DNA制片过程

DNA制片过程制片过程1.固定（宫颈标本）医生用宫颈刷刷取标本后，将宫颈刷头取下放入固定液中，使取得的宫颈细胞标本得到及时的固定保存。

2.消化将固定液瓶放于振荡器上振荡半小时，直至粘液被完全消化，标本呈细颗粒状——细胞分散成细胞悬液止。

3.离心宫颈刷取物标本或痰标本消化好的标本液使其细胞均匀分布，另取一支7ml试管，倒入标本液4~5ml，放入离心机中以2500转/分转速离心4分钟。

从离心机中取出后，倒去上清夜。

根据沉淀的标本量加入适量固定液，再用一次性吸管反复抽吸使其混合均匀备用。

浆膜腔积液1）将标本先摇匀，将浆膜腔积液标本倒入一支50ml或15ml刻度离心管，放入离心机中以3000转/分转速离心5分钟。

2）从离心机中取出后，倒入上清液。

（或用一次性滴管吸除上清液，具体操作可视沉淀物性状而定）4.制片宫颈刷取物制片将转头置入离心涂片机（兰丁高科公司）中备好，吸取混匀的标本液加入转头孔中，以1500转/分的速度离心涂片4分钟，制成薄层细胞片1-2张。

细胞片经充分干燥后，经Feulgen-THionin染色，用DNA细胞自动检测分析仪扫描。

浆膜腔积液根据标本的性质，合理选择使用离心涂片机制片或者推片。

染色过程1）将制好的标本片干燥。

2）固定：将标本片置入无水乙醇中固定30分钟，回收无水乙醇。

3）B.S液固定60分钟，回收B.S液。

4）水洗3到5次，尽量控干水分。

5）酸化水解：5N HCL 25摄氏度酸解60分钟。

6）水洗3到5次。

7）DNA染液67分钟（25摄氏度）。

8）水洗6到8次。

9）用漂洗液漂洗3次，第1次1分钟、第2次3分钟、第3次4分钟。

10）水洗3到5次。

11）脱水：分别经95%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、无水乙醇各2分钟。

12）吹干、贴条形码，中性树胶封片。

实验：观察DNA和RNA在细胞中的分布（1）实验原理：甲基绿和吡罗红两种染色剂对DNA和RNA的亲和力不同，甲基绿使DNA呈绿色，吡罗红使RNA呈红色。

(2)实验材料：人的口腔上皮细胞或洋葱鳞片叶内表皮细胞(3)实验步骤是：制片—水解—冲洗涂片—染色—观察(4)载玻片上滴0.9%的NaCl溶液的作用：是保持口腔上皮细胞的正常形态；(5)水解时用到8%的盐酸的作用：①盐酸能改变细胞膜的通透性，加速染色剂进入细胞，②同时使染色体中 DNA与蛋白质分离，有利于DNA与染色剂结合；(6)用蒸馏水的缓水流冲洗载玻片：是为了防止细胞被水流冲走；（7）实验结果：绿色明显集中且接近细胞中央，绿色周围的红色范围较广；说明DNA主要分布于细胞核中，RNA主要分布于细胞质。

实验：观察DNA和RNA在细胞中的分布（1）实验原理：甲基绿和吡罗红两种染色剂对DNA和RNA的亲和力不同，甲基绿使DNA呈绿色，吡罗红使RNA呈红色。

(2)实验材料：人的口腔上皮细胞或洋葱鳞片叶内表皮细胞(3)实验步骤是：制片—水解—冲洗涂片—染色—观察(4)载玻片上滴0.9%的NaCl溶液的作用：是保持口腔上皮细胞的正常形态；(5)水解时用到8%的盐酸的作用：①盐酸能改变细胞膜的通透性，加速染色剂进入细胞，②同时使染色体中 DNA与蛋白质分离，有利于DNA与染色剂结合；(6)用蒸馏水的缓水流冲洗载玻片：是为了防止细胞被水流冲走；（7）实验结果：绿色明显集中且接近细胞中央，绿色周围的红色范围较广；说明DNA主要分布于细胞核中，RNA主要分布于细胞质。

