实验二 霉菌产蛋白酶发酵培养基条件的确定

武汉市2023届高中毕业生四月调研考试生物学试卷本试题卷共8页，24题。

全卷满分100分。

考试用时75分钟。

★祝考试顺利★注意事项：1.答题前，先将自己的姓名、准考证号填写在试卷和答题卡上，并将准考证号条形码粘贴在答题卡上的指定位置。

2.选择题的作答：每小题选出答案后，用2B铅笔把答题卡上对应题目的答案标号涂黑。

写在试卷、草稿纸和答题卡上的非答题区域均无效。

3.非选择题的作答：用黑色签字笔直接答在答题卡上对应的答题区域内。

写在试卷、草稿纸和答题卡上的非答题区域均无效。

4.考试结束后，请将本试卷和答题卡一并上交。

一、选择题：本题共20小题，每小题2分，共40分。

每小题只有一项符合题目要求。

1.利用特定的颜色反应可实现生命物质或生化反应的“可视化”。

下列叙述合理的是A.用双缩脲试剂验证蛋白酶的催化作用B.用苏丹Ⅲ染液鉴定植物细胞中的脂肪C.用NaCl溶液鉴定洋葱根尖细胞的DNAD.用斐林试剂探究温度对淀粉酶活性的影响2.外泌体是细胞主动分泌的具有膜结构的囊泡样小体。

在网织红细胞分化为成熟红细胞的过程中，释放的外泌体中含有酶、细胞因子等物质。

下列叙述错误的是A.外泌体可参与细胞间的信息交流B.外泌体的分泌体现了细胞膜的流动性C.外泌体的分泌过程不需要消耗能量D.外泌体的释放可能利于网织红细胞的分化3.孝感米酒是湖北省的传统美食，其制作流程为：糯米清洗蒸煮+酒曲（含霉菌、酵母菌等微生物）→发酵→高温煮制→灌装保存。

下列叙述错误的是A.蒸煮好的糯米需冷却后再加入酒曲，以防影响酒曲中微生物的活性B.制备好的糯米与酒曲充分混合，装满容器后进行密封发酵C.发酵时，霉菌先分泌淀粉酶进行糖化后，酵母菌才能大量繁殖D.高温煮制的目的是使糯米停止发酵并消毒杀菌4.“零落成泥碾作尘，只有香如故”，体现了生态系统中的分解作用。

下列叙述错误的是A.分解作用是通过微生物的代谢将有机物分解为无机物B.若没有细菌、真菌等分解者的分解作用，生态系统就会崩溃C.温带落叶林气温较高，其分解者的分解作用强于北方针叶林D.沼泽淤泥因缺氧导致分解作用弱，可用于开发有机肥料5.长江流域的蔬菜产区时有病虫害发生，病虫害防治效果决定着产业的兴衰。

实验方案设计人：陈龙1．蛋白酶产生菌的分离1. 1 实验材料菌源：酱香型大曲1. 2 培养基的配制细菌培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15-25g、水1000ml；称量：分别准确称取上述蛋白胨和NaCl量置于烧杯中，然后加入所需水量的2/3左右的蒸馏水；牛肉膏用玻璃棒挑取置于小烧杯或是表面皿中称量，用热水融化后倒入烧杯中。

溶化：在上述烧杯中先加少许所需要的水量，将烧杯置于石棉网上加热，用玻棒搅拌，让药品完全融化，补充水到所需的总体积。

调PH：在未调PH前，先用PH试纸预测培养基原来的PH，若偏酸用1 mol/L NaOH调节边加变搅拌，并随时用PH试纸检测至PH到7.2。

反之，用0.1 mol/LHCL进行调节。

分装、包扎、灭菌。

霉菌培养基（察氏培养基）：蔗糖30g、NaNO3 2g、K2HPO4 1g、KCL 0.5g、MgSO4.7H2O 0.5g、FeSO4 0.01g、琼脂15-25g、蒸馏水1000ml；量取所需水量约2/3左右加到烧杯中，分别称取上述物品依次逐一加入水中溶解，方法同细菌培养基。

