某奶牛场牛乳源金黄色葡萄球菌的分离鉴定与耐药性调查

山西农业科学２０１６，４４（１Ｉ）：１６９６—１６９８，１７２８　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｈａｎｘｉ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　

ｄｏｉ：１０．３９６９０．ｉｓｓｎ．１００２—２４８１．２０１６．１　１．２８　

某奶牛场牛乳源金黄色葡萄球菌的分离鉴定与耐药性调查　

韩淑芳，刘一飞，王国艳，王志宇，马　馨，梁佶宇，李　希　

（山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原０３００３２）　

摘要：从山西某奶牛场随机采集２５份奶样，进行细菌分离培养、染色镜检、Ｈ：０：酶试验鉴定，并对其进行了９种　药物的敏感性试验。结果表明，从２５份奶样中分离出ｌ８株金黄色葡萄球菌；这１８株金黄色葡萄球菌对多种药物　呈现出耐药性，其中，对阿莫西林耐药率最高，达７７．８％，对卡那霉素、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、氧氟沙星、　磷霉素、头孢曲松的耐药率介于１１．１％～４４．４％，对左氧氟沙星的耐药率最低，为５．６％。说明金黄色葡萄球菌为该　奶牛场奶牛乳房炎的主要致病菌，该场奶牛对９种抗生素产生了普遍的耐药性，建议该奶牛场以体外药物敏感试　验为参考，进一步扩大药物的筛选范围，选择更多敏感药物进行治疗。　关键词：牛乳；金黄色葡萄球菌；分离鉴定；耐药性　中图分类号：￥８５８．２３　文献标识码：Ａ　文章编号：１００２—２４８１（２０１６）１１－１６９６—０４　

Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　Ｓｕｒｖｅｙ　ｏｆ　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　

ａｕｒｅｕｓ　ｆｒｏｍ　Ｍｉｌｋ　ｉｎ　ａ　Ｄａｉｒｙ　Ｆａｒｍ　

ＨＡＮ　Ｓｈｕｆａｎｇ，ＬＩＵ　Ｙｉ　ｉ，ＷＡＮＧ　Ｇｕｏｙａｎ，ＷＡＮＧ　Ｚｈｉｙｕ，ＭＡ　Ｘｉｎ，ＬＩＡＮＧ　Ｊｉｙｕ，ＬＩ　Ｘｉ　（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ　ａｎｄ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ，Ｓｈａｎｘｉ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｈｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔａｉｙｕａｎ　０３００３２，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：２５　ｍｉｌｋ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ａ　ｄａｉｒｙ　ｆａｒｍ　ｉｎ　Ｓｈａｎｘｉ　ｐｒｏｖｉｎｃｅ，ｍｅａｎｗｈｉｌｅ　ｓｏｍｅ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　ｓｕｃｈ　ａｓ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ，ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ，Ｈ２０２　ｅｎｚｙｍｅ　ｔｅｓｔ，ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　９　ｄｒｕｇｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．　Ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　１８　Ｓ　ｏ２ｚｒｅｌｌ￣ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｆｒｏｍ　２５　ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ　ｃｏｌｏｎｉｅｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　１８　Ｓ．ｏｌｚｒｅ１２３　ｓｔｒａｉｎｓ　ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｓｔｒａｉｎｓ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ａｌｌ　Ｓ．ａｕｒｅｕｓ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｔｏ　ａｍｏｘｉｃｉｌｌｉｎ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ．ｕｐ　ｔｏ　７７．８％．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｒａｔｅｓ　ｗｅｒｅ　１１．１％　４－４％，ｔｏ　ｋａｎａｍｙｃｉｎ，ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ，ａｍｉｋａｃｉｎ，ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ｆｏｓｆｏｍｙｃｉｎ　ａｎｄ　ｃｅｆｏｘｉｔｉｎ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｌｏｗｅｓｔ．ｏｎｌｙ　５．６％．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　Ｓ．ｏ２ｚｒｅｕｓ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｏｆ　ｂｏｖｉｎｅ　ｍａｓｔｉｔｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄ由ｆａｒｍ，ａｎｄ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　９　ｄｒｕｇｓ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｓｈｏｕｌｄ　ｂｅ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｒｕｇ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｔｅｓｔ　ｔＯ　ｓｅｌｅｃｔｅ　ｍｏｒｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｄｒｕｇｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｍｉｌｋ；Ｓｔａｐｈｆｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　