实验：观察DNA和RNA在细胞中的分布（1）实验原理：甲基绿和吡罗红两种染色剂对DNA和RNA的亲和力不同，甲基绿使DNA呈绿色，吡罗红使RNA呈红色。

(2)实验材料：人的口腔上皮细胞或洋葱鳞片叶内表皮细胞(3)实验步骤是：制片—水解—冲洗涂片—染色—观察(4)载玻片上滴0.9%的NaCl溶液的作用：是保持口腔上皮细胞的正常形态；(5)水解时用到8%的盐酸的作用：①盐酸能改变细胞膜的通透性，加速染色剂进入细胞，②同时使染色体中 DNA与蛋白质分离，有利于DNA与染色剂结合；(6)用蒸馏水的缓水流冲洗载玻片：是为了防止细胞被水流冲走；（7）实验结果：绿色明显集中且接近细胞中央，绿色周围的红色范围较广；说明DNA主要分布于细胞核中，RNA主要分布于细胞质。

病理组织切片制作技术病理组织切片制作技术病理组织切片常用的制作方法有三种。

即石蜡切片法，冰冻切片法和火棉胶切片法。

以石蜡切片法为代表，切片的基本制作过程是：组织取材→固定→冲洗→脱水→透明→浸蜡→组织包埋→组织切片→展片附贴→切片脱蜡→染色→脱水→染片透明→封固。

以上基本过程是互相联系的，任何一环节出现问题，都将使整个切片制作归于失败。

因此应细致、耐心、认真负责，并事先做好计划安排。

一、取材采取病料，要刀剪锐利，剪切时不可挤压，扯拉病料，以防人为损伤。

切取的工具要清洁。

采取病料越新鲜越好，一般不超过死后24小时。

应选择病变部与可疑病变部切取，切取时要由表及里，有浅入深并包括周围正常组织一部分。

特殊病料应根据器官的结构特点切取。

管状，囊状和皮肤组织应注意垂直切取（横切）。

带有薄膜的组织，要防止切时薄膜分离和脱落。

切取组织块大小，以1.5×1.5×0.3厘米为宜，最厚不宜超过0.5厘米。

组织块病变一面应平整光滑，另一面可不平整，以便包埋时辨认。

切取后，放入事先准备好的装有固定液的磨口玻璃广口瓶中，并做好标记。

二、固定固定的目的是迅速将组织细胞杀死，使细胞中的蛋白质，糖，脂肪等凝固，从而保持与活组织相似的结构状态。

材料取下后，应迅速固定。

固定液数量应为病理组织块的5到20倍。

由于一般把组织块浸入固定液后数小时，固定液渗入组织液的深度只达2到3厘米。

因此，可以放置冰箱内固定，使组织内酶失去作用，细菌也能停止滋生。

最常用的固定液是10%的福尔马林溶液：使用时，用40%的甲醛饱和水溶液10毫升，加水90毫升配成。

三、冲洗固定后的组织块，应将固定液洗去。

一般均用流水（自来水）冲洗12到24小时左右。

及时冲洗尚有停止固定的作用，防止固定过度，有利于制片染色。

冲洗时如不方便用流水冲洗，也可用较大容器盛装水浸洗，每隔相当时间换水一次。

整个浸洗时间比流水冲洗应稍长一些。

酒精固定的组织材料不需冲洗。

DNA提取方法范文
材料和仪器：
1.细胞样品（例如细菌、动植物组织）
2. lysis缓冲液（含有蛋白酶、盐、缓冲液等成分）
3.蛋白酶K
4.乙酸混合酚
5.氯仿-异戊醇
6. 同济 Pharmacia GenePure Kit
7.离心管及离心机
8.PCR反应管
9.热水浴
步骤：
1. 取细胞样品加入适量的l 管内，混匀后用200L蛋白酶K
（10mg/Lysis）进行蛋白酶作用，37℃恒温2小时，期间翻转混匀。

2. 加入200L 10mg/ml 乙醚/酚搅匀，室温6分钟。

4.在热水浴中加入异戊醇至70°，10分钟，室温离心后去异戊醇。

5.加入75%乙醇冷冻纯化。

6.给乙醇沫体V100V1/50V离心处理梦泪水，禾端。

7. 加入便直完成cent and Over night 28°。

本方法主要通过蛋白酶作用和有机溶剂的使用来破坏细胞膜和蛋白质，最终得到DNA。

蛋白酶K能够将蛋白质降解，使得DNA得以释放出来。

乙
醚/酚和氯仿-异戊醇的使用则有助于分离DNA、RNA和蛋白质，最终得到
高纯度的DNA。

在DNA提取的过程中，要注意避免DNA受到外界污染，可以在操作台
上使用紫外灯杀菌消毒，同时使用无菌技术进行操作。

此外，选用高质量
的试剂和耗材也是保证实验成功的重要因素。

高中生物实验原理步骤总结一、用显微镜观察多种多样的细胞1.实验原理(1)放大倍数的计算，显微镜的放大倍数等于目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积。

