芸苔EPSPs基因cDNA的克隆和表达载体的构建

一种植物质体表达载体的构建方法及应用与流程技术构建植物质体表达载体是一种将外源基因导入植物细胞并在植物细胞内进行表达的方法。

以下是一种常见的植物质体表达载体的构建方法及其应用与流程技术：
1.选择载体：选择适合植物质体表达的载体，通常是质粒
（plasmid）或病毒载体。

质粒载体通常由选择标记基因、启动子、终止子和目标基因构成。

2.克隆目标基因：将目标基因（外源基因）插入载体的多克
隆位点中。

这可以通过限制性内切酶切割质粒载体和目标基因的DNA，然后利用DNA连接酶将两者连接起来。

3.构建表达载体：将含有目标基因的质粒进行转化，例如通
过化学方法或电穿孔等手段将质粒导入植物细胞，形成表达载体。

4.选择转化植物细胞：通过对转化植物细胞进行筛选，例如
添加抗性选择剂或利用标记基因表达进行筛选，以筛选出含有目标基因的转基因植物细胞。

5.确认目标基因表达：通过PCR、RNA分析或蛋白质分析等
技术，检测和确认目标基因在转基因植物细胞内的表达情况。

6.稳定转基因植物的培养：将成功表达目标基因的转基因植
物细胞进行培养，以获得稳定转基因植物种子或植株。

7.功能性验证与应用：对获得的稳定转基因植物进行功能性
验证，例如检测表达的蛋白质具有特定的生物活性或应用
于农艺改良、抗病虫害等方面。

8.申请相关许可：如果打算将转基因植物及其产品用于商业
化目的，需要申请相关的许可和审批文件，以确保遵守法
规和伦理规范。

需要注意的是，植物质体表达载体的构建方法与特定目标基因、植物物种和研究目的有关。

芸薹属线粒体基因组重组调控基因克隆及榨菜MSH1-RNAi系的构建芸薹属作物是我国重要的蔬菜和油料作物,细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)作为一种重要途径可运用于其杂种优势育种。

高等植物的细胞质雄性不育与线粒体基因组重组密切相关,而线粒体基因组重组受核基因调控。

因此研究影响线粒体基因组重组的核基因及线粒体基因组重组的机制,对于分析细胞质雄性不育的机理具有重要的意义。

MSH1,RecA3以及OSB1是参与高等植物线粒体基因组重组的关键核基因。

MSH1,即MUTSHOMOLOG1,编码MutS同源蛋白。

高等植物中,MSH1蛋白的主要作用是抑制线粒体DNA的重组,维持线粒体基因组的稳定性。

本研究对芸薹属(Brassica), Brassica rapa (AA), Brassica nigra (BB), Brassica oleracea (CC), Brassica napus (AACC), Brassica juncea (AABB), Brassica carinata (BBCC)的MSH1, RecA3和OSB1进行克隆,分析这三种基因在芸薹属作物中的功能与特性。

并将MSH1-RNAi的载体转化至芸薹属芥菜种的榨菜(Brassica juncea Coss. var. tumida Tsen et Lee)中,构建了榨菜MSH1-RNAi 系。

观察MSH1基因被抑制后的表型变化和线粒体基因的重组情况,主要结果如下：1.芸薹属MSH1基因的克隆与特性：从全基因组数据库中获得B.rapa和B.napus的MSH1基因的编码序列,B.nigra和B.juncea的MSH1基因信息来自本实验室全基因组测序,B.oleracea和B.carinata的序列是本实验通过同源克隆测序获得,所有芸薹属作物的MSHl序列均通过PCR扩增验证。

通过同源性比对分析,发现芸薹属几种作物中MSHl高度保守,编码区序列3.3kb左右,编码1120个左右的氨基酸,包含22个外显子和21个内含子,具有特殊的维持线粒体基因组稳定性的DNA错配修复结构。

