基因克隆鉴定实验报告

２０１３年１月第１　１卷第２期　苦瓜ＭＡＰ３０基因克隆与鉴定　郝林　姜波　韩从辉　庞慧　（１徐州市中心医院泌尿外科，江苏徐州２２１００９；　・实验研究・　５７　何厚光　付昱　张俊杰　张培影　２徐州市中心医院中心实验室，江苏徐州２２１００９）　【摘要】目的克隆苦瓜Ｉ型核糖体失活蛋白ＭＡＰ３０全长基因并构建其表达载体。方法提取苦瓜的基因组ＤＮＡ，根据Ｇｅｎｅｂａｎｋ中已公开　发表的ＭＡＰ３０序列，设计出一对特异性引物。采用ＰＣＲ技术，从苦瓜的基因组ＤＮＡ中获得ＭＡＰ３０全长序列共８６０ｂｐ，克隆入ｐＥＴ－２８ａ（＋）　载体中，进行酶切及测序鉴定。结果克隆了ＭＡＰ３０全长基因，经测序证实与Ｇｅｎｂａｎｋ中收录的ＳＥＡ基因序列同源性迭１００％。结论本　研究成功地克隆了ＭＡＰ３０全长基因，为进一步研究ＭＡＰ３０基因的靶向抗肿瘤研究奠定了基础。　【关键词】苦瓜ｉ型核糖体失活蛋白；载体构建；序列分析　中图分类号：Ｒ３９４　文献标识码：Ｂ　文章编号：１６７１—８１９４（２０１３）０２－００５７－０２　苦瓜（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ　ｃｈａｒａｎｔｉａ，ＭＣ）为葫芦科苦瓜属植物，是一种　药食同源的植物，其根、茎、叶、花、果实、种子皆可人药。具有清　热解毒、降低血糖、抗突变、抗ＨＩＶ、抗肿瘤、抗生育、抗菌、免疫　调节等作用。苦瓜的活性成分种类繁多，包括苦瓜Ｉ型核糖体失活蛋　白（ＭＡＰ３０）、三萜类、生物碱类、甾类化合物、糖类、有机酸类及　微量元素等。ＭＡＰ３０是苦瓜中相对分子质量为３００００的抗获得性免疫　缺陷综合征病毒的蛋白质，它属于单链Ｉ型核糖体失活蛋白（ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＲＩＰ）家族Ⅲ，此类蛋白普遍存在于高等植物中，因　可使真核细胞核糖体失活而得名，它具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌等多　种生物活性。由于ＭＡＰ３０抗肿瘤活性强、毒性低，已成为近年抗癌药　物研究的热点。本研究克隆苦瓜Ｉ型核糖体失活蛋白（ＭＡＰ３０）全长　基因，为进一步研究ＭＡＰ３０基因片段在抗肿瘤中的作用提供了实验基　础。　１材料与方法　１．１材料　幼嫩苦瓜１个，大肠埃希菌ＤＨ５ａ和质粒ｐＥＴ－２８ａ（＋）为Ｓａｎｇｏｎ公　司产品。Ｔ４ＤＮＡ连接酶，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶，限制性内切酶ＢａｍＨ　Ｉ、　Ｘｈｏ　Ｉ均购自Ｔａｋａｒａ公司，质粒小量提取试剂盒购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，其　余试剂均为分析纯。　１．２苦瓜ＭＡＰ３０基因的扩增　①引物设计：根据ＮＣＢＩ上的序列设计扩增引物：Ｆｏｒｗａｒｄ：　５’．ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＴＴＡＣＴＡＣ．３’ｌ　Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’．ＣＣ　ＧｃＴＣＧＡＧＡＴＴＣＡｃＡＡＣＡＧＡＴＴＣｃ－３’，其中红色部分分别为限制性　内切酶ＢａｍＨ　Ｉ、Ｘｈｏ　Ｉ酶切位点序列。②模板制备：刮取幼嫩苦瓜瓜　皮，于液氮中研磨，按照植物基因组ＤＮＡ提取试剂盒进行苦瓜基因组　提取。￣ＰＣＲ扩增ＭＡＰ３０全长基因。④ＰＣＲ产物回收：用１％琼脂糖凝　胶电泳对ＰＣＲ产物进行分离，并用Ａｘｙｇｅｎ公司的琼脂糖凝胶ＤＮＡＮ收　试剂盒回收目的基因片段。　以上述所得基因组为模板，以ｐＦ和ｐＲ为引物，扩增ＭＡＰ３０全长基　因，反应体系如表１。　反应条件：９５℃预变性５ｍｉｎ；９５℃变性３０ｓｅｅ，６０Ｃ退火３０ｓｅｃ，　７２＇（２延伸２ｒａｉｎ，共３５个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。　１＿３将目的基因连接到载体ｐＥＴ－２８ａ（＋）　基金项目：中医药管理局项目资助（ＬＺ１　１　１　３４）；徐州Ｉ市科技计划　项目（ＸＺＺＤ１　０５０）　・通讯作者：Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｐｙｉｎｇ５８＠１　２．６．ｃｏｍ　表１　ＰＣＲ扩增ＭＡＰ３０基因的反应体系　成分　体积　模板　上游引物（１０　Ｍ）　下游引物Ｐ（１０“Ｍ）　２　Ｘ　Ｔａｑ酶ＰＣＲ反应混合物　２１１ｄｄＨ：Ｏ至总体积　１　Ｌ　１　Ｕ　Ｌ　１“Ｌ　２５　ｕ　Ｌ　５０　Ｌ　将ＭＡＰ３０目的基因的ＰＣＲ产物与ｐＥＴ－２８ａ（＋）载体酶切产物进　行连接，１６＂（２反应过夜。转化ＤＨ５ａ感受态细胞，涂氨苄抗性平板，　３７＂Ｃ过夜培养，筛选克隆，反应体系如表２。　表２　ＰＣＲ）￣物ｐＥＴ－２８ａ（＋）的连接反应　成分　体积　ｐＥＴ－２８ａ（＋）载体　ＭＡＰ３０基因　２×Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　￣１］ｄｄＨ２Ｏ至总体积　８　Ｈ　Ｌ　１“Ｌ　２　Ｌ　２０　Ｌ　１．４重组质粒的酶切鉴定和序列测定　对重组质粒进行酶切鉴定，反应体系如表３。　表３　ｐＥＴ－２８ａ（＋）一ＭＡＰ３０酶切反应体系　成分　体积　１０×缓冲液　重组质￣．ＤＮＡ　ＢａｍＨＩ　Ｘｈｏ１Ｉ　｝ｇｌｄｄＨ２Ｏ至总体积　２　ｕＬ　１Ｏ　ｕＬ　０．５　ｕＬ　０．５　ｕＬ　２０¨Ｌ　３７℃作用２ｈ后１％琼脂糖凝胶电泳分析，各选择酶切鉴定正确的　两个克隆送Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司测序。　２结果　苦瓜ＭＡＰ３０基因的克隆：根据ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋ上公布的ＭＡＰ３０全　基因序列，在ＭＡＰ３０基因阅读框起始与末尾设计引物，ＰＣＲ扩增目的　基因。目的基因片断长度约为８６０ｂｐ，与理论值相符。　３讨论　Ｉ型核糖体失活蛋白（ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＲＩＰ）是一种强　碱性单链蛋白质，主要富集在苦瓜种子、根、茎及叶中，具有抗肿瘤　和抗病毒等生物学活性。此类蛋白的主要功能是Ｎ—ＲＮＡ糖苷酶活性及　切断ＤＮＡ超螺旋活性，故核糖体失活蛋白可能具有类ＳＯＤ活性。研究　表明，ＭＡＰ３０对许多肿瘤细胞有较强的抑制作用。Ｐａｒｋ￣ｔＴｌ发现ＭＡＰ３０　对许多类型病毒感染的细胞、肿瘤细胞非常有效，而对未感染的人正　常细胞，包括Ｔ２细胞、巨噬细胞、单核细胞以及非肿瘤患者的血、肾　脏、肝脏、神经、精子细胞、皮肤细胞和胚胎细胞等均无毒性。