分装、包扎、灭菌。

产蛋白酶发酵培养基：葡萄糖20g，酵母粉15g，K2HPO4 1.0g，Na2CO3 0.1g，自来水100ml PH 9.0（灭菌前）。

pH7．0。

配制方法：称取葡萄糖20g，酵母膏15g置于洁净干燥500ml锥形瓶轻轻摇动，使物料混匀，按上述配方用自来水配制无机盐溶液50ml，调节Ph 9.0,倒入装有物料的锥形瓶中混匀，在0.1Mpa压力灭菌30min。

选择培养基：豆粕粉10．0 g，琼脂15．0 g，蒸馏水1000 mL，pH7．2～7．4，112℃，灭菌30 min。

固体斜面培养基：250mL三角瓶装料12.5g麦麸，麦麸：水=1：1.2，pH自然，121℃灭菌30min。

筛选平板：牛肉膏蛋白胨培养基（配法同上）。

1. 3 试剂和溶液1.3.1 配制生理盐水：分装于250ml锥形瓶，每瓶内装99ml，并装10粒玻璃珠。

微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选产蛋白酶菌株的筛选级分离一、实验原理自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈，水解圈与菌落直径的比值，常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。

将腐烂的大豆浸泡液中的细菌接种在含有酪素的培养基上进行培养。

由于产蛋白酶菌株能在干酪素的培养基上形成无色透明圈，因此能将产蛋白菌株分离出来，分离出来的菌株经再次培养，就可获得纯种产蛋白酶的菌株。

二、实验器材1.菌种：从大豆浸泡液中获得2.培养基:(1)PDA斜面培养基：马铃薯200g，蔗糖20g,琼脂20g,水1000ml.马铃薯去皮，切成块，煮沸半小时后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补水至1000ml，121℃灭菌30min备用。

（2）干酪素琼脂培养基：干酪素4.0g，用20ml 0.1mol/L NaOH溶液溶解后再加20g琼脂，加蒸馏水煮沸加水至1000ml 121℃灭菌30min备用。

3.试剂：无菌水。

4.仪器：天平，电磁炉，烧杯，无菌试管，无菌培养皿，高压灭菌锅，锥形瓶，接种环，涂布棒，酒精灯，恒温培养箱。

三、实验步骤1.将腐烂的大豆放入无菌水中浸泡，制成细菌悬浮液。

2.用涂布棒蘸取菌液接种于PAD培养基中，26℃培养48h。

3.倒置于酪素琼脂培养基平板上，37℃培养24h。

4.挑取培养好的菌落接种于平板上，28℃培养48h。

5.观察各菌落周围形成的透明圈的情况。

6.选取透明圈较大的三个菌落分别接种在干酪素琼脂培养基上，28℃培养48h。

7.观察受否为单菌落，若为单菌落且有透明圈，则为纯种产蛋白酶菌株。

若有杂菌，则需要重复步骤6，直到培养出纯菌为止。

参考文献[1]代玉梅.蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及酶学性质研究[D].青岛:青岛大学,2008.[2]黄志强,林白雪,谢联辉.产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选与鉴定[J].福建农林大学学报:自然科学版,2006,35(4):416-420.。

蛋白酶生产菌的产酶条件研究摘要：本文研究了蛋白酶生产菌的产酶条件，包括培养基、温度、pH值、氮源、碳源、微量元素等因素对蛋白酶产量的影响。

结果表明，较佳的产酶条件为：培养基为牛肉膏蛋白培养基，温度为30℃，pH值为7.0，氮源为酵母粉，碳源为葡萄糖，微量元素为FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O和MnSO4·4H2O。

关键词：蛋白酶生产菌；产酶条件；培养基；温度；pH值；氮源；碳源；微量元素一、引言蛋白酶是一类水解蛋白质的酶，广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。

目前，蛋白酶的生产主要依靠微生物发酵。

因此，研究蛋白酶生产菌的产酶条件对于提高蛋白酶产量具有重要意义。

二、实验材料和方法2.1 实验材料实验菌株为产酶能力较强的芽孢杆菌；培养基为牛肉膏蛋白培养基；氮源包括酵母粉、尿素、胰蛋白胨和硝酸铵；碳源包括葡萄糖、麦芽糖、玉米粉和淀粉；微量元素包括FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O 和MnSO4·4H2O。