奶牛乳房炎是当前奶牛群中普遍流行的疾病，　

业已成为导致奶牛业严重损失的主要疾病之一。引　起奶牛乳房炎的病原菌种类较为复杂，常因地域、季　节及饲养管理水平的差异而呈现出不同种类、不同　

比例的病原菌感染。而金黄色葡萄球菌目前仍是引　起奶牛乳房炎的主要病原菌之一，甚至占到奶牛乳　房炎中病原体的５０％以上【１ｊ。奶牛乳房感染金黄色　

葡萄球菌常导致奶牛产生急性、亚急性和慢性感染　症状。据报道，在奶牛场中，临床型乳房炎的发病率　

为２％一８％，隐性乳房炎的发病率更高，并且难以　自愈［２－３１。该菌属可侵害奶牛乳房上皮细胞引起严重　

的纤维性炎症，并影响腺泡的分泌功能，使产奶量　

急剧下降；还可产生多种毒素污染乳汁，经煮沸消　毒仍不能将其灭活。饮用金黄色葡萄球菌污染的牛　

奶，会导致剧烈的呕吐、腹泻和发热病症。因此，该菌　的传播对奶牛健康和食品安全造成了严重威胁［３－９１。　目前，临床治疗金黄色葡萄球菌感染的主要措　

施仍是运用各类抗生素，但由于抗生素的超剂量和　频繁使用，使其耐药谱不断扩大，产生的多重耐药　情况越来越普遍，常使得临床治疗面临无药可用的　

困境，进而导致其将耐药性由奶源传递给人类，给　公共卫生带来严重隐患［５，ｌＯ－Ｌ４］。　本研究从山西省某奶牛场送检的２５份牛乳　中，经细菌培养和染色镜检初步分离出１８株金黄　

色葡萄球菌，并对其进行了药敏试验，旨在了解该　奶牛场流行菌株的耐药情况，并为临床治疗奶牛乳　

收稿日期：２０１６—０６—１６　基金项目：山西省农业科学院攻关项目（ＹＧＧ１４２７）　作者简介：韩淑芳（１９７９一），女，山西左云人，助理研究员，主要从事畜禽养殖技术研究工作。刘一飞为通信作者。　

