缝隙连接小体对胚胎干细胞增殖分化调节机制的研究进展

・综 述・缝隙连接小体对胚胎干细胞增殖分化调节机制的研究进展3杨　攀1,杨卫兵2综述,李红丽3Δ审校(1.第三军医大学学员旅四队,重庆400038;2.解放军第181医院皮肤科,广西桂林541002;3.第三军医大学基础部组胚教研室,重庆400038) 关键词:缝隙连接;连接小体;门控机制;干细胞增殖分化中图分类号:Q254文献标识码:A文章编号:167128348(2008)1521740203 缝隙连接(gap junction,G J)是相邻细胞之间的连接结构,由2个分别贯穿于胞膜的连接小体(hemichannel,HC)组成,每个HC由6个连接蛋白(connexin,Cx)相互聚集形成内径约2nm的管道状结构[1]。

已发现人的Cx由有至少20个成员组成的基因家族编码[1,2],且Cx广泛分布于人体各组织和器官中;其中研究较清楚的是Cx26、Cx32、Cx37、Cx38、Cx43、Cx45、Cx46和Cx50。

Cx组成的HC不仅仅是作为G J的亚单位,参与G J介导的相邻细胞间的信号分子传递,最近研究显示该蛋白具有酶和转运体的双重功能,独立于G J存在于胞膜上,可作为胞内与胞外小分子的通路,参与细胞的信号转导和维持细胞正常生理状态[3]。

目前已发现参与HC介导的细胞信号转导的信号分子主要有A TP、NAD+、谷氨酸、P GE2等。

此外,有研究报道提示,HC作为小分子物质通道在调控包括胚胎干细胞等在内的多种干细胞的增殖与分化方面也发挥了重要的作用。

本文就此方面的研究进展作一综述。

1　连接蛋白的结构及功能Cx是跨膜蛋白,由4个α2螺旋跨膜亲水片(M1～M4)、2个胞膜外环、1个胞浆环和位于胞内的羧基末端(C端)与氨基末端(N端)组成。

各类Cx分子序列和长度的差别主要存在于C端和胞浆环,而N端比较保守。

受分子间相互作用等因素的影响,组成HC的Cx的胞膜外环与组成G J的Cx的胞膜外环在空间结构上有一定差别[1,2]。

Jorge等[4]通过染料吸收实验证实细胞在静息状态下有HC的开放存在,但开放程度较低。

此种开放为HC作为跨膜通道调控多种信号分子的释放提供了基础。

有研究表明在单核细胞、巨噬细胞中,Cx37组成的HC通过介导A TP释放抑制白细胞的黏附[5],可能参与了机体的免疫调节;而在角膜内皮细胞中,Cx26组成的HC则通过介导A TP释放参与调控了肌动蛋白细胞骨架[6]。

这些实验结果不仅支持了Jorge等人的结论,也提示HC通过调控信号分子的释放参与介导了相关的细胞生理功能,进而影响组织或系统功能。

同样有实验观察到在人胚胎干细胞胞膜上存在HC开放现象,HC开放在多种干细胞如神经干细胞、少突胶质前体细胞、造血祖细胞等多种干细胞中也得到了证实。

由于在胚胎发育早期,细胞间的各种细胞信息传递尚不完善(如化学突触、离子通道受体信号传递等),HC的开放很可能作为该时期细胞信息传递的重要补充。

进一步实验还证实HC影响着干细胞的分化增殖,主要与其介导了2条信号通路有关。

其中一条通路为胞内A TP经HC释放到胞外,以自分泌和旁分泌的方式作用于胞膜的P2Y受体,另一条通路则为胞内NAD+经HC 释放到胞外,作用于胞膜的糖蛋白CD38;2条通路最终均引起胞内(Ca2+)升高,进而激发一系列氧化磷酸化过程,促进了干细胞增殖。