2.2 实验方法2.2.1 培养条件所有菌株均在37℃下保存，实验前取出，接种到液体牛肉膏蛋白培养基中，培养24小时后进行实验。

2.2.2 测定酶活力取培养液进行离心，取上清液作为酶液，用凝胶电泳法测定酶活力。

2.3 实验设计本实验采用单因素试验设计，探讨培养基、温度、pH值、氮源、碳源、微量元素等因素对蛋白酶产量的影响。

三、结果与分析3.1 培养基对蛋白酶产量的影响本实验选用了牛肉膏蛋白培养基、脱脂牛奶、酵母提取物、玉米粉和淀粉等5种培养基进行对比。

结果表明，牛肉膏蛋白培养基的蛋白酶产量最高，为1.63 U/mL，而脱脂牛奶、酵母提取物、玉米粉和淀粉的蛋白酶产量分别为0.84 U/mL、1.22 U/mL、1.09 U/mL和1.05 U/mL。

因此，牛肉膏蛋白培养基是较优的培养基。

3.2 温度对蛋白酶产量的影响本实验选用了25℃、30℃、35℃、40℃和45℃等5种温度进行对比。

产蛋白酶菌株的筛选级分离一、实验原理自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈，水解圈与菌落直径的比值，常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。

将腐烂的大豆浸泡液中的细菌接种在含有酪素的培养基上进行培养。

由于产蛋白酶菌株能在干酪素的培养基上形成无色透明圈，因此能将产蛋白菌株分离出来，分离出来的菌株经再次培养，就可获得纯种产蛋白酶的菌株。

二、实验器材1.菌种：从大豆浸泡液中获得2.培养基:(1)PDA斜面培养基：马铃薯200g，蔗糖20g,琼脂20g,水1000ml.马铃薯去皮，切成块，煮沸半小时后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补水至1000ml，121℃灭菌30min备用。

（2）干酪素琼脂培养基：干酪素4.0g，用20ml 0.1mol/L NaOH溶液溶解后再加20g琼脂，加蒸馏水煮沸加水至1000ml 121℃灭菌30min备用。

3.试剂：无菌水。

4.仪器：天平，电磁炉，烧杯，无菌试管，无菌培养皿，高压灭菌锅，锥形瓶，接种环，涂布棒，酒精灯，恒温培养箱。

三、实验步骤1.将腐烂的大豆放入无菌水中浸泡，制成细菌悬浮液。

2.用涂布棒蘸取菌液接种于PAD培养基中，26℃培养48h。

3.倒置于酪素琼脂培养基平板上，37℃培养24h。

4.挑取培养好的菌落接种于平板上，28℃培养48h。

5.观察各菌落周围形成的透明圈的情况。

6.选取透明圈较大的三个菌落分别接种在干酪素琼脂培养基上，28℃培养48h。

7.观察受否为单菌落，若为单菌落且有透明圈，则为纯种产蛋白酶菌株。

若有杂菌，则需要重复步骤6，直到培养出纯菌为止。

参考文献[1]代玉梅.蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及酶学性质研究[D].青岛:青岛大学,2008.[2]黄志强,林白雪,谢联辉.产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选与鉴定[J].福建农林大学学报:自然科学版,2006,35(4):416-420.。

