纸条灵敏度比较用核酸蛋白测定仪测定伪狂犬病病毒P C R 扩增产物的核酸含量为４８２．５n g /μL ,将其稀释１０倍㊁１００倍㊁１０００倍后,用琼脂糖凝胶电泳和L F D 试纸７３张㊀莉等:猪伪狂犬病病毒P C R ＧL F D 检测方法的建立及应用条分别检测,结果见图６.从图中可看出当P C R 产物稀释１００倍后,已很难通过琼脂糖凝胶电泳观察到阳性结果,但是L F D 试纸条仍可见较为清晰的红色检测线.说明L F D 试纸条的灵敏度是琼脂糖凝胶电泳的１０倍.A．琼脂糖凝胶电泳检测;B ．L F D 试纸条检测;１．伪狂犬病病毒S C 株;２．伪狂犬病病毒M i n A 株;３．伪狂犬病病毒R １３０２８株;４．伪狂犬病病毒R １３１３９株;５．伪狂犬病病毒B a r t h a ＧK ６１株(g E );６．猪圆环病毒２型;７．猪瘟病毒;８．日本乙型脑炎病毒;９．细小病毒;１０．猪繁殖与呼吸综合征病毒;１１．猪流感病毒;１２．猪肺炎支原体;１３．副猪嗜血杆菌;１４．猪链球菌２型;１５．空白对照;M．D N A 标准D L２０００A．A g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ;B ．L F Ds t r i p s ;１．P R VS Cs t r a i n ;２．P R V M i n As t r a i n ;３．P R V R １３０２８s t r a i n ;４．P R V R １３１３９;５．P R VB a r t h a ＧK ６１s t r a i n (g E Ｇ);６．P C V Ｇ２;７．C S F V ;８．J E V ;９．P P V ;１０．P R R S V ;１１．S I V ;１２．M P ;１３．H p s ;１４．S S ２;１５．N e gn a t i v e c o n t r o l ;M．D N A M a r k e rD L２０００图４㊀P C R 特异性试验F i g ．４㊀S p e c i f i c i t y te s t of P CR A．琼脂糖凝胶电泳检测;B ．L F D 试纸条检测;１．阴性对照;２~６．１０１T C I D ５０~１０５T C I D ５０;M．D N A 标准D L２０００A．A g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ;B ．L F Ds t r i p s ;１．N e g n a t i v e c o n t r o l ;２Ｇ６．１０１T C I D ５０Ｇ１０５T C I D ５０;M．D N A M a r k e rD L２０００图５㊀P C R ＧL F D 方法敏感性试验F i g ．５㊀S e n s i t i v i t y te s t of P C R ＧL F D m e t h od A．琼脂糖凝胶电泳检测;B ．L F D 试纸条检测;１．阴性对照;２~４．１０３,１０２,１０稀释的P C R 产物;５．原倍P C R 产物;M．D N A 标准D L２０００A．A g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ;B ．L F Ds t r i p s ;１．N e g n a t i v e c o n t r o l ;２Ｇ４．P C R p r o d u c t s d i l u t e d １０３,１０２,１０t i m e s ;５．T h e o r i gi n a l t i m eP C R p r o Ｇc u c t s ;M．D L２０００D N A M a r k e r图６㊀琼脂糖凝胶电泳法与L F D 试纸条法灵敏度比较试验F i g ．６㊀T h e s e n s i t i v i t y c o m p a r i s o no f a g a r g e l e l e c t r o p h o r e s i s a n dL F Ds t r i p s a n a l ys i s ８３动物医学进展㊀２０１８年㊀第３９卷㊀第１１期(总第３０５期)２．７㊀重复性试验取同一次和不同时间提取的猪伪狂犬病病毒D N A各５份,将其作为模板进行５次P C R扩增,用L F D试纸条和琼脂糖凝胶电泳法检测扩增产物,两种方法结果完全一致,说明所建立的P C RＧL F D方法具有良好的重复性.２．８㊀临床样品的检测对养殖场送检的５０份病料样品用P C R㊁病毒分离培养法和P C RＧL F D方法同时进行检测,结果P C R检测到１４份阳性,而病毒分离培养法和P C RＧL F D方法为１６份,P C RＧL F D方法的敏感性要高于常规P C R方法.从表２可见P C RＧL F D方法与病毒分离培养法的符合率为１００％,与常规P C R方法的阳性符合率为１００％,阴性符合率为９４．４％.用S P S S１７．０软件对结果进行评估,P C RＧL F D方法与P C R的χ２为０．１９０４,P＞０．０５,两种方法无显著差别.表２㊀两种方法检测结果比较T a b l e２㊀C o m p a r i s o n r e s u l t s o f t w om e t h o d s检测方法D e t e c t i o nm e t h o d s P C RＧL F D P C R病毒分离培养法V i r u s i s o l a t i o nm e t h o d 阳性数P o s t i v e s a m p l e s１６１４１６阴性数N e g a t i v e s a m p l e s３４３６３４阳性符合率/％P o s t i v e c o i n c i d e n c e r a t e１００１００１００阴性符合率/％N e g a t i v e c o i n c i d e n c e r a t e１００９４．