此外,有证据表明HC的开放与干细胞的分化程度呈负相关,提示HC的开放抑制了干细胞分化[7～9]。

2　机械刺激对HC门控的影响机械压力下细胞形态必然会发生变化,严重的细胞变形是造成细胞死亡的直接原因之一。

众多实验证实几乎所有细胞在机械压力下均可引起穿过HC释放到胞外的A TP增加[10],提示在机械刺激下HC开放增强,即存在机械敏感性,该特性参与了HC介导的信号转导的调控。

但在骨祖细胞和成骨细胞对液体流动剪切力造成的细胞形态变化做出反应的实验中观察到,由Cx43组成的HC通过调控P GE2的释放,以减少压力对组织的伤害;此变形反应可能与MAP K和ER K1/2信号通路有关[11],但目前具体的机制仍不清楚。

由于机械刺激可以增加HC的开放,进而增加某些小分子的物质的释放,调控了相关的生理过程。

有研究发现Cx46在晶状体上皮细胞中高表达,由它组成的HC在机械刺激下开放增加,而且同时伴有此种细胞体积变化,提示HC在机械刺激下的开放能导致晶状体上皮细胞体积变化,进而介导了晶状体形态和体积的调节,参与了眼睛成像调控[11]。

另外有报道,在声波震动刺激下,HC的开放调控耳蜗支持细胞和毛细胞间的嘌呤信号通路,以调节人对不同声强的敏感性差异。

其作用机制是在高声强刺激下耳蜗支持细胞的HC开放增加,释放A TP增多,释放的A TP作用于耳蜗毛细胞的嘌呤受体上,使其发放电冲动减少,降低对高声的敏感性;而低声刺激作用过程正好相反;这种现象可能是人对高声强刺激敏感性降低,而对低声强刺激敏感性增加的重要机制[12]。

同样,机械刺激引发释放的A TP,可以作用于细胞上的嘌呤受体,增大胞间的钙波,提示HC释放的信号分子可以影响Ca2+传递。

在星形胶质细胞、肝细胞等细胞中,由于Ca2+是细胞重要的第二信使,在机械刺激下,HC通过控制信号分子的释放,对上述细胞的生理功能进行调控,也对与机械刺激有关的组织、器官的生理功能调节起到了重要作用。

Bao等[10]通过电生理学研究发现,将细胞用记录移液管吸引或浸没在低渗液中(产生负压),可使大多数HC(除外卵母细胞中表达的Cx38和Cx43)在负电位下开放,正电位下关闭,而正常情况下电压对它的影响正好相反,提示机械刺激可改变HC对电压依赖的开放状态,其具体调控过程可能与膜电3基金项目:广西科学研究与技术开发基金资助项目(2005)。

　△　通讯作者,电话023*********;E2mail:lihlimm@。

位有关。

在干细胞的研究实验中Boucher等[9]发现,N T2/D1细胞经维甲酸和有丝分裂抑制剂处理后,可以分化为功能成熟的神经元(hN Ts)、星形胶质细胞,将这些诱导分化成熟的细胞或N T2/D1细胞直接植入啮齿动物大脑中,它们不表现肿瘤细胞的性质。

目前被作为神经干细胞移植的良好材料之一。

在机械刺激下,N T2/D1细胞的HC的开放程度较原来增加了近17倍,而这样的开放程度并不会带来因HC过度开放造成的细胞内外渗透压失衡,导致细胞肿胀死亡。

结合前述HC的开放程度与细胞的分化程度呈负相关的实验结果,提示机械刺激很可能成为促进干细胞增殖的方法,减少机械刺激则可能加速干细胞的分化。

3　p H值或H+对HC门控的影响p H值是维持人体内环境和细胞稳定重要参考指标,它的变化同样可以影响HC的门控。

Trexler等[13]将多种不同p H 值的酸性溶液分别作用于Cx46组成的HC的细胞内面,观察到p H<7.5时会减少HC的开放,p H<5.5时HC将完全关闭。

如果作用时间不长或酸度不强,p H恢复正常后,HC将重新开放,提示细胞外酸性环境可使HC关闭,且该作用与H+有关。

目前文献报道的常用于体外干细胞培养液的p H值为7.4,而且正常生理状态下的p H值也在7.35到7.45之间,两者均小于7.5,由此推测p H值可能参与调控了细胞HC的开放水平,使细胞不因为HC的过度开放而肿胀死亡,进而保证了体细胞发挥正常功能和干细胞增殖分化的正常进行。