实验二霉菌的固态培养一、实验目的霉菌是多细胞真菌的代表，是典型的好氧微生物。

在酶制剂、柠檬酸、调味品等发酵工业中应用极为广泛。

最简便的霉菌培养方法便是固态培养。

本实验的目的是让学生学习米曲霉固态培养的方法，同时掌握蛋白酶测定方法。

二、实验原理1.米曲霉固态培养原理米曲霉是霉菌的一种，能产蛋白酶、淀粉酶、脂酶等多种酶，其广泛用于酱油、酱类产品的制作，形成酱油和酱类物质独特的色、香、味、体。

将纯种的米曲霉接种在麸皮培养基上，在适宜的温度和湿度下，米曲霉利用空气中的氧和麸皮中的营养成分生长繁殖，并分泌各种酶。

2.蛋白酶活力测定原理蛋白质或多肽水解后生成的含苯环氨基酸对275nm波长紫外光具有最大的吸收值。

利用蛋白酶催化酪蛋白的前后在三氯醋酸可溶物中紫外线光密度的变化，可测定酶活力的高低。

三、实验材料及仪器1.材料：麸皮、面粉、豆饼粉；米曲霉菌种；2％酪蛋白；0.4mol/L三氯醋酸；4％氯化钠等。

2.仪器：三角瓶；恒温培养箱；恒温水浴锅；紫外分光光度计；高压灭菌锅等。

四、实验过程1.工艺流程：水米曲霉菌种麸皮、面粉混合润水蒸料冷却接种三角瓶培养蛋白酶的提取米曲霉培养物第2次翻料第1次翻料蛋白酶活力的测定2.操作方法：（1）米曲霉固态培养的操作方法①配料：称取一定量的麸皮和面粉，加入50％的自来水，装入250mL的三角瓶中，用玻璃棒充分混合均匀，并用四层纱布盖在瓶口，上面再用牛皮纸包扎好。

②灭菌：将包扎好的三角瓶放入灭菌锅中，在121℃下灭菌30～40min，然后取出冷却到40℃左右。

在灭菌时注意不要造成假压。

③接种：将3～5mL米曲霉孢子悬浮液接入三角瓶中，并进行摇匀。

④培养：将三角瓶放入恒温培养箱中，控制温度在30℃左右进行培养。

培养72h后结束。

⑤观察并记录不同时期米曲霉生长的现象。

（2）酶活力的测定方法①酶液的制备精确称取米曲霉成曲（5g/L），加入100mL的4% NaCL溶液在40℃中恒温40min提取酶液，用纱布过滤除去固形物，取酶液1mL稀释到一定的浓度，再取稀释的酶液1mL进行酶活力的测定。

产蛋白酶菌的分离鉴定及产酶条件优化王鼎;余淼;付洋洋;郭春华;彭忠利;高彦华【摘要】This research isolated protease-producing strain from cattle rumen,16 strains were selected by the casein hydrolysis bined HE value and protease activity,a strain(named A18)with the mighest activity of proteinase(415.82 U/mL)as the test strain.And it was identified as Aspergillusoryzae by morphological observation and 18S rDNA sequence analysis.We got the inoculation amount 4%,the optimum temperature 30 ℃,time 60 h through the single factor test.By th e response surface analysis(RSA)methods and repeated experiments,the optimal fermentation conditions were determined as follows:inoculation quantity 4%,temperature 29 ℃, time 55 h.The highest enzyme activity reached 527.57 U/mL,which increased by 22.6% than before optimization.%本试验菌源取自肉牛瘤胃液,首先用酪蛋白水解圈法初选出16株产蛋白酶菌株,综合HE值和蛋白酶活性,选出一株蛋白酶活性最高A18作为后续试验菌株,该菌株蛋白酶活为415.82 U/mL,通过形态和分子鉴定确定此菌株为米曲霉菌.单因素试验确定接种量为4%、培养温度为30℃、培养时间为60 h,通过响应面分析法及多次重复试验,得出接种量4%、温度29℃、时间55 h为其最佳产酶条件,最高酶活达527.57U/mL,比优化之前提高了22.6%.【期刊名称】《中国饲料》【年(卷),期】2018(000)007【总页数】6页(P14-19)【关键词】蛋白酶;米曲霉;优化;响应面法【作者】王鼎;余淼;付洋洋;郭春华;彭忠利;高彦华【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;成都大帝汉克生物科技有限公司,四川成都611130;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041【正文语种】中文【中图分类】S816.3蛋白酶存在于动物、植物、微生物中，属于水解酶类，约占世界酶制剂销量的60%（马俊阳等，2014）。