４１００３㊀讨论猪伪狂犬病是危害养猪业发展的重要传染病之一.对猪伪狂犬病病毒进行快速㊁及时㊁准确的诊断,是有效防控该病的重要前提.伪狂犬病病毒g E 基因是其主要毒力决定因子,为病毒复制的非必需基因,也是世界动物卫生组织(O I E)所规定基因缺失疫苗的缺失基因.以g E序列作为靶序列建立的诊断技术,能够区分基因缺失疫苗接种与野毒感染[３].王香玲等[１０]根据猪伪狂犬病病毒g E基因序列保守区段,设计一对特异性引物,通过优化反应条件,建立了可区分猪伪狂犬病病毒野毒株与基因缺失疫苗株的P C R检测方法,该方法的敏感性为１．１p g,有较高的特异性.张志等[１１]建立了能够特异性检测P R V野毒株的套式P C R方法,该方法检测极限可达１０个病毒拷贝/μL.田云等[１２]建立检测伪狂犬病病毒野毒的荧光定量P C R方法,该方法的灵敏度可达４拷贝.常规P C R方法检测成本低,但需要琼脂糖凝胶电泳观察结果,且有时会出现假阳性结果.荧光定量P C R虽然敏感性高于P C R,可实时观看检测结果,但是需要昂贵的设备和试剂成本,不适用于基层实验室和规模化猪场使用.本研究建立了一种基于猪伪狂犬病病毒g E基因的P C RＧL F D检测方法,该方法是将P C R技术与L F D试纸相结合的一种可视化检测方法,在引物设计时将一条引物标记了异硫氰酸荧光素(F I T C),在P C R反应后,体系中加入了一条标记生物素(B i oＧt i n)的探针,只有目的基因的P C R扩增产物才能与探针结合.采用试纸条对P C R扩增产物进行检测,杂交形成的复合体带有B i o t i n和F I T C两种标记,用试纸条检测时检测线和质控线均出现棕红色条带.阴性P C R产物㊁假阳性P C R和引物二聚体不具有双重标记,不能与检测线结合,检测线不显色.该方法在P C R扩增后１５m i n内即可目测判定结果,与传统凝胶电泳法相比更快速,且避免使用溴化乙锭(E B)等核酸染料造成的环境污染[８].为了避免P C R结果出现假阳性,本研究在P C R扩增完成以后,增加了特异性探针杂交反应,进一步提高了该方法的特异性.试验结果表明,该方法可特异性检测猪伪狂犬病病毒野毒株,与缺失g E基因的B a r t h aＧK６１株和其他９种猪病病原无交叉反应.此外,对比L F D试纸条法和琼脂糖凝胶电泳法对P C R扩增产物检测结果的灵敏度发现, P C RＧL F D方法的最低检测限度为１００T C I D５０/１００μL,其敏感性比应用琼脂糖凝胶电泳方法高１０倍.针对２０１１年以来流行的猪伪狂犬病病毒变异株分子特征发生变化的特点,在试验中分别对伪狂犬病病毒经典强毒双城株(S C株)和闽A株(M i n A 株),新分离的猪伪狂犬病变异强毒R１３１３９和R１３０２８株,以及猪伪狂犬病病毒缺失g E基因的疫苗株B a r t h aＧK６１进行了检测,结果仅B a r t h aＧK６１株检测结果为阴性,其他４株P R V检测结果均为阳性,表明建立的方法适用于P R V经典强毒和变异的强毒株的检测.以上结果表明,本研究建立的伪狂犬病病毒P C RＧL F D检测方法具有敏感㊁快速㊁特异等特点,且操作简便㊁无需电泳可直接观察结果,可用于实验９３张㊀莉等:猪伪狂犬病病毒P C RＧL F D检测方法的建立及应用室㊁养殖场和基层兽医部门对伪狂犬病的诊断和监测预警,具有广阔的应用前景.参考文献:[１]㊀A nTQ,P e n g JM,T i a nZ J,e t a l．P s e u d o r a b i e s v i r u s v a r i a n t i nB a r t h aＧK６１Ｇv a c c i n a t e d p i g s,C h i n 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dD i a g n o s i sT e c h n o l o g y,T h eM i n i s t r y o fA g r i c u l t u r e o f t h eP e o p l e̓sR e p u b l i c o f C h i n a,T i a n j i n,３００３８１,C h i n a;２．T i a n j i nI n s t i t u t e o f A n i m a l S c i e n c e a n dV e t e r i n a r y M e d i c i n e,T i a n j i n,３００３８１,C h i n a)A b s t r a c t:T h e e x p e r i m e n tw a s a i m e d t oe s t a b l i s ha r a p i dP C RＧL F D m e t h o d f o r t h ed e t e c t i o no f p s e u d o r aＧb i e s v i r u sw i l dＧt y p e s t r a i n s b a s e d o n t h e P C R m e t h o d a n d v i s u a l i z a t i o nb y a l a t e r a l f l o wd i p s t i c k(L F D)．