一、实验目的

本研究旨在通过骨髓克隆实验，探讨骨髓间充质干细胞（hMSC）的克隆形成能力及其在软骨组织工程中的应用可能性。同时，研究永生化hMSC的致瘤性，为其在临床应用中的安全性提供理论依据。

二、实验材料与方法

1. 实验材料

（1）骨髓来源：选取健康志愿者，采集骨髓。

（2）试剂与仪器：双层软琼脂培养基、细胞培养皿、流式细胞仪、显微镜、CO2培养箱等。

2. 实验方法

（1）骨髓间充质干细胞（hMSC）的分离与培养

①骨髓单核细胞分离：将骨髓液注入含有肝素抗凝剂的离心管中，低速离心分离骨髓单个核细胞（BMNC）。

②hMSC培养：将BMNC接种于培养皿中，加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基，置于CO2培养箱中培养。

（2）永生化hMSC的建立

①永生化hMSC的建立：通过转基因技术，将永生化基因（如SV40 T抗原）转染至hMSC中，建立永生化hMSC。

②永生化hMSC的筛选与培养：筛选出永生化hMSC，将其接种于培养皿中，继续培养。

（3）克隆形成实验

①细胞悬液制备：将hMSC和永生化hMSC分别制成细胞悬液。

②双层软琼脂培养：将细胞悬液接种于双层软琼脂培养基中，置于CO2培养箱中培养。

③克隆形成率计算：2周后观察克隆形态，计算克隆形成率。

（4）致瘤性实验 ①细胞接种：将hMSC和永生化hMSC分别接种于裸鼠背部皮下。

②观察成瘤情况：术后3天、1个月和3个月观察成瘤情况。

三、实验结果

1. hMSC表型鉴定

通过流式细胞仪检测，hMSC表面抗原CD34、CD45表达阴性，CD73、CD90、CD106表达阳性。

2. 克隆形成实验

hMSC未能在软琼脂中形成克隆，永生化hMSC克隆形成率为3%。

3. 致瘤性实验

永生化hMSC接种裸鼠后3天，接种部位有细胞聚集的团块，1个月和3个月时均未见肿瘤形成。

四、讨论

1. 骨髓间充质干细胞（hMSC）的克隆形成能力

本研究结果表明，hMSC在软琼脂中无法形成克隆，而永生化hMSC克隆形成率为3%。这表明永生化基因的转染提高了hMSC的克隆形成能力，为软骨组织工程中种子细胞的选择提供了依据。