现代农业研究Modern Agriculture Research第27卷莱茵衣藻是一种生活在淡水里的单细胞真核绿藻，其叶绿体表达的外源蛋白具有安全性好、培养周期短、遗传稳定、容易扩大培养，并且成本低廉等优点[1,2,3]。

近些年来，多种具有应用前景的蛋白在莱茵衣藻叶绿体中成功表达[4]。

而一般构建衣藻叶绿体表达载体需要通过两步克隆来完成：首先将外源基因插入克隆载体的衣藻来源的5’和3’非翻译区（UTR ）多克隆位点间，再将5’UTR-外源基因-3’UTR 的表达盒酶切下，通过同源重组构建至表达载体[5,6]。

为了简化衣藻叶绿体表达载体的构建步骤，本研究构建了一种T 载体pBTNK，通过一步TA 克隆可将待表达的外源基因插入衣藻来源5’和3’UTR 之间，蓝白斑筛选获得阳性转化子后，重组质粒可直接用于转化植物，因此可简化衣藻叶绿体中表达载体构建流程。

1材料和方法1.1材料1.1.1藻株、菌株和质粒莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii 137c (mt)、质粒pCX16、pCX13、p228由华中农业大学陈杏洲博士惠赠；大肠杆菌DH10β，质粒pShuttle、pFAST-EGFP、pT-BASIC 由湖北大学蒋思婧博士惠赠。

1.1.2酶、主要试剂和设备BfuI 购自Thermo Scien-tific，LA Taq 酶、SolutionI 连接酶、T 4DNA 聚合酶、质粒抽提试剂盒、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、其他限制性内切酶，购自Takara 公司，X-gal、dNTP、硫酸卡那霉素（kana ）、氨苄青霉素购自北京九州同业生物科技公司，壮观霉素购自sigma 公司，PCR 引物（表1）由上海捷瑞生物工程有限公司合成，Biolistic PDS-1000/He 基因枪购于Bio-Rad。

1.2方法1.2.1DNA 克隆质粒提取参照OMEGA bio-tek 试剂盒说明书进行，DNA 片段克隆、重组质粒鉴定等分子克隆操作参照Sambrook 提供的方法进行[7]。

抗草甘膦EPSPS基因克隆、载体构建及亚麻遗传转化第一章文献综述1 抗除草剂转基因的研究概况植物的转基因技术是指将从动物、植物、细菌或病毒等生物中分离到目的基因和将目的基因构建入表达载体，并通过一定的方法将含有目的基因的表达载体转移到受体植物的基因组DNA 中，使之稳定遗传表达并使其具有新的优良性状，如抗逆、抗病、抗虫、高产、优质等，从而实现遗传重组，创造新种质，育成新品种的现代生物技术[13]。

转基因作物是指利用分子生物学技术将目的基因导入受体作物所获得的具有新性能的作物，是现代农业生物技术的产物。

迄今为止，全世界范围种植生产的主要转基因作物有4 种，即玉米、棉花、大豆和油菜[14，15]。

1983 年首例转基因烟草由美国专家培育成功[16]，1994 年，世界上第一种转基因植物——转基因晚熟西红柿诞生，并在美国被批准大规模进入市场，开创了转基因作物商品化的先河[17，18]。

到2013 年为止，全世界先后有30 个国家先后批准了3000 多例大田转基因作物的试验[19]。

植物转基因已成功在多达35 科200 多种植物当中获得成功[20，21]。

转基因作物的发展方向主要有：植物修复生态系统、抗除草剂、抗虫、植物疫苗、抗病等几个方面。

以导入的目的基因性状来说，抗除草剂的作物种植面积在全世界范围内为首位，2005 年，因此，抗除草剂转基因作物在转基因中占有非常显著的位置[22]。

1994 年抗烟草花叶病毒TMV）和抗黄瓜花叶病毒CMV）双价的转基因烟草在我国第一次合法种植[23]，1997 年我国第一次批准了转基因后熟西红柿的商品化生产和销售[16]。

