榛蘑粗多糖提取工艺的研究

榛蘑粗多糖提取工艺的研究李巧云,　翟　春,　居红芳,　葛粉凤(常熟高等专科学校化学系,江苏常熟215500)摘　要:对榛蘑中可溶性粗多糖的提取工艺进行了研究,通过单因素试验和L 9(33)正交试验,研究了料液比、温度、时间对多糖提取率的影响,结果显示温度和料液比是影响多糖提取率的主要因素,最佳工艺为料液比1∶25,温度100°C ,时间4h ,在最佳提取工艺时,榛蘑的多糖提取率为4.37%。

对常用的醇析方法进行改进,在传统Sevag 法除蛋白的基础上采用Sevag 法结合酶法除蛋白,大大缩短了除蛋白时间,又用改良的蒽酮—硫酸法测定多糖含量。

关键词:榛蘑;可溶性多糖;提取工艺中图分类号:O 629.12 文献标识码:A 文章编号:036726358(2004)0720372204Study on the Ex tracti on T echno logy of Po lysaccharidefrom A ri m illaria M elleaL I Q iao 2yun ,　ZHA I Chun ,　JU Hong 2fang ,　GE Fen 2feng(D ep art m ent of Che m istry ,Chang shu Colleg e ,J iang su Chang shu 215500,Ch ina )Abstract :T he ex tracti on of p lysaccharide from ari m illaria m ellea w as studied .Single facto r test and o r 2thogonal exp eri m en t design m ethod (L 9(33)w ere app lied to analyze the influence of facto rs such as so lid 2liqu id rati o ,tem p eratu re and ti m e on the ex tracti on p ercen t of the po lysaccharides .Exp eri m en tal resu lts indicated that tem p eratu re and so lid 2liqu id rati o sign ifican tly affect the ex tracti on p ercen t of the so lub le po lysaccharides .T he op ti m um so lid 2liqu id rati o is 1∶25,tem p eratu re is 100°C and the ex tracti on ti m e is 4hou rs :U uder these conditi on s ,the ex tracti on p ercen t of so lub le po lysaccharides from ari m illaria m ellea is 4.37%.In additi on ,the traditi onal m ethod of p reci p itating po lysaccharides w ith alcoho l w as i m p roved .T he Sevag m ethod com b ined w ith the enzym e m ethod w as adop ted to get rid of p ro tein w h ich seves ,a lo t of ti m e .A lso ,the po lysaccharide w as determ ined by an i m p roved an th ro ic ketone 2su lp hu ric acid m ethod .Key words :ari m illaria m ellea ;so lub le po lysaccharide ;ex tracti on techno logy收稿日期:2003207221;修回日期:2003210220作者简介:李巧云(1961～),女,副教授,主要从事教学和研究工作。

多糖是由单糖基通过糖苷键连接而成的化合物,越来越多的研究证明,多糖不但能治疗使机体的免疫系统受到严重损伤的癌症,还能治疗多种免疫缺损疾病,如慢性病毒肝炎和某些细菌和病毒引起的慢性疾病,还能治疗风湿病之类的疾病,有的多糖还能诱导干扰素的产生。

总之,多糖具有调节免疫功能、抗肿瘤、抗病毒病菌、降血糖血脂、抗溃疡等作用。

目前多糖的分离分析仍是比较活跃的研究领域。

现代医学研究表明,榛蘑具有抗癌防癌、防治病毒性疾病、降低胆固醇、防止动脉硬化、稳定血压等功能,故是一种理想的医疗保健品。

本文所选用的榛蘑是纯天然野生的,它们生长在黑龙江省东经137°北纬47°地带,从榛磨中提取粗多糖工艺的研究还鲜见报道。

近年来对多糖提取工艺的研究方法较多[3,4～6],如热水浸提法、稀碱液浸提法、稀酸液浸提法。

但因为稀酸、稀碱条件下,易使多糖发生糖苷键的断裂,部分多糖发生水解而使多糖的提取率减少,因此本文采用热水浸提法。

1　实验部分1.1　主要材料、试剂及仪器榛蘑:产于黑龙江三江平原地区,自采。

无水乙醇、95%乙醇、丙酮、无水乙醚、蒽酮、浓硫酸、葡萄糖、三氯甲烷、甲苯、正丁醇(均为分析纯);国产木瓜蛋白酶:生化试剂,上海蓝季科技有限公司。

D S21高速组织捣碎机:上海标本模型厂;SH Z2 C型循环水多用真空泵:河南省巩义市站街光亚仪器厂;电热恒温干燥箱:上海跃进医疗器械厂;数显恒温水浴锅:常州国华电器有限公司;721型分光光度计:上海精密科学仪器有限公司;FT I R28700红外光谱仪:日本岛津制作所。

1.2　多糖的提取流程将榛蘑原料水洗,在60°C烘干后将其粉碎,用无水乙醇回流脱脂,再在60°C时干燥,然后加入一定量的水,在一定温度下进行一定时间的提取,提取液经过减压浓缩得浓缩液,浓缩液进行除蛋白透析后,用3倍量95%(质量分数)乙醇醇析得粗多糖沉淀,抽滤,沉淀分别用无水乙醇、无水乙醚、丙酮依次洗涤,真空干燥后得除蛋白粗多糖产品。