・１６９６・

　韩淑芳等：某奶牛场牛乳源金黄色葡萄球菌的分离鉴定与耐药性调查　

房炎的抗生素筛选提供借鉴。　

１　材料和方法　

１．１　试验材料　

乳样：山西省某奶牛场送检的分别从２５头疑　患乳房炎的奶牛采集到的２５份牛乳各５～ｌ０　ｍＬ。　

菌株：质控菌株（金黄色葡萄球菌ＡＴＣＣ２５９２３），　

购自中国兽医药品监察所。　培养基：普通琼脂平板、营养肉汤，购自北京奥　

博星生物技术有限责任公司；血液琼脂平板，购自　

郑州安图生物　程股份有限公司。　药敏纸片：其包括环丙沙星、阿莫西林、氧氟沙　

星、卡那霉素、阿米卡星、磷霉素、头孢曲松、左氧氟　沙星、庆大霉素共９种，购自中国兽医药品监察所。　

１．２方法　１．２．１　乳样细菌的分离培养和形态观察无菌吸　取０．５　ｍＬ各乳样，分别加入５　ｍＬ的肉汤培养液　

中，于３７℃温箱培养ｌ８～２４　ｈ，观察肉汤浊度。再　

用接种环蘸取菌液划线接种于普通琼脂平板，３７　ｑＣ　培养ｌ８～２４　ｈ，观察菌落颜色、形态。挑取疑似葡萄　

球菌的优势菌落再次划线接种于血液琼脂平板，　３７℃培养ｌ８～２４　ｈ，观察溶血情况并经革兰氏染　

色后镜检。　

１．２．２过氧化氢酶试验用接种环挑取染色镜检　后的疑似菌落涂抹于载玻片上，在其上滴加２　３滴　３％的Ｈ　０　，观察有无气泡产生。　

１．２．３金黄色葡萄球菌的药物敏感试验　采用　

Ｋ—Ｂ纸片扩散法对环丙沙星、阿莫西林、氧氟沙星、　

卡那霉素、阿米卡星、磷霉素、头孢曲松、左氧氟沙　星、庆大霉素等９种药物进行药敏试验，３７℃培养　

ｌ８～２４　ｈ后量取抑菌圈直径，其结果根据美国临床　实验室国家标准化委员会（ＮＣＣＬＳ）制定标准判读。　

２　结果与分析　

２．１　细菌分离培养结果　

图１　分离株在普通营养琼脂平板上的形态　普通肉汤中呈现出明显的浑浊，有沉淀，且在　

管壁形成菌环。普通琼脂平板上生长的菌落呈圆　形、湿润、不透明、边缘整齐、表面隆起光滑，颜色呈　

柠檬色或黄色（图１）。将琼脂平板上的优势菌落接　种血液琼脂平板后，未见形成明显的　溶血环（图　

２）。初步分离出ｌ８株金黄色葡萄球菌。　

图２分离株在血琼脂平板上的形态　

２－２染色镜检结果　

图３分离株在光学显微镜下的形态（革兰氏染色，１　０００×）　

分离菌落经染色镜检，可见不规则排列成葡萄　串样的革兰氏阳性球菌（图３）。　

２３　Ｈ　Ｏ２酶试验结果　受试的１８株菌落均产生气泡，说明１８株菌均　为Ｈ　０　酶阳性。　２．４药物敏感试验结果　

表１　１８株金黄色葡萄球菌药敏试验结果　抗生素　高度敏感／株ｒｆ１度敏感／株耐药／株耐药率，％　

・ｌ６９７・

　山西农业科学２０１６年第４４卷第１ｌ期　

分别对１８株金黄色葡萄球菌进行药敏试验，　结果依据美国临床实验室标准委员会（ＮＣＣＬＳ）制　

定的标准判断，即抑菌圈直径Ｉ＞２０　ｍｍ为高度敏　感，１６ｍｍ＜直径＜２０ｍｍ为中度敏感，直径≤１６ｍｍ　

为耐药。由表ｌ可知，分离的１８株金黄色葡萄球菌　对环丙沙星、阿莫西林、氧氟沙星、卡那霉素、阿米　

卡星、磷霉素、头孢曲松、左氧氟沙星、庆大霉素均　呈现出不同程度的耐药性。其中，分离菌株对阿莫　

西林的耐药率最高，达７７．８％，对左氧氟沙星的耐　

药率最低，为５．６％，对其余７种抗生素的耐药性介　

于ｌ１．１％～４４．４％。　

３　讨论与结论　

本试验通过细菌的分离培养、染色镜检、过氧　

化氢酶等试验方法对２５份奶样中的金黄色葡萄球　菌进行了初步分离鉴定。结合菌落在平板上的金黄　

色菌落、染色镜检呈阳性葡萄串样、过氧化氢酶试　验阳性的结果，初步认定试验分离出ｌ８株金黄色　

葡萄球菌，推测其是引起该场奶牛乳房炎的优势菌　株。但分离菌株在血琼脂平板培养后，并未形成明　

显的　血环。由于大多数致病性金黄色葡萄球菌　

经血琼脂平板培养后均呈现ＪＢ溶血环【垌，本试验的　分离菌株是否为致病性菌株还有待后续开展分离　

菌株的致病性试验进一步检测。　本试验的药敏结果显示，分离出的１８株金黄　

色葡萄球菌除对左氧氟沙星耐药率最低（５．６％）外，　

对环丙沙星、阿莫西林、氧氟沙星、卡那霉素、阿米　卡星、磷霉素、头孢曲松、庆大霉素都呈现出不同程　

度的耐药ｌ生，其中，阿莫西林的耐药率最高（７７．８％）。　这与王冰等【１６１报道的呼和浩特地区奶牛乳房炎金　