在植物基因转化核心技术创新方面[14，15]。

2 抗除草剂转基因作物的研究现状和前景杂草对农业生产是一重大威胁。

杂草不但与作物争夺养分、水分和光照，对作物的品质也有非常严重的影响，而且杂草也是病害和虫害的天然培育场所，所以严重时，甚至会对作物的产量产生十分严重的影响，对农作物带来了非常严重的危害[5]。

拟南芥AtMYB61基因的克隆及表达载体构建王云，任永兵，杨硕，韩宇，陶杨，曹树青(合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥230009)摘要：文章以拟南芥幼苗提取的总RNA为模板，利用RT-PCR技术扩增获得AtMYB61基因的全长cDNA片段，再克隆到pUCm-T载体上，菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了拟南芥AtMYB61基因。

从AtMYB61一pUCm-T载体上，用BstEII和BglII全双酶切切下目的基因片段，将此基因片段连接到植物表达载体pCAMBIA2301中。

菌落PCR和酶切鉴定结果表明成功构建了植物表达载体pCAMBIA2301一AtMYB61。

利用电转化法将重组表达载体导人根癌农杆菌中，获得了携带AtMYB61基因的根癌农杆菌株，为转基因改良植物抗逆性和进一步研究A ￡MyB61基因的抗逆分子机理奠定了基础。

关键词：拟南芥；AtMYB61基因；表达载体Cloning of Arabidopsis thaliana AtMYB61 geneand the expression vector constructionW ANG Yun， REN Yong-bing， YANG Shuo， HAN Yu， TAO Yang， CAO Shu-qing(School of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China)Abstract：Tota1 RNA was extracted from Arabidopsis thaliana seedlings and used as the template to amplify the full length of eDNA of AtMYB6 1 gene by RT_PCR technology，and the gene fragment was subsequently cloned into plant pUCm-T vector．The results of bacterial colony PCR，enzyme analysisand eDNA sequencing confirmed that the Arabidopsis thaliana AtM YB6 1 gene was successfully cloned．AtMYB61 gene was cut completely from AtMYB61一pUCm-T vector by BstE 1]and BglⅡ，and the gene fragment was cloned into plant expression vector pCAMBIA2301．The results of bacterialcolony PCR and enzyme analysis showed the Successfu1 construction of plant expression vector pCAM—BIA2301一AtM YB61．In addition，the recombinant expression vector was carried into Agrobacterium tumefaciens by electrotransformation，and the strain of Agrobacterium tumefaciens carrying AtM YB6 1 gene was obtained．The study provides a basis for improving the resistance of transgenic plants and further exploring the molecular mechanism of AtM YB6 1 gene．Key words：Arabidopsis thaliana；AtMYB6 1 gene；expression vector0 引言随着一些抗逆基因的鉴定和抗逆机理不断深入研究，将外源抗逆基因导人植物的基因工程技术，在提高植物抗逆性方面具有更广泛的应用前景。

田旋花EPSPS基因启动子的克隆、序列分析及转化作者：黄兆峰等来源：《杂草科学》2014年第03期摘要：根据已克隆的田旋花（Convolvulus arvensis L.）EPSPS基因mRNA序列设计引物，通过染色体步移技术获得了1 142 bp的EPSPS-P启动子片段（GenBank 登录号：KC107822）。

对启动子序列分析显示，该片段富含A/T碱基、TATA-box、CAAT-box及其他作用元件如GATA-motif、TC-rich repeats、sp1等。

将该启动子与GUS报告基因连接以构建植物表达载体，利用农杆菌介导法获得转基因拟南芥；PCR和GUS组织化学染色分析证明，EPSPS-P已转化到拟南芥中。

关键词：田旋花；草甘膦；启动子；染色体步移技术草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型除草剂，是国内外防除一年生及多年生杂草的主要药剂[1-6]。

草甘膦的作用机制是抑制植物体内5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）的活性，导致莽草酸大量积累，并抑制芳香族氨基酸的生物合成，进而扰乱正常的氮代谢[7]。

