下载文档原格式
2019年第5期李巍:猪精液提取蓝耳病病毒核酸的方法比较41猪精液提取蓝耳病病毒核酸的方法比较李巍蔦赵景利2,孙华武2,苍真伟1,王承功I,陈明非I,高佰华彳(1•大连市现代农业生产发展服务中心，辽宁大连116037；2.辽宁省大连市长海县动物卫生监督所，辽宁长海1165003.辽宁春兴畜牧兽医服务中心，辽宁沈阳110001)摘要：为筛选从猪精液中提取微量蓝耳病病毒(PRRS V)核酸的有效方法，将蓝耳病(变异株)弱毒苗稀释成不同滴度(TCID50/mL)的病毒液，与健康猪常温精液混合作用。
分别用Trizol法、磁珠法、离心柱法提取含毒精液中的病毒RNA,用荧光RT-PCR试验检测病毒RNA,结果表明，当精液中病毒滴度高于0.1TCID50/mL时，3种病毒RNA提取方法均可检出。
离心柱法对猪精液中PRRSV核酸提取灵敏度最高，可检出0.01TCID50/mL滴度的病毒，稳定性好。
关键词：蓝耳病；猪精液；含毒精液;病毒RNA；提取中图分类号：S858.28文献标识码：B文章编号：1672-9692(2019)05-0041-04 Comparison of Extraction Methods for PRRSV RNA from Boar SemenLi Wei\Zhao Jingli2,Sun Huawu2,Cang Zhenwei1,Wang Chenggong1,Chen Mingfei1,Gao Baihua3(1.Dalian Production and Development Service Center for Modern Agriculture,Liaoning Dalian116037:2.Dalian Center for Animal Disease Prevention and Control,Liaoning Dalian116037;3.Liaoning Chunxing Animal Husbandry and Veterinary Service Center,Liaoning Shenyang110001)Abstract:In order to Screening effective methods for extracting trace porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)RNA from boar semen,the attenuated vaccine of PRRSV(mutant strain)was diluted into different titers(TCID50/mL)and added to fresh semen samples of healthy boars.Trizol,magnetic bead and spin column method were respectively used to extract virus RNA from semen containing PRRSV and virus RNA was detected by Fluorescent RT-PCR.The results showed that virus RNA could be detected by using al1three extraction methods when the titers of virus in semen was higher than0.1TCIDgo/mL.Spin column method for extracting PRRSV RNA from boar se-men has the highest sensitivity,and the virus titers of0.01TCIDgo/mL can be detected with good stability.Key words:Porcine reproductive and respiratory syndrome;Boar semen;Semen containing PRRSV; Virus RNA;Extract猪蓝耳病(PRRS)是一种高度接触性传染病，呈地方流行性，妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感，持续性感染是本病的重要特征。
高致病性猪蓝耳病自然病例血清致炎因子IL-1、IL-6和TNF-α含量的测定与分析李建臻;杨苗;徐刚【摘要】To find the relationship among IL-1、IL-6、TNF-α content in blood sera of HP-PRRSV infected pigs,so to explain the pathogenesis of HP-PRRS,and to provide a theoretical basis for the prevention and control of HP-PRRS,48 blood sera samples from 4 farms in Chengdu were sampled and tested by ELISA,including 25 RT-PCR positive samples with clinical