排阻色谱分离原理

Authors

Xueying Huang Xiaomi Xu Haiying Chen Sepax Technologies, Inc. 5 Innovation Way Newark, DE 19711 USA

Size Exclusion Separation of Protein

Mixtures: Comparison of Sepax SRT®

SEC Columns and Tosoh TSKgel®

Columns

Protein Separation

Abstract

There are increasing numbers of biological large molecules such as

proteins and antibodies manufactured as pharmaceutical therapeutics. It

is often a challenge to separate these molecules from lysates and partially

purified protein mixes, or differentiate them from variants with different

post- translational modifications. The data presented here focus on the

use of analytical SRT® SEC 150 and 300Å pore sizes with 5 m particle

size to separate several commercially available proteins with different

molecular weights. The separation performance is compared with that of

1简要说明凝胶渗透色谱（GPC）的分离原理

答：分离主要机理包括: 体积排除理论，扩散理论，流体力学理论

最常用的原理是体积排除理论：让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行的路径有粒子间的间隙（较大）和粒子内的通孔（较小）。当聚合物溶液流经色谱柱时，较大的分子被排除在粒子的小孔之外，只能从粒子间的间隙通过，速率较快；而较小的分子可以进入粒子中的小孔，通过的速率要慢得多。经过一定长度的色谱柱，分子根据相对分子质量被分开，相对分子质量大的在前面（即淋洗时间短），相对分子质量小的在后面（即淋洗时间长）。自试样进柱到被淋洗出来，所接受到的淋出液总体积称为该试样的淋出体积。 当仪器和实验条件确定后，溶质的淋出体积与其分子量有关，分子量愈大，其淋出体积愈小。

根据这一观点，色谱柱的总体积分为三部分：Vg表示载体的骨架体积；Vi表示载体内部所有孔洞的体积；Vo表示载体的粒间体积，那么，色谱柱内总体积：Vt = Vo + Vi + Vg（其中Vo + Vi构成柱内的空间）

对于溶剂分子来说，因它的体积很小，可以充满柱内的全部活动空间Vo + Vi；

而对于高分子来说，假若高分子的体积比孔洞的尺寸大，任何孔洞都进不去，那么它只能从载体的粒间流出，其淋出体积为Vo。假若高分子体积很小，远远小于所有孔洞尺寸，它在柱中活动空间与溶剂相同，淋出体积为Vo + Vi。假若高分子的体积是中等大小，高分子可以进入大的孔，而不能进入小的孔，其淋出体积介于Vo和Vo+Vi之间

这种不考虑溶质和载体之间的吸附效应以及溶质在流动相和固定相之间的分配效应，淋出体积仅仅由溶质分子大小和载体孔尺寸决定，分离完全是由于体积排除效应所致，故称为体积排除机理。

1简述亲和色谱分离技术的基本原理？

答：亲和色谱是利用亲和吸附作用分离纯化生物物质的液相色谱法。亲和色谱的固定相是键和亲和配基的亲和吸附介质。由于目标产物基于生物亲和作用吸附在固定相上，具有高度选择性，因此，亲和色谱操作与一般的固定床吸附操作方式相似，多采用断通式前端方法。

一般亲和色谱分离操作过程分： 1进料 2杂志清洗 3目标产物脱洗 4色谱柱再生。

2、举例简述亲和色谱分离蛋白的流程？

因为：三嗪类色素配基的特点是化学稳定性高，价格便宜，适应性广，亲和力适中，蛋白质结合容量大，因此，色素亲和色谱的操作成本低廉，有很高的实用价值。

答：以色素亲和色谱纯化脱氢酶为例：

1 加入3L菌体细胞抽提液；

2 用低溶度盐溶液A清洗，除去未被吸附的杂蛋白；

3 逐次到溶度盐溶液B和辅酶I溶液C洗脱，分别获得了羟基酪酸脱氢酶（3-HDH）和苹果酸脱氢酶（MHM）活性峰；

4 收集的3-HDH活性部分超滤浓缩至200ml后透析脱盐；

5 加入到另一个色素亲和柱，继续进行纯化；

6 经过两步色素亲和色谱纯化，3-HDH比活提高213倍（第一步34.4倍，第二部6.2倍）最终收率为78%。

A---10mmol/L磷酸盐缓冲液，PH=7.5(5L)

B----A液+1.0mmol/LKCl，PH=7.5(5L)

C----B液+2mmol/L NADH, PH=7.5(3L)

一. 分离原理

尺寸排阻色谱法：是按分子尺寸的差异进行分离的一种液相色谱方法，也称凝胶色谱法。

排阻色谱的固定相多为凝胶。凝胶是一种由有机分子制成的分子筛 , 其表面惰性 , 含有许多不同大小孔穴或立体网状结构。凝胶的孔穴大小与被分离组分大小相当 , 对不同大小的组分分子则可分别渗到凝胶孔内的不同深度。尺寸大的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内 ,

但进不了小孔 , 甚至于完全被排斥，先流出色谱柱。尺寸小的组分分子, 大孔小孔都可以渗进去, 最后流出。因此 , 大的组分分子在色谱柱中停留时间较短, 很快被洗出。小的组分分子在色谱柱中停留时间较长。经过一定时间后, 各组分按分子大小得到分离。

当组分X进入柱子后,它就要从高浓度的流动相向固定相孔隙内的流动相扩散。当组分X进入色谱固定相达到扩散平衡时：

Xm ⇌ Xn

组分的分配系数为：

尺寸排阻色谱中任何组分的分配系数应符合：0 ≤ K ≤ 1

二. 固定相

尺寸排阻色谱常用固定相有无机和有机两大类。

无机凝胶：又称硬质凝胶。是具有一定孔径范围的多孔性凝胶，如多孔硅胶、多孔玻璃珠等，此类凝胶化学惰性、稳定性及机械强度均好，耐高温，使用寿命长，但装柱时易碎，不易装紧，柱效较低。

有机凝胶：又称半硬质凝胶。如苯乙烯二乙烯苯交联共聚物凝胶，能耐较高压力，适用于有机溶剂作流动相，有一定可压缩性，可填得紧密，柱效较高。但在有机溶剂中有轻度膨胀。新型凝胶色谱填料，克服了传统软填料的一些弱点，粒度细，机械强度高，分离速度快，效果好，特别是无机填料表面键合亲水性单分子层或多层覆盖的单糖或多糖型等填料广泛用于生物大分子的分离。

三. 流动相

尺寸排阻色谱流动相：从样品的溶解性考虑，流动相应与凝胶本身有相似性，黏度低，与样品的折光率相差大;能润湿凝胶，防止吸附作用。

常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、N，N’-二甲基甲酸胺、三氯甲烷(凝胶渗透色谱);水(凝胶过滤色谱)等。