以往研究表明：植物体内EPSPS基因的过量表达可以有效提高其对草甘膦的耐药性[8-11]。

田旋花（Convolvulus arvensis L.）属旋花科，是一种多年生恶性杂草，其繁殖和再生能力极强，是华北地区小麦、玉米、大豆等旱作物田的重要杂草[12]。

已被世界粮农组织列为世界上18种危害最严重的杂草之一[13]。

DeGennaro等研究发现，无草甘膦用药史的田旋花对草甘膦具有天然的耐药性[14]；刘延等发现，北京房山麦田田旋花对草甘膦具有较高的耐药性，并首次克隆了田旋花EPSPS基因（GenBank登录号：EU698030）[12]；张猛比较了不同田旋花种群的耐药性水平，提出草甘膦处理后的EPSPS基因在表达时间和表达量上的差异是其对草甘膦产生耐药性差异的一个重要因素[13]。

几种新型植物基因表达载体的构建方法摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。

植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体PCR 置换法适用于构建小分子RNA 表达载体；重组融合PCR 法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法(Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。

本文将在总结分析前人工作的基础上，分析这6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。

关键词: Micro RNA 前体PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。

而载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。

随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。

传统的载体构建方法在进行构建多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的载体构建方法具有重要的现实意义。

从1969 年Arber 等发现了限制性内切酶，载体的构建方法逐步发展，从传统构建方法到三段T-DNA、Gateway 等技术延伸出了许多新的载体构建方法。

本文结合自己的实验工作选择介绍了近年来其中几种新型的具有代表性的植物表达载体构建的方法，对其应用的方向、优缺点作出了评估，期望给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。

如何构建载体1 启动子的选用和改造外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。

由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。

目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。

在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。

然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。

为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。

已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。

例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。

这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。

例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。

在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。

对现有启动子进行改造，构建复合式启动子将是十分重要的途径。

例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子，GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。

吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）。

植物基因克隆、表达载体构建及遗传转化实验心得
植物基因克隆、表达载体构建及遗传转化实验心得实习生：李宇皓，实习时间为2017年11月27日-12月25日。

这次实习是去农学院，具体是一个专业—园艺科学。

这是我第三次参加此类型的实习了。

前两次都是上课的形式，今天终于亲自动手操作了！还不错吧!这也算是我实践性比较强的一门课了。

实习内容包括有：《植物基因组文库构建》、《植物多样性》、《植物基因组工程与应用》、《植物抗病虫害》。

最后进行分组讨论会，向指导老师汇报成果，感觉很棒啊！从10月30号到12月13号，五天时间里，我们几个同学根据实际情况，做好各项准备，完成了毕业设计的前期任务，并在第六周开始正式着手整个课题的研究工作，可谓万事俱备只欠东风了！
实验目的和要求：1.掌握植物基因组文库构建方法2.掌握外源基因在大肠杆菌中表达的方法3.掌握基因组文库构建与高密度筛选4.熟悉多克隆抗体技术5.理解基因工程原理6.通过外源基因表达产物对花卉新品种的选育作用以及利用反义技术实现基因定位和标记
等相关问题。

实习步骤（含内容）：实习一：了解植物基因组文库构建概念及意义；制定实验方案；进行文库构建；并利用文库分析植物进化史。

实习二：分离转录间隔区序列；目的基因与其他基因的分离纯化；目的基因的克隆及转化载体构建；目的基因的 PCR 扩增、测序与分析；目的基因片段的克隆；基因片段的连接；基因文库构建及质量检查。

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基因过表达载体构建基本步骤基因过表达载体构建就像是一场奇妙的基因魔法构建之旅。