symptoms and 11 positive samples without clinical symptoms and 12 negative samples. The results showed that the difference of IL-1 in positive pigs was significant(P<0.01) compared with the other two groups,and the dif-ferences of IL-1 between the other two groups were notsignificant(P>0.01) . The differences of IL-6 levels among the three groups were significant(P<0.05),and IL-6 in positive samples with clinical symptoms were higher(P<0.05) than the other two groups. The differences of of IL-6 in the other two groups with negative results were not significant(P>0.05). The differences of TNF-α among the three g roups were not significant(P>0.05). These results showed that IL-1and IL-6 increased in blood serum when pigs were infected by HP-PRRSV and played important role in infection, while TNF-α has little change.%本试验旨在探究高致病性蓝耳病（HP-PRRS）自然病例中致炎因子IL-1、IL-6和TNF-α含量，进而阐述HP-PRRS的致病机理，为养殖生产中的HP-PRRS防控提供理论基础。
猪蓝耳病的诊断及防治措施作者：周香锦任敬姗来源：《乡村科技》2018年第22期[摘要] 猪蓝耳病是一种高度接触性传染病，又被称作猪繁殖与呼吸障碍综合征。
该病可能出现在任何年龄的猪群中，其中母猪和仔猪最容易患有该病，患病母猪的繁殖功能下降，出现流产、早产等症状，患病猪仔会大量死亡。
基于此，本文主要介绍猪蓝耳病的诊断要点和防治措施，以供参考。
[关键词] 猪蓝耳病；诊断；防治措施[中图分类号] S858.28 [文献标识码] B [文章编号] 1674-7909（2018）22-112-2猪繁殖与呼吸系统综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是一种常见的高度接触性传染病，其临床症状以耳朵发紫、呼吸困难等为主，因此也被称为“猪蓝耳病”[1]。
该病是一种经常发生的高接触性传染病。
猪蓝耳病患病率高，病症比较复杂，疾病很难控制。
作为一种普遍存在的传染病，想要掌握治疗的最有效时机相对困难，如果猪的症状加重，不仅猪的安全会受到威胁，而且会出现猪只大量死亡。
所以，在养殖过程中要做好预防和治疗工作，科学管理养猪场，减少疾病的传播和感染，降低猪的发病率，减少养猪场的损失。
1 流行病学传染源是患病的猪和携带病原体的猪，接触感染、空气传播和精液传播是其主要的传播途径，也可通过胎盘垂直传播，传播媒介包括蚊蝇、昆虫等。
猪蓝耳病的传播是持续的，并且能够在猪身上保留很长的时间，所以这种疾病有很强的残留性，会造成极大的危害。
2 临床症状2.1 母猪患病的母猪体温升高，一般在40 ℃左右，并且有呼吸问题。
有些母猪的乳头、腹部和尾部出现紫绀现象。
对于妊娠母猪，感染该病可能会导致早产、流产、死产和木乃伊胎等。
2.2 仔猪新生仔猪的症状包括肌肉震颤、呼吸困难、打喷嚏、共济失调等，死亡率可高达80%；仔猪（1月龄）出现腹式呼吸，导致呼吸困难，会出现食物摄入量减少或消失，甚至出现体温高于40 ℃，伴有腹泻。
摘要：猪蓝耳病依靠临床症状，解剖 病变和实验室检查进行诊断。
要想获 得良好的预防效果，需要在消灭传染 源、加强饲养管理、制定免疫程序、 合理建设养殖场等几个方面采取综合 性防治措施。
关键词：蓝耳病；诊断；综合防治技术1临床诊断蓝耳病的潜伏期差异比较大袁3耀 27d 不等，临床症状受饲养管理条件， 免疫情况、毒株及环境卫生的影响很 大。
通常被低毒株引起的蓝耳病临床 症状不明显，而感染强毒株的猪只临 床症状显著，表现为急性型发病、慢 性型发病和亚临诊型发病。
患病猪的 临床症状主要表现为体温升髙、咳嗽、畜业技术饲养管理流鼻涕、耳朵及腹部等多处皮肤变为 淡蓝色，并有皮下出血现象。
部分猪共济失调，怀孕母猪患病会出现流产、 早产、死胎，仔猪死亡率上升。
2解剖诊断没有继发感染的病历解剖病变表现为淋巴结水肿，间质型肺炎，部分 猪还有卡他性肺炎，如果有继发感染， 解剖患病猪会观察到心包炎、胸膜炎、 腹膜炎及脑膜炎等症状，解剖可见肺 部病变严重。
3实验室诊断采集患病猪的血清进行实验室诊 断，使用猪蓝耳病乳胶凝集诊断试剂 盒进行检测，结果较为准确，监测 3min 左右能观察到白色小点，监测结 果为阳性，如果没有凝集反应出现， 则监测结果为阴性。