一种利用真菌微生物发酵生产蛋白酶k的生
产工艺
蛋白酶K是一种广泛应用于医药、食品、化妆品等领域的重要酶类，其生产工艺也越来越受到关注。

近年来，利用真菌微生物发酵生产蛋白酶K的工艺备受青睐，下面就来介绍一下其具体生产工艺。

首先，选用高效产酶菌株。

真菌微生物发酵生产蛋白酶K的关键是选用高效产酶菌株。

目前做得较好的产酶菌株包括曲霉、木霉、产曲霉等。

其次，确定合适的发酵条件。

合理的发酵条件有利于提高蛋白酶K 的生产效率和纯度。

通常采用液态发酵，发酵条件包括温度、pH值、转速、空气流量等，最优发酵条件需根据具体情况确定。

再次，加入适量的培养基。

培养基是微生物发酵生产过程中的营养基础，合适的培养基配方可以提高蛋白酶K的产量和纯度。

培养基的成分包括碳源、氮源、矿物质和微量元素等，其中以大豆粉、麦芽粉和葡萄糖等为碳源，以酵母粉和蛋白质为氮源，再添加一些有机和无机盐类为矿物质和微量元素，能够获得较好的生产效果。

最后，进行后处理。

真菌微生物发酵生产蛋白酶K后，需要进行后处理以提高其纯度。

后处理主要包括离心、超滤、扩散等操作步骤，其目的是去除蛋白酶K中的杂质和不纯物质，同时保留其酶活性，以便应用到不同领域。

总之，利用真菌微生物发酵生产蛋白酶K的生产工艺在实践中已经被证明是一种成功的方法，具有重要的应用价值。

在生产过程中需要遵循合理的选菌、合理的发酵条件、合适的培养基配方和有效的后处理方法，才能取得最佳的生产效果，同时也必须注意工艺安全和环保等问题。

相信随着技术的不断进步和研发的深入，真菌微生物发酵生产蛋白酶K的工艺会更加完善，为各个领域的发展带来更多的机遇。

枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶液体发酵培养基优化及条件的研究摘要：通过单因素实验在摇瓶条件下对枯草芽胞杆菌产碱性蛋白酶的液体培养基进行优化，确定了最佳碳源为糊精。

进一步在5L的发酵罐上进行发酵并对发酵过程进行控制得到以下结论：枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶为生长相关型发酵类型，生长周期为38h，发酵到36h时酶活达到最大，酶活最大值为433U/mL，此时pH为8.35，OD600为1.158。

可以用pH是否超过8来当作发酵终点的表观特征。

关键词：枯草芽孢杆菌液体发酵培养基优化发酵条件引言：碱性蛋白酶(Alkaline protease) 广泛存在于微生物中,最早发现在猪的胰脏中[1 ] ，1913 年Rhom 首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用。

1945 年瑞士的Dr. J agg 等发现了微生物碱性蛋白酶，使其成为洗涤剂的主要添加剂之一。

碱性蛋白酶在丝绸、制革工业、饲料工业、动物食品加工中也有广泛用途，如添加到动物饲料中以提高饲料利用率；用于制作海鲜调味品；用于CGM(玉米渣) 的水解，以制取玉米肽饮料；水解大豆蛋白生产大豆多肽等。

由于市场的需求，高产、高效、耐高温、耐高碱的四高型碱性蛋白酶成为国内外当前研究的热点。

枯草芽孢杆菌是生产碱性蛋白酶的传统菌株，具有产蛋白酶量大，耐高温、高碱等特点，因此对枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究成为蛋白酶研究的热点[5]。

我国研究和生产的碱性蛋白酶的活力水平虽然不断提高，但大多数采用进口的碱性蛋白酶制剂，并且大规模工业生产中用的碱性蛋白酶还是主要依赖进口[6]。

本实验通过对枯草芽孢杆菌发酵培养基进行优化，并对发酵过程进行研究，以期进一步提高枯草芽孢杆菌产粗酶的活力及确定其最佳产粗酶的时间段。

1材料与设备仪器1.1菌株枯草芽孢杆菌(由实验室提供)1.2材料与试剂福林试剂、三氯乙酸（0.4mol/ L）、碳酸钠溶液（0.4mol/L）、干酪素溶液(10g/L)氢氧化钠溶液（0.5mol/L）、蔗糖、乳糖、葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、柠檬酸钠、磷酸氢二钾、无水氯化钙。