第1篇

一、实验目的

1. 掌握基因合成的基本原理和操作步骤。

2. 熟悉基因合成仪器的使用方法。

3. 了解基因合成的应用领域。

二、实验原理

基因合成是指利用化学方法，按照特定的DNA序列，合成出具有生物学活性的DNA片段。该技术是现代生物技术领域的重要手段之一，广泛应用于基因克隆、基因编辑、基因治疗等领域。

基因合成的原理基于DNA双螺旋结构和碱基互补配对原则。在实验过程中，首先根据设计好的基因序列，合成相应的寡核苷酸引物；然后，通过PCR技术扩增目的基因；最后，将扩增的目的基因克隆到载体上，进行后续的实验操作。

三、实验材料

1. 基因合成仪

2. PCR仪

3. DNA序列分析软件

4. DNA合成试剂

5. PCR试剂

6. 载体DNA

7. 质粒提取试剂盒

8. 琼脂糖凝胶电泳试剂盒

9. DNA连接酶

10. DNA标记物

四、实验步骤 1. 设计基因序列：根据实验目的，设计目的基因的DNA序列，并利用DNA序列分析软件进行优化。

2. 合成寡核苷酸引物：根据设计好的基因序列，合成相应的寡核苷酸引物。

3. PCR扩增目的基因：将合成的寡核苷酸引物、模板DNA、PCR试剂等混合，进行PCR扩增。

4. 琼脂糖凝胶电泳检测：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，观察目的基因的扩增情况。

5. 质粒提取：将PCR产物克隆到载体上，进行质粒提取。

6. DNA连接：将质粒与目的基因进行连接。

7. 转化：将连接后的质粒转化到宿主细胞中。

8. 筛选阳性克隆：通过PCR、测序等方法筛选出含有目的基因的阳性克隆。

9. 阳性克隆的验证：对阳性克隆进行DNA测序，验证目的基因的正确性。

五、实验结果与分析

1. PCR扩增结果：通过琼脂糖凝胶电泳检测，观察到目的基因的扩增条带，表明目的基因已成功克隆。

2. 阳性克隆的筛选：通过PCR和测序，筛选出含有目的基因的阳性克隆。

3. 阳性克隆的验证：DNA测序结果表明，目的基因序列与设计序列一致，验证了目的基因的正确性。

1 山羊基因克隆实验方案设计

第五组

1. 提取DNA

2. DNA检测（电泳）

3. 目的DNA片段基因扩增（PCR）

4. DNA检测（电泳）

5. 目的基因片段与载体连接

6. 大肠杆菌感受态细胞的制备

7. 导入受体细胞与蓝白斑筛选

8. 阳性克隆鉴定

9. DNA测序

一、 DNA提取

【实验目的】

指导DNA提取原理（羔羊片），熟悉DNA提取步骤。

【实验原理】

组织细胞被PK消化后，经过萃取漂洗获得纯净DNA。

【实验步骤】

1. ＜30 mg组织，用眼科剪剪碎，加入200 TL buffer＋20 μL PK，55℃水浴1-3 h。

2. 加入220 μL buffer BL，振荡15 s，70 ℃放置10 min，溶液变清亮。

3. 10000 r离心2 min，移上清液至新离心管。

4. 加220 μL无水乙醇，充分振荡15 s，可能会出现絮状沉淀。

5. 将溶液和絮状物加入到吸附柱中，12000 r离心30 s，弃废液。

6. 向吸附柱加入500 μL WB，12000 r离心30 s，弃废液。

7. 向吸附柱加入500 μL wash buffer，12000 r 离心30 s，弃废液，空滤一次。

8. 将吸附柱转入干净离心管，加入50 μL TE，放置5 min，12000 r离心2 min，备检。

二、 DNA电泳检测

【实验原理】

琼脂糖凝胶电泳技术是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。凝胶分辨率决定于使用材料的浓度，并由此决定凝胶的孔径。琼脂糖凝胶可分辩0.1~6.0kb的双链DNA片段。琼 2 脂糖凝胶电泳是一个电场作用。它首先利用琼脂糖的分子筛效应，此外，在弱碱性条件下，DNA分子带负电荷，从负极向正极移动。根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同，它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。借助溴化乙锭（EB）能与双链DNA结合的作用，利用EB染色，并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。