I n t h i s s t u d y,t w os p e c t i f i cP C R p r i m e r s a n do n en u c l e i c a c i d p r o b ew e r ed e s i g n e db a s e do n t h e c o n s e r v a t i v e r e g i o n s o f g E g e n eo f p s e u d o r a b i e sv i r u s,d o w n s t r e a m p r i m e ra n dn u c l e i ca c i d p r o b e w e r er e s p e c t i v e l y l a b l e db y f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e(F I T C)a n db i o t i n．T h eo p t i m u m r e a c t i o nc o n d i t i o n so fP C RＧL F D m e t h o dw e r e d e t e r m i n e db y s c r e e n i n g t h e a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e o f P C R,t h e c o n c e n t r a t i o no f p r i m e r s a n d t h eh y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e o f t h e p r o b e,w h i l e i t s s p e c i f i c i t y,s e n s i t i v i t y a n d r e p r o d u c i l b i l i t y w e r e t e s t e d．T h e r e s u l t s s h o w e do n l yp s e u d o r a b i e s v i r u sw i l dＧt y p e s t r a i n sw e r e p o s i t i v e,a n dn o c r o s sＧr e a c t i o nw e r e o bＧs e r v e dw i t ht h eP R VB a r t h aＧK６１s t r a i na n do t h e rs i xc o n t r o lv i r u ss t r a i n sa n dt h r e ec o n t r o lb a c t e r i a l s t r a i n s．T h e s e n s i t i v i t y o f t h ea s s a y w a s１００TC I D５０/１００μL．T h i s m e t h o dh a df i v er e p e a t e dt e s t sf o r t h e s a m eb a t c ha n dd i f f e r e n t b a t c ho f p s e u d o r a b i e sv i r u sD N A,a n d t h e r e s u l t sw e r e i d e n t i c a l．F o r t h e５０s u sＧp e c t e d s a m p l e s,１６p o s i t i v e s a m p l e sw e r e i d e n t i f i e d b y P R V i s o l a t i o n a n d t h e P C RＧL F Ds t r i p m e t h o d,w h i l e １４p o s i t v e s a m p l e sw e r e i d e n t i f i e db y r e g u l a rP C R．T h eP C RＧL F D m e t h o dh a dh i g h e r s e n s i t i v i t y t h a nt h e P C R,b u t P＞０．０５,t h a tw a sn o t i ns i g n i f i c a n t l e v e l．T h ea b o v e r e s u l t s i n d i c a t e dt h a t t h em e t h o do fP C RＧL F Df o rd e t e c t i n gp s e u d o r a b i e sh a s g o o ds p e c i f i c i t y,s e n s i t i v i t y a n dr e p e a t a b i l i t y,a n d i td o e sn o t r e q u i r ea g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s t o r e a d t h e r e s u l t s,w h i c h i s s u i t ab l e f o r f i e l d t e s t i n g o f f a r ma n db a s i cＧl e v e l l aＧb o r a t o r y．K e y w o r d s:P s e u d o r a b i e s v i r u s;P C R;L F Ds t r i p０４动物医学进展㊀２０１８年㊀第３９卷㊀第１１期(总第３０５期)。