1.3　多糖含量的测定本实验采用蒽酮—硫酸法测定总的多糖含量[1,2]。

蒽酮—硫酸法是利用糖类遇浓硫酸脱水生成糖醛或其衍生物,可与蒽酮试剂缩合产生有色物质,反应后溶液呈蓝绿色,于620nm处有最大吸收。

本实验先利用标准糖溶液和其用蒽酮试剂处理后在620nm处的吸光度制作标准曲线,再测定待测样品溶液的吸光度,根据回归方程计算相应的浓度从而求出多糖含量。

1.4　粗多糖中蛋白质的去除本实验采用酶法结合Sevag法脱蛋白。

Sevag 是利用蛋白质遇有机溶剂变性而不溶于水的特点而分离除去,酶法是利用植物蛋白酶在一定条件下将植物蛋白降解而除去。

按多糖提取液1%(质量分数)的比例向提取液中加入木瓜蛋白酶,同时加入1滴甲苯防腐,于39°C保温48h,将适当浓缩的提取液加入到分液漏斗中,再按提取液体积的1 5的量加入Sevag溶液(三氯甲烷∶正丁醇=4∶1,体积比),振荡,静置,分离,直至无乳白色变性蛋白质析出为止。

1.5　小分子杂质的去除利用溶液浓度扩散效应,将相对分子质量小的物质如无机盐、低聚糖等从透析袋渗透到袋外的蒸馏水中,不断换水即可保持浓度差,从而除尽小分子杂质。

根据多糖溶液的体积截取相应长度的透析袋,用透析夹夹住一端,灌入多糖液,离液面2～3c m处夹紧透析袋,置于一大烧杯中,采用逆向流水透析法透析。

1.6　多糖的初步鉴定将提取的榛蘑粗多糖分别与KB r以1∶100比例混合研细后,以KB r为本底,在4000～400c m-1波数范围内测定其红外光谱图。

2　结果与讨论2.1　多糖含量的测定在实验条件下,以浓度(C)为横坐标,以吸光度(A)为纵坐标作图,得标准曲线。

回归方程为:A=5.1964C+0.0345(相关系数r=0.9998)多糖提取率=(V×C×f×W2 W3×W1)×100%W1:称取干样品的质量(g)W2:由W1提取的粗多糖的质量(g)W3从W2中称取的用于分析测定的粗多糖质量(g)V:溶解W3定容后的体积(L)f:多糖的校正系数[1],f≈0.9C:由回归方程计算所得多糖的浓度(g L)2.2　热浸提的料液比、温度、时间单因素对榛蘑可溶性多糖提取率的影响热浸提工艺涉及三个关键条件:热浸提的料液比、热浸提的温度和热浸提的时间。

料液比(干燥样品的质量与水的质量之比)采用1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40五个水平,浸提温度采用85、90、95、100°C四个水平,浸提时间采用3、4、5、6、7h五个水平分别进行单因素试验。

2.2.1　料液比的影响改变料液比对多糖提取率影响如图1所示。

试验结果显示:料液比的上升会增加多糖的溶出量,1∶25以后,上升的幅度趋于平缓。

2.2.2　温度的影响改变温度对多糖提取率的影响如图2所示。

温度单因素试验表明:温度对榛蘑多糖的提取率有显著的影响,温度的上升伴随着多糖提取率的显著上升,在100°C条件下多糖的提取率几乎是85°C时提取率的两倍。

图1　料液比对榛蘑多糖提取液的影响图2　温度对榛蘑多糖提取率的影响2.2.3　时间的影响改变时间对多糖的提取率的影响如表1所示。

表1　时间对多糖提取率的影响时间 h榛蘑中多糖的提取率 %33.3244.1354.1764.1974.20 时间单因素试验显示:随着热浸提时间的增加,榛蘑中多糖提取率也有所增加,但4h 以后增加趋势缓慢。

2.3　热浸提榛蘑中可溶性多糖提取率的正交试验2.3.1　正交试验设计和结果的直观分析在上述单因素试验的基础上,选定3因素3水平作正交试验,因素水平、试验结果计算及分析见表2。

从表2可知,提取温度是影响多糖提取率的最关键因素,其次是物料比,在实验范围内,时间的影响最小。

2.3.2　正交试验的方差分析结果正交试验的方差分析结果如表3所示:温度的差异显著对榛蘑多糖提取率的影响起最主要作用,料液比和时间在此实验范围内没有显著性差异,对测定结果的影响较小。

这与直观分析结果是相吻合　的。

2.3.3　正交试验多重性比较[7](1)料液比各水平间差异显著性SSR 比较表4的SSR 检验显示:3和1差异显著,故料液比的最佳工艺参数选1∶25表2　正交试验结果试验因素料液比A温度B °C 时间C h榛蘑中多糖的提取率 %11∶208541.5421∶209562.7431∶2010083.2441∶258561.7251∶259583.0261∶2510044.1371∶308581.9181∶309543.1991∶3010064.37K{17.525.178.86K {28.878.959.83K {39.4711.748.17优水平A3B3C 2K {12.5071.3902.953K{22.9572.9833.273K {33.1573.9132.723R i0.6502.5230.550主次顺序BAC表3　正交试验的方差分析差异来源dfS SS 2FF 0.05F 0.01A (料液比)20.66500.33255.82319.0099.00B (温度)27.24863.624363.473319.0099.00C (时间)20.10140.05070.888019.0099.00误差20.11420.0571总变异8.1292表4　料液比各水平间差异显著性SSR 检验处理平均数Α=0.05Α=0.0133.157a A 22.957ab A 12.507aA (2)温度各水平间差异显著性SSR 比较表5的SSR 检验显示:控制提取温度非常重要,三个水平间都有显著差异和极显著差异,故选平均值最大的,即温度最佳工艺参数为100°C 。