咱先得找到合适的基因这个“魔法小精灵”。

这基因就像藏在基因森林里的独特宝藏，要从无数的基因树叶（DNA片段）里把它挑出来可不容易，得用各种工具像是超级放大镜（特定的基因检测技术）一样仔细搜寻。

一旦找到了这个宝贝基因，就像抓住了一只调皮的小生物，得把它放到一个合适的小房子（载体）里。

这个载体呢，就像是基因的豪华专车，可以带着基因到处跑。

然后就是对这个载体进行改装啦。

这就好比给专车安装各种炫酷的装备，比如说启动子这些特殊的零件。

启动子就像是专车的超级引擎，能让基因这个乘客在细胞这个大公路上跑得飞快。

接着要把基因连接到载体上，这可不像简单地系个安全带把乘客绑在座位上那么轻松。

得用特殊的胶水（连接酶），小心翼翼地把基因粘到载体这个专车上，要是不小心粘歪了，那就像是把车轮安到车顶上，整个专车就跑不动啦。

在这个过程中，还有像质检员一样的检测环节。

要看看这个基因有没有好好地坐在载体专车上，有没有中途掉下去之类的。

这检测就像是给专车做个全身检查，每个小螺丝（碱基对）都不能放过。

之后就是把构建好的带有基因的载体送到细胞这个大城堡里。

这就像是把带着特殊使命的专车送进一个神秘的王国。

细胞城堡里有各种各样的小居民（其他生物分子），载体专车要在里面找到合适的路线，把基因送到该去的地方。

有时候这个过程中会遇到一些小怪兽（各种干扰因素），比如说细胞里的防御机制可能会把载体专车当成外来入侵的怪物。

这时候就得想办法伪装一下专车，让它能够顺利通行。

当基因成功到达目的地后，就像是魔法小精灵在城堡里开始施展它的魔法啦。

它会大量地表达，就像小精灵开始疯狂地复制自己，然后释放出各种神奇的效果。

整个基因过表达载体构建的过程充满了挑战和惊喜，就像一场刺激的冒险游戏，每一步都需要小心翼翼又充满创意，最后要是成功了，那感觉就像是在基因的魔法世界里创造了一个新的小奇迹。

2000-07-21收到,2001-01-02接受。

＊通讯联系人,E -mail :zhangz honglin @ 。

＊＊并列第一作者。

油菜叶绿体基因组同源重组片段的克隆及phb 基因定点整合载体的构建张中林1＊　张景昱2＊＊　李轶女1　苏　宁1　宋艳茹2　沈桂芳1(1中国农业科学院生物技术研究所,北京100081;2中国科学院植物研究所,北京100093)摘要:利用叶绿体基因组在进化过程中高度保守的特点,根据烟草、水稻和玉米叶绿体基因组全序列资料,设计合成引物,PCR 扩增并克隆了油菜叶绿体两个重要的功能基因rbc L 和atp B (GenBank 登录号分别为AF267640和AF267641),并以此作为定点整合外源基因的同源重组片段。

以来自叶绿体的强启动子P ps bA 和P r rn 等驱动PHB 合成途径中3个关键酶基因phbA 、phb B 和phbC ,分别构建表达盒,并将它们按照其在原始菌株中的自然转录顺序ph bC -phbA -phbB 相串联,最后连同选择标记基因aadA 表达盒一起,克隆到油菜叶绿体同源片段中,构建成ph b 基因定点整合载体pRCAB Z 和pRCAB F 。

酶切及Southern 杂交结果证明所构建的转化载体符合预期设计。

叶绿体转化及后续工作目前正在进行之中。

关键词:ph b 基因,叶绿体转化,同源片段,定点整合,油菜学科分类号:Q78 聚-3-羟基链烷酸酯(polyhydroxyalkanoate ,PHA )是自然界中存在的一类贮藏性微生物聚酯,广泛存在于多种微生物中,是许多细菌等的碳源和能量贮存物质(Madison 和Huisman 1999)。

由于其完全的生物可降解性以及良好的物理机械特性和生物相容性,PHA 被认为是石油化工塑料最具竞争力的替代品。

通过细菌发酵法现已实现PHA 的小规模商业化生产,然而由于高昂的发酵底物和复杂的发酵工艺,产品成本居高不下,在市场上无法与化工塑料相竞争。