实时荧光定量pcr的原理和方法实时荧光定量PCR（qPCR）是一种分子生物学技术，用于检测和定量特定DNA或RNA序列的存在和相对丰度。

它可以在短时间内快速、准确地测量目标序列的数量，并在许多领域中被广泛应用，包括基因表达分析、病原体检测和基因突变分析等。

实时荧光定量PCR的主要原理是通过放大DNA模板，并使用荧光探针或染料进行实时监测。

这些荧光探针通常是DNA寡核苷酸序列，带有一个共振能量转移对（RET pair），由一个荧光引物（donor）和另一个荧光引物（acceptor）组成。

在初始的PCR循环中，通过在高温下使DNA变性，使两个引物和DNA分离。

在下一个低温的退火步骤中，这两个引物会与DNA互补结合。

当两个引物结合到DNA模板上时，它们的荧光引物也会接近彼此，从而使共振能量转移发生，导致荧光信号减弱或消失。

这种现象被称为荧光淬灭。

当PCR循环继续进行时，每个复制周期会以指数级增加DNA模板的数量。

由于引物的结合会导致荧光淬灭，因此在每个PCR循环的末尾，荧光信号将与DNA模板的数量成正比。

实时荧光定量PCR中常用的荧光探针有探针PCR和SYBR Green。

探针PCR使用两个引物和一个荧光探针，该探针带有一个荧光团和一个辅助荧光团。

在荧光探针与DNA模板结合时，两个荧光团之间的共振能量转移会发生，导致荧光信号的减弱。

SYBR Green则是一种将DNA结合的染料，在PCR循环中，SYBR Green会与所有DNA结合，并发出荧光信号。

使用探针PCR时，可以通过测量荧光信号的减弱来确定目标DNA的存在量。

而使用SYBR Green时，可以通过测量荧光信号的增加来判断目标DNA的数量。

实时荧光定量PCR的操作过程如下：1. DNA提取和纯化：从样品中提取所需的DNA或RNA，并经过纯化处理，以去除可能干扰PCR反应的杂质。

2. 引物设计：设计适合的引物和荧光探针，以在PCR反应中特异性地扩增目标序列。

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，QRT-PCR）的方法学建立QRT-PCR原理：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。

检测方法包括SYBR GreenⅠ法和TaqMan探针法，在基础研究中，应用比较广泛的为SYBR GreenⅠ法，因此，以下主要针对SYBR GreenⅠ法的方法学建立。

一、RNA的提取及质量检测Trizol法提取RNA的原理：Trizol主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使ＲＮＡ释放出来的同时，保护ＲＮＡ的完整性。

加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。

RNA存在于水样层中。

收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。

1、用液氮将组织研碎，按照50-100 mg组织加入1mL的Trizol® Reagent（若样品为细胞，则按照5-10x106个细胞加入1mL的Trizol® Reagent来裂解细胞），室温裂解5 min，使核蛋白复合物充分分离。

2、每1 mL的Trizol® Reagent加入200 μl氯仿，剧烈摇晃、混匀，室温静置5 min。

于4℃离心机12000 g离心15 min，离心后，混合物分为下层（红色酚氯仿）中层和上层（无色的水相层，约占总体积的50%），RNA存留于上层水相中。

用移液器吸出样品中的水相转移至另一EP管中，勿吸出中间相和有机相。

3、按照每1 mL的Trizol® Reagent加入500 μl异丙醇，轻轻混匀，室温孵育10 min。

于4℃离心机12000 g离心10 min，RNA沉于管底，弃上清。

4、按照每1 mL的Trizol® Reagent加入500 μl 75%的乙醇洗涤RNA，于4℃离心机7500 g 离心10 min，用75%乙醇洗涤RNA两次。