(2)放大倍数的实质：放大倍数是指放大的长度或宽度，不是指面积或体积。

(3)高倍显微镜的作用：可以将细胞放大，更清晰地观察到细胞的形态、结构，有利于区别不同的细胞。

2.操作步骤【深度思考】(1)如何区分目镜与物镜，其长短与放大倍数之间存在怎样的关系？提示：目镜无螺纹，物镜有螺纹。

物镜越长，放大倍数越大；目镜越长，放大倍数越小。

(2)为什么要先用低倍镜观察清楚后，把要放大观察的物像移至视野中央，再换高倍物镜观察？提示：低倍镜下视野范围大，而高倍镜下视野范围小，如果直接用高倍物镜观察，往往由于观察的物像不在视野范围内而找不到。

因此，需要先用低倍镜观察清楚，并把要放大观察的物像移至视野中央，再换高倍物镜观察。

(3)如何把物像移到视野中央？提示：物像在视野中偏向哪个方向，装片就向哪个方向移动，简称“偏哪移哪”。

(4)若视野中出现一半亮一半暗；观察花生切片标本材料一半清晰一半模糊不清，出现上述两种情况的可能原因分别是什么？提示：前者可能是反光镜的调节角度不对；后者可能是由花生切片厚薄不均匀造成的。

(5)若所观察视野中有“污物”，应如何判断“污物”位置？提示：[方法技巧]1.关注显微镜使用的“4”个易错点(1)必须先用低倍物镜观察，找到要观察的物像，移到视野中央，然后再换用高倍物镜。

(2)换用高倍物镜后，不能再转动粗准焦螺旋，只能用细准焦螺旋来调节。

(3)换用高倍物镜后，若视野太暗，应先调节遮光器(换大光圈)或反光镜(用凹面反光镜)使视野明亮，再调节细准焦螺旋。

(4)观察颜色深的材料，视野应适当调亮，反之则应适当调暗。

2.显微镜下细胞数目的两种计算方法若视野中的细胞为单行，计算时只考虑长度和宽度；若视野中充满细胞，计算时则要考虑面积的变化。

(1)若视野中为一行细胞，高倍镜下细胞数量与低倍镜下细胞数量之比等于其放大倍数之比的倒数。

实验 DNA的细胞化学——Feulgen反应【实验目的】了解Feulgen反应的原理，掌握有关的操作方法。

【实验原理】DNA是由许多单核苷酸聚合成的多核苷酸，每个单核苷酸又由磷酸、脱氧核糖和碱基构成。

DNA经1N盐酸水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛基与Schiff试剂反应。

Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠相作用，形成无色的品红液，当无色品红与醛基结合形成紫红色的化合物。

因此凡有DNA的地方，都能显示紫红色。

紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色基团，所以具有颜色。

材料不经过水解或预先用热的三氯醋酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feulgen反应的专一性。

【实验仪器、材料和试剂】(一) 仪器、用具显微镜、恒温水浴箱、温度计、解剖针、酒精灯、试管、烧杯、载玻片、盖玻片、吸水纸。

(二 )材料洋葱鳞茎(见图2,1)或根尖(见图2,2)(三)试剂1(1MHCl的配制取82.5ml比重1.19的浓HCl加蒸馏水至1000ml 。

2(Schiff试剂的配制及保存称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中(用三角烧瓶)，时时振荡，继续煮 5分钟(勿使之沸腾)，使之充分溶解。

然后冷却至50?时用滤纸过滤，滤液中加入10ml 1MHCl，冷却至25?时，加入0.5g Na2S2O5(偏重亚硫酸钠或钾)，充分振荡后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24小时(有时需2,3天)，使其颜色退至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，用力振荡1分钟，最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。

滤液应为无色也无沉淀，贮于4?冰箱中备用。

如有白色沉淀，就不能再使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钠或钾，使之再转变为无色时，仍可再用。

3(亚硫酸水取200ml自来水，加10ml 10%偏重亚硫酸钠(或偏重亚硫酸钾)水溶液和10ml 1M HCl，三者于使用前混匀。

生物实验总结实验一观察DNA和RNA在细胞中的分布实验原理：DNA 绿色，RNA 红色分布：真核生物DNA主要分布在细胞核中，线粒体和叶绿体内也含有少量的DNA；RNA主要分布在细胞质中。