Trexler等[16]同时也观察了酸性溶液作用于细胞外时HC 的开放与关闭情况,结果显示HC出现开放、关闭的不规则交替,而且开放的速度与细胞内面H+被储存的速度是相同的,提示HC与H+的结合位点在细胞内面,且细胞外酸化是通过进入胞内作用于HC的。

多作者在分别Cx26、Cx32和Cx43组成的HC上也证实有相同机制存在[14～16]。

此外,他们的实验还进一步提示p H值对视网膜水平细胞HC的调控,可能影响到该细胞的神经传递和图像信息处理[19]。

目前已测定了不同Cx组成的HC对胞内H+的敏感性,其顺序为Cx50>Cx46 >Cx45>Cx26>Cx37>Cx43>Cx40>Cx32。

Zhang等[18]通过对Cx50组成的HC的研究认为H+对HC门控的影响与胞外Ca2+和胞内CaM有关,但H+对HC的具体作用过程和敏感性有差异的原因仍有待进一步研究。

碱性环境对HC的影响目前文献尚少。

4　胞外阳离子对HC门控的影响阳离子如Na+、K+、Ca2+等作为维持人体内环境稳定和调节生理功能的重要物质也参与HC门控的调节,这大大扩宽了HC与细胞功能以及机体生理功能的联系。

最近有研究报道一价阳离子对HC的作用。

Miduturu 等[17]通过研究晶状体中Cx50组成的HC观察到,用K+替换胞外的Na+,使通过HC的电流增加了近10倍,而恢复Na+与K+的浓度关系后,电流又恢复到原有水平,提示一价阳离子可影响HC的门控,使其开放增加。

同时K+取代Na+后, Cx46组成的HC也表现出一定程度的开放增加,不过增加的幅度小于Cx50组成的HC,提示HC对一价阳离子反应性的差异可能与Cx种类有关。

除K+外,胞外的Cs+、Rb+、N H4+对Cx50组成的HC和Cx46组成的HC也表现出相似的作用。

将Cx46和Cx50的C端相互交换后,这两种Cx对K+的反应性没有变化,而N端相互交换后反应性呈相反的结果,提示Cx对一价阳离子反应程度的差别主要与N端有关。

Ca2+作为二价阳离子对HC也有影响。

大多数HC的开放概率会随胞外Ca2+增加而减少;当胞外Ca2+>1mmol/L 时,开放概率会大大降低,当胞外Ca2+接近0时则会大大增加,提示Ca2+与HC的开放程度相关[16,18]。

John等还发现Cx46组成的HC在胞外低Ca2+时会过度开放,导致爪蟾卵母细胞的死亡。

由于生理状态下胞外游离Ca2+>1mmol/L,因此HC大部分是关闭的。

该机制保证了胞内重要的小分子物质不会因HC过度开放而外流,造成细胞死亡,从而与p H值对HC开放的调控共同保证了体细胞发挥正常功能和干细胞增殖分化的正常进行。

对Ca2+调节HC的门控机制的研究提示胞外Ca2+对Cx50组成的HC开闭的调控,可能是通过胞外Ca2+进入胞内,激活CaM,导致CaM变构,进而与Cx50结合,封闭HC的细胞内孔。

此外在等渗状态下(Ca2+=1.6～1.8 mmol/L)虽然HC的开放概率低,但Ca2+的微小变化所引起Cx43组成的HC开放程度的微调,仍对细胞体积调控起着重要作用,这使得细胞形态保持相对稳定,此种调节在不表达Cx 的细胞中是不存在的[20]。

另外,人胚胎干细胞的HC在静息状态下开放程度也很低,但胞外低(Ca2+)环境则大大促进了HC的开放[7],这暗示当降低胞外(Ca2+)在不引起细胞肿胀死亡的情况下,可能促进干细胞的增殖;而胞外高(Ca2+)明显减少HC开放,因而它很可能促进干细胞分化。