5、去除管中75% 乙醇，将RNA自然晾干5 min。

伪狂犬病病毒gE基因荧光定量PCR检测方法的建立李雪明;于红欣;杨红杰;王俊;周双海【摘要】伪狂犬病病毒(PRV)野毒有gE基因,而其疫苗毒株无gE基因,这为检测有无PRV野毒感染提供参考.用PCR方法扩增PRV的gE基因片段,构建含有PRV gE基因片段的重组质粒.以系列稀释后的重组质粒作为模板,应用SYBR Green I来进行检测PRV gE基因的实时荧光定量PCR扩增.结果显示:在(6.9×107～6.9×101) copies/μL范围内,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物具有单一整齐的熔解曲线峰,标准曲线具有优良的线性关系.该方法最低可准确检测69 copies/μL 的核酸模板,重复性试验的变异系数小于2％,对PRV-gE基因缺失疫苗毒株和常见猪源DNA病毒的检测结果均为阴性,对临床样品的检出率高于常规PCR方法.研究结果表明,建立了1种特异性强、灵敏度高、重复性好的检测PRV gE基因的SYBR Green I荧光定量PCR方法,可用于PRV野毒感染的定量检测.【期刊名称】《北京农学院学报》【年(卷),期】2015(030)004【总页数】4页(P74-77)【关键词】伪狂犬病病毒;gE基因;荧光定量PCR;伪狂犬病病毒野毒【作者】李雪明;于红欣;杨红杰;王俊;周双海【作者单位】北京农学院动物科学技术学院,北京102206;北京市顺义区动物疫病预防控制中心,北京101300;北京农学院动物科学技术学院,北京102206;北京农学院动物科学技术学院,北京102206;北京市顺义区动物疫病预防控制中心,北京101300;北京农学院动物科学技术学院,北京102206;北京农学院动物科学技术学院,北京102206【正文语种】中文【中图分类】S852.65伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)是双链DNA病毒，属于疱疹病毒科，能够感染多种家畜和野生动物；PRV对猪的危害最大，PRV感染可引起种猪繁殖障碍及哺乳仔猪大批死亡，年龄较大的猪则多系隐性感染，但可长期带毒排毒[1]。

检测伪狂犬病病毒的交叉引物扩增方法的建立和评价检测伪狂犬病病毒的交叉引物扩增方法的建立和评价引言：伪狂犬病病毒是引起家养犬类和猫等动物发生急性中枢神经系统感染的病原体，具有高度的致病性和传染性。

为了快速、准确地检测和诊断伪狂犬病病毒感染，本研究旨在建立一种基于交叉引物扩增的检测方法，并对其进行评价。

材料与方法：1. 病毒标本采集与预处理从疑似患有伪狂犬病的动物中采集脑组织标本，按照常规方法进行处理，提取病毒核酸。

2. 引物设计根据伪狂犬病病毒的基因序列，设计一对特异性引物，分别位于病毒基因组内的两个保守区域，以提高检测的灵敏度和特异性。

3. RT-PCR体系的建立根据之前的研究经验，优化反转录和聚合酶链反应（RT-PCR）的体系，确定最适合该方法的反应条件。

4. 交叉引物扩增实验将病毒核酸模板与交叉引物的反应体系加入RT-PCR体系中，进行扩增实验。

同时，利用传统的PCR检测方法作为对照。

5. 评价指标的确定评价指标包括灵敏度、特异性和重复性。

通过检测不同浓度的病毒标本和无关病毒标本，以及重复检测同一标本来评价该方法的准确性和可靠性。

结果与讨论：1. 引物设计与RT-PCR体系的建立通过基因序列比对和生物软件的辅助，成功设计了一对特异性的引物，并优化了RT-PCR反应体系，确保扩增反应的高效和选择性。