黄色葡萄球菌对阿莫西林产生耐药性最多的结果　相近。对卡那霉素、庆大霉素和阿米卡星的耐药性　

居其次（４４．４％，３８．９％，３３．３％），高于王桂琴等旧报　

道的卡那霉素耐药率（２６％）和阿米卡星耐药率　（６％），高于锡林高娃等　Ｊ报道的庆大霉素耐药率　

（０），其余抗生素如环丙沙星、氧氟沙星、头孢曲松　的耐药率在１６．７％～２２．２％，与王桂琴等㈣报道的环　

丙沙星、氧氟沙星、头孢曲松耐药率（１２％，１２％，　

１４％）相近，但显著高于锡林高娃【ｌ８】报道的环丙沙　星、氧氟沙星耐药率（Ｏ，４．２％），与高延玲等㈣报道　

的头孢曲松耐药率（１３．４％）相近，但低于氧氟沙星　

耐药率（２５．６％）。此外，本试验还选用了临床上较少　

使用的磷霉素进行药敏试验，结果显示，分离菌株　对磷霉素也产生了一定的耐药ｌ生，耐药率为１１．１％。　

．１６９８．　本试验中耐药率最低的是左氧氟沙星，１８株金黄色　

葡萄球菌分离株中仅有１株耐药，耐药率为５．６％，　与赖金伦等＿加ｌ试验结果较为一致。提示左氧氟沙星　

可作为治疗该奶牛场奶牛乳房炎的备选药物。　

由于本试验所分离菌株的数量相对较少，且与　各相关报道中的受试菌株基数也不尽一致，导致金　

黄色葡萄球菌对各抗生素的耐药率与相关报道存　在一定的差异。因此，本试验结果仅对受试奶牛场　

的病原流行病学、耐药性调查和药物选择具有指导　

性，并不具有广泛的通用性和代表性。山西省内更　大范围的奶牛乳房炎流行状况及其病原菌金黄色　

葡萄球菌的耐药情况还需不断扩大病原菌的分离　数量作进一步的试验调查。　

参考文献：　［１］林杰，王旭荣，杨志强，等．青海省某奶牛场顽固性乳房炎主要　病原菌的分离鉴定与耐药性研究【Ｊ］．动物医学进展，２０１５，３６　（１２）：９８—１０２．　［２］史冬艳，郝永清，张爱荣，等．奶牛金黄色葡萄球菌性乳房炎研　究进展『Ｊ１．动物医学进展，２０１０，３１（７）：５１—５５．　［３］Ｔｈｏｍ￣Ｊ，ＳｉｍｏｎＦ．奶牛疾病学【Ｍ】．赵德明，沈建忠，译．北京：中　国农业大学出版社，２００９：３２８—３２９．　［４］王文博，谷晓红，苑学霞．生牛乳中金黄色葡萄球菌的分离鉴定　与药物敏感性分析ｆＪ］．山东农业科学，２０１５，４７（１０）：９２—９４．　［５］柳旭伟，葛文霞，杨力伟，等．奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌的分　离鉴定及其药敏试验【ＪＪ．上海畜牧兽医通讯，２０１４（２）：５０—５　１．　［６］武守艳，韩一超，陈剑波，等．奶牛乳腺炎主要病原菌ＰＣＲ检测　方法『Ｊ１．山西农业科学，２０１６，４４（２）：２３２—２３５．　［７］戈胜强．奶牛乳房炎葡萄球菌的分离鉴定及耐药性检测［Ｊ］．西　北农林科技大学学报：自然科学版，２００８，３６（１１）：４Ｏ一４６．　［８］安晶，王晓．荷斯坦牛乳源金黄色葡萄球菌流行性及其与乳源　总菌群的耐药性分析［Ｊ】．中国畜牧兽医，２０１４，４１（１０）：２１３—２１８．　［９］贾智丽，李培峰．包头地区奶牛乳房炎主要病原菌的分离、耐药　性检测及治疗试验【Ｊ】．黑龙江畜牧兽医，２０１５（１１）：８６—８９．　［１０］刘敬兰，刘继超，姜铁民，等．北京某牛场奶牛乳房炎金黄色葡　萄球菌的分离鉴定与药敏试验ｆＪ】．中国奶牛，２０１５（７）：３９—４２．　［１　１］韩志辉．牛奶中金黄色葡萄球菌的分离与鉴定［Ｊ］．兽医医药杂　志，１９９９（３）：１３—１４．　［１２］白光耀，谭艾娟，吕世明，等．生鲜乳金黄色葡萄球菌污染来源　调查及其耐药性［ＪＪ．天津农业科学，２０１４，２０（５）：１０１—１０３．　［１３］杜锐，韩文瑜，雷连成．动物源性金黄色葡萄球菌耐药性的检　测ｆＪ］－中国兽医科技，２００５，３５（３）：２３０—２３２．　［１４］何源，王红，刘晓朋，等．重庆市生牛乳中金黄色葡萄球菌的污　染状况及耐药性调查的研究『Ｊ】．中国卫生检验杂志，２０１４，２４　（１９）：２８５８—２８５９．　［１５］胡桂学．兽医微生物学实验教程［Ｍ】．北京：中国农业大学出版　社，２００６：７１—７３．　［１６］王冰，刘明春，吴聪敏，等．呼和浩特地区奶牛乳房炎金黄色葡　

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