实验结果: 细胞核呈绿色,细胞质呈红色.二物质鉴定还原糖+ 斐林试剂砖红色沉淀脂肪+ 苏丹III 橘黄色脂肪+ 苏丹IV 红色蛋白质+ 双缩脲试剂紫色反应1、还原糖的检测（1）材料的选取：还原糖含量高，白色或近于白色，如苹果，梨，白萝卜。

（2）试剂：斐林试剂（甲液：0.1g/mL的NaOH溶液，乙液：0.05g/mL的CuSO4溶液），现配现用。

（3）步骤：取样液2mL于试管中→加入刚配的斐林试剂1mL（斐林试剂甲液和乙液等量混合均匀后再加入）→水浴加热2min左右→观察颜色变化（白色→浅蓝色→砖红色）★模拟尿糖的检测1、取样：正常人的尿液和糖尿病患者的尿液2、检测方法：斐林试剂（水浴加热）或班氏试剂或尿糖试纸3、结果：（用斐林试剂检测）试管内发生出现砖红色沉淀的是糖尿病患者的尿液，未出现砖红色沉淀的是正常人的尿液。

4、分析：因为糖尿病患者的尿液中含有还原糖，与斐林试剂发生反应产生砖红色沉淀，而正常人尿液中无还原糖，所以没有发生反应。

2、脂肪的检测（1）材料的选取：含脂肪量越高的组织越好，如花生的子叶。

（2）步骤：制作切片（切片越薄越好）将最薄的花生切片放在载玻片中央↓ 染色（滴苏丹Ⅲ染液2～3滴切片上→2～3min后吸去染液→滴体积分数50%的酒精洗去浮色→吸去多余的酒精）↓ 制作装片（滴1～2滴清水于材料切片上→盖上盖玻片）↓ 镜检鉴定（显微镜对光→低倍镜观察→高倍镜观察染成橘黄色的脂肪颗粒）3、蛋白质的检测（1）试剂：双缩脲试剂（A液：0.1g/mL的NaOH溶液，B 液：0.01g/mL的CuSO4溶液）（2）步骤：试管中加样液2mL→加双缩脲试剂A液1mL，摇匀→加双缩尿试剂B液4滴，摇匀→观察颜色变化(紫色) 考点提示：（1）常见还原性糖与非还原性糖有哪些？葡萄糖、果糖、麦芽糖都是还原性糖；淀粉、蔗糖、纤维素都是非还原性糖。

第三篇教材实验归纳篇(一)观察类实验[常见实验]1．观察蝗虫精母细胞减数分裂固定装片；2．低温诱导染色体数目加倍[实验指导]1．观察蝗虫精母细胞减数分裂固定装片(1)实验材料的选取宜选用雄性个体生殖器官，其原因为：①雄性个体产生精子数量多于雌性个体产生卵细胞数。

②在动物卵巢内的减数分裂没有进行彻底，排卵时排出的仅仅是次级卵母细胞，只有和精子相遇后，在精子的刺激下，才继续完成减Ⅱ分裂。

(2)实验流程①装片制作(同有丝分裂装片制作过程)：解离→漂洗→染色→压片②显微观察：2．低温诱导染色体数目加倍(1)实验原理①正常进行有丝分裂的组织细胞，在分裂后期着丝点分裂后，子染色体在纺锤体作用下分别移向两极，进而平均分配到两个子细胞中去。

②低温可抑制纺锤体形成，阻止细胞分裂，导致细胞染色体数目加倍。

(2)实验流程①根尖培养：将洋葱等材料放在装满清水的广口瓶上，底部接触水面，置于适宜条件下，使之生根。

②低温诱导：待不定根长至1 cm时，将整个装置放入冰箱的低温室内(4℃)，诱导培养36 h。

③材料固定：剪取根尖约0.5～1 cm，放入卡诺氏液中浸泡0.5～1h，固定其形态，然后用95%酒精冲洗两次。

④制作装片：解离→漂洗→染色→制片(同观察植物细胞的有丝分裂)。

⑤观察：先用低倍镜观察，找到变异细胞，再换用高倍镜观察。

⑥结论：低温能诱导植物染色体数目加倍。

(3)低温诱导植物染色体数目变化的实验中的试剂及其作用(4)与低温诱导植物染色体数目变化有关的3个注意点①显微镜下观察到的细胞是已被盐酸杀死的细胞。

②选材应选用能进行分裂的分生组织细胞，否则不会出现染色体数目加倍的情况。

③对低温诱导植物染色体数目变化的实验原理的理解关键信息：低温处理分生组织细胞、抑制纺锤体形成、染色体不能被拉向两极、不能形成两个子细胞。

错误理解：将“抑制纺锤体形成”等同于“着丝点不分裂”，将低温处理“分生组织细胞”等同于“任何细胞”。

[对应训练]1．为了观察减数分裂各时期特点，实验材料选择恰当的是( )①蚕豆的雄蕊②桃花的雌蕊③蝗虫的精巢④小鼠的卵巢A．①② B．③④C．①③ D．②④C [观察细胞减数分裂的选材标准是易获得且能够观察到全部的分裂时期。