2. 交叉引物扩增实验在扩增实验中，交叉引物能够成功扩增出伪狂犬病病毒的特异性片段，在电泳结果中能够明确检测到目标片段的存在。

同时，传统的PCR方法也能够成功检测到目标片段，说明交叉引物扩增方法的结果是可靠的。

3. 评价指标的确定通过对不同浓度的病毒标本进行扩增实验，发现交叉引物扩增方法对不同浓度的病毒标本的灵敏度较高，能够检测到低至10个病毒拷贝的标本。

同时，对于无关病毒标本的检测，交叉引物扩增方法显示了较高的特异性。

此外，重复实验的结果也表明了交叉引物扩增方法的重复性良好。

结论：本研究成功建立了一种基于交叉引物扩增的检测伪狂犬病病毒的方法，并对其进行了评价。

实时荧光定量pcr的方法
实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）是一种用于精确测量DNA 或RNA样本中特定目标序列数量的分子生物学技术。

该方法结合了传统PCR 技术和荧光探针技术，可以在PCR反应过程中实时监测和定量特定目标序列的扩增量。

实时荧光定量PCR的步骤如下：
1. 准备反应体系：包括特定目标序列的引物和荧光探针、PCR反应缓冲液、酶和DNA模板。

2. PCR反应：将反应体系放入实时荧光定量PCR仪中进行扩增反应。

PCR过程中，引物与DNA模板结合，酶进行DNA合成，目标序列得到扩增。

3. 荧光探针监测：在PCR反应中，荧光探针与目标序列结合，产生荧光信号。

实时荧光定量PCR仪会实时监测和记录荧光信号的强度。

4. 数据分析：实时荧光定量PCR仪会根据荧光信号的强度，通过计算机算法来计算目标序列的起始数量。

可以利用标准曲线法或相对定量法进行数据分析，得到目标序列的绝对或相对数量。

实时荧光定量PCR具有高灵敏度、高特异性、高准确性和广泛线性范围等优点，
广泛应用于分子生物学、医学诊断、基因表达分析等领域。

猪伪狂犬病毒SYBR-Green Ⅰ实时定量PCR检测方法的建立李明凤;魏战勇;郭显坡;贾艳艳;陈红英;王学兵;崔保安【期刊名称】《河南农业大学学报》【年(卷),期】2009(043)003【摘要】利用PCR技术扩增出猪伪狂犬病毒gH基因中187 bp的片段,并克隆到pGEM T栽体上,纯化的质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线.建立了猪伪狂犬病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达1.26×102拷贝·μL-1,与猪圆环病毒,猪细小病毒,猪繁殖与呼吸综合征病毒,猪瘟病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对15份疑似病料进行了检测.发现均为荧光定量PCR阳性,而常规PCR只能检测出6份阳性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRV感染的检测.【总页数】6页(P287-291,301)【作者】李明凤;魏战勇;郭显坡;贾艳艳;陈红英;王学兵;崔保安【作者单位】河南农业大学牧医工程学院,河南郑州,450002;河南省动物性食品安全重点实验室,河南郑州,450002;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州,450002;河南省动物性食品安全重点实验室,河南郑州,450002;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州,450002;河南省动物性食品安全重点实验室,河南郑州,450002;河南省动物性食品安全重点实验室,河南郑州,450002;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州,450002;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州,450002;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州,450002;河南省动物性食品安全重点实验室,河南郑州,450002【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立 [J], 李金磊;王亚宾;崔保安;陈丽颖;张红英;李珂珂;魏战勇2.猪圆环病毒2型SYBR-Green 1实时荧光定量PCR检测方法的建立 [J], 贾艳艳;李明凤;王东方;崔保安;陈红英;魏战勇;吕晓丽;郭显坡3.TTV1与TTV2 SYBR-Green I实时荧光PCR 检测方法的建立和应用 [J], 陈欣;符芳;王伟;李雪松;李海忠;宋淑萍;李曦4.山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用 [J], 张靖鹏;江锦秀;林裕胜;游伟;刘道泉;毛坤明;江斌;胡奇林5.狂犬病病毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立 [J], 陆专灵;何晓霞;谢琳娟;梁湘;唐海波;罗扬;罗廷荣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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