4综合防治技术猪蓝耳病是一种免疫抑制性疾病， 不仅疾病本身会给猪只带来不良影响， 还可能导致免疫失效，影响其他疾病 的预防效果。
并且蓝耳病的发病急， 传播速度快，一旦暴发很容易造成大范 围流行，严重危害养猪业的健康发展。
要采取综合性的防治技术进行防控。
4.1消灭传染源带毒猪是蓝耳病的主要传染源， 因此，淘汰带病猪能有效预防猪蓝耳 病。
尤其是带毒母猪要及时淘汰，防 止蓝耳病传染给仔猪。
有猪只患病的 猪场要彻底清洁消毒，并且及时将患 病猪只隔离治疗，饲养患病猪只的圈 舍也要彻底消毒，并在消毒后空置一 段时间后再安排猪只进人继续饲养。
4.2制定合理的免疫程序规模化猪场要制定合理的免疫程 序，并严格执行，目前针对猪蓝耳病， 我国采取强制免疫的措施。
蓝耳病ELISA检测方法探讨
北京天之泰生物科技有限公司
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）自二十世纪八十年代末期开始流行，1992年国际兽医局正式命名，主要感染猪，尤其是母猪，该病严重影响其生殖功能，临床主要特征为流产，产死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困难，在发病过程中会出现短暂性的两耳皮肤紫绀，故又称为蓝耳病。
引起该病的病毒（PRRSV）属动脉炎病毒科,单股正链RNA 病毒,基因组大小为15kb ,包括8 个开放阅读框架（ORF）,可编码6 种结构蛋白和2 种非结构蛋白,其中ORF5 编码病毒的糖基化囊膜蛋白(又称E 蛋白或GP5) ,为主要的结构蛋白,也是一个多功能蛋白,参与机体的细胞免疫与体液免疫,是发展新型疫苗和诊断试剂的良好目标基因。
该病在上个世纪八十年代末、九十年代初，曾经迅速传遍世界各个养猪国家，在猪群密集、流动频繁的地区更易流行，常造成严重经济损失。
近几年，该病在国内呈现明显的高发趋势，对养猪业造成了重大损失，已成为严重威胁我国养猪业发展的重要传染病之一。
特别是自2006年以来，一种被称为“高热病”的灾难性疾病袭击我国大部分猪场，该病最初在主要在南方几个省市传播，后逐渐蔓延和扩散到我国绝大部分地区，给养猪业造成了重大损失。
在这种情况下，作为控制疫病的重要手段之一，日常监测就被人们给予了更高的期望。
对于养殖场来说，猪群的日常监测是选择疫苗、评估免疫程序合理性、掌握猪群健康状态的重要手段，同时也可从侧面反映猪场管理是否合理。
目前用于PRRS检测的方法很多，根据检测目的和目标的不同，主要分为抗原检测：聚合酶链式反应 （PCR）、实时荧光定量PCR （Real-time PCR），抗体检测：免疫荧光实验（IFA）、免疫过氧化物酶单层分析法（IPMA）、中和实验（SVN）和酶联免疫吸附试验（ELISA）。
其他方法与相比，ELISA 检测操作简便，易于标准化，快速敏感，非常适合进行大规模流行病调查和疫病监测。
国内外学者在PRRSV 抗体ELISA 试剂盒的研发上做了大量研究，基于不同的PRRSV 蛋白建立了不同的ELSIA 试剂。
1、以核衣壳蛋白（N 蛋白）作为主要包被抗原的PRRSV 抗体间接ELISA 检测试剂盒
N 蛋白在病毒粒子中含量较高，是PRRSV 主要结构蛋白之一，保守性高，具有群特异性，能够同时用于检测欧洲株和美洲株，是最早用于试剂盒研究的蛋白，以此作为基础研发的试剂盒是市场上最早应用的商品化试剂盒，敏感性高、重复性好，应用广泛。
N 蛋白不能诱导
产生病毒中和抗体，因此以N 蛋白作为包被抗原的ELISA 试剂无法反应机体的免疫状态，不适合用于对疫苗免疫效果监测。
代表产品为IDEXX（爱德士）和BIOCHEK（百测）蓝耳病抗体检测试剂盒。
2、以膜蛋白（M 蛋白、GP2、GP
3、GP
4、GP5）作为主要包被抗原的PRRSV抗体间接ELISA 检测试剂盒
图1 膜蛋白包被方法与IPMA试验相关性比较。
ORF5 基因编码的GP5 蛋白是PRRSV 最重要的免疫原性蛋白, 参与中和抗体的产生, 并且在PRRSV 感染后康复猪血清中的中和抗体主要针对GP5 ,因此GP5 是作为新型基因工程疫苗和诊断试剂的良好的靶蛋白。
Govin 等(1999) 曾利用大肠杆菌表达的GST-GP5 融合蛋白建立了PRRSV 的GP5-ELISA 检测方法,并证实具有较好的特异性和敏感性。
最近,又有研究表明由ORF6 编码的非糖基化的基质蛋白(M 蛋白) 也存在中和表位,而且在不同PRRSV分离株中高度保守。
此外,在PRRSV 感染的培养物中GP5 和M 蛋白通过分子间的二硫键连接形成异源二聚体,并包装入病毒粒子中,提示这两种蛋白在PRRSV 的免疫
应答中可能具有重要作用。
因而，采用M 蛋白和GP5 蛋白作抗原的诊断试剂不仅能检测野毒感染状况，而且能解决N 蛋白作抗原的诊断试剂无法反映机体免疫状况的缺陷，有利于疫苗抗体水平的检测，为猪场进行疫苗免疫效果评估提供了重要的技术手段。
实验证实，以膜蛋白作抗原的ELISA 诊断试剂盒与其他检测中和抗体的方法，如IFA、IPMA 有很好的相关性，如图(图 1）所示所测血清转阳规律与IPMA （国际标准方法）相似。
代表产品为法国LSI蓝耳病抗体检测试剂盒，也正是由于此方法在检测方面的这些优点，该试剂盒已被列入农业部2010年检测计划指定用试剂盒。