DNA测序实验室工作流程指南1. 实验室工作流程概述实验室工作流程是指在进行DNA测序实验时所需遵循的一系列步骤和规范。

本指南旨在为实验室工作人员提供DNA测序实验的工作流程指导，以确保实验的顺利进行。

2. 实验室工作流程步骤2.1 样品准备- 收集样品并记录相关信息，如样品来源、编号等。

- 确保样品存储条件符合要求，避免污染和降解。

- 检查样品质量并进行必要的前处理，如DNA提取、纯化等。

2.2 文库构建- 准备文库构建所需的试剂和材料。

- 按照文库构建方案进行操作，包括DNA片段剪切、连接适配体等步骤。

- 对文库构建产物进行质检，确保构建成功。

2.3 PCR扩增- 准备PCR反应所需的试剂和引物。

- 设置PCR反应条件，包括温度、时间等。

- 进行PCR扩增反应，并对扩增产物进行质检。

2.4 测序准备- 准备测序所需的试剂和测序芯片。

- 对文库进行纯化和浓度调整。

- 按照测序仪器的要求装载样品到测序芯片上。

2.5 数据分析- 将测序数据导入分析软件进行初步处理。

- 进行序列比对、变异检测等分析。

- 根据实验目的和需求，进行进一步的数据解读和解析。

3. 实验室安全与质量控制- 实验室工作人员应遵守实验室安全操作规范，包括戴手套、穿实验服等。

- 使用经过验证和质控的试剂和材料，确保实验结果的可靠性和准确性。

- 定期进行设备的维护和校准，确保设备正常工作。

- 记录实验过程和结果，以备查证和追溯。

4. 结束语本文档提供了DNA测序实验室工作流程的指南，旨在帮助实验室工作人员进行规范和高效的实验操作。

实验室工作人员应严格按照本指南的步骤进行实验，并遵守实验室安全和质量控制要求，以确保实验结果的准确性和可靠性。

GISH分析一. 染色体制备取材：播种，待根长至2厘米时取材，或发新稍时取幼嫩茎尖。

预处理：取１.５mm左右生长旺盛的根尖或茎尖，饱和对二氯苯处理3-4小时。

前低渗：０.０７５M KCL低渗30分钟。

固定：新鲜３：１乙醇：冰乙酸固定液固定12-24小时。

酶解：２％纤维素酶＋２％果胶酶１：１混合，２８℃下处理约3小时。

制片：吸取２个根尖或茎尖于干净的载玻片上，滴半滴固定液，敲至浆状，滴固定液，火烤至着火。

镜检：检后将符合要求的制片(每张至少50个分散良好且背景干净的分裂相)储存于-70℃下备用。

注意：有良好的染色体形态和干净的背景是关键。

不同的材料需要摸索酶解时间和调整酶解浓度。

二. 探针DNA和封阻DNA制备提取：SDS法或CTAB法提取质量好的总DNA。

打断：将准备做探针的DNA打断成1-10kb,封阻DNA打断成300-600bp，可用枪头不断吸取或开水煮沸、超声波打断。

具体打断条件要根据DNA质量来摸索。

注意：DNA片段长度适宜才有利于标记和杂交。

三. 探针标记及检测切口平移标记法：用Promega公司切口平移标记试剂盒，生物素Biotin 11-dUTP标记。

配方按试剂盒说明。

纯化： Sepharose CL-6B制作柱子，纯化探针。

或者乙醇沉淀纯化探针，也可购买现成的柱子纯化。

点印渍法检测标记效果：点膜：0.5ul探针点于硝酸纤维膜上，同时点对照。

烤膜：80℃，10分钟。

封阻： BufferII(BufferI+3%BSA)，55℃30分钟。

洗膜：BufferI(0.1M Tris-7.5,0.15M NaCl)洗膜2分钟。

偶联：偶联SA-AP溶液 (SA-AP2.5ul,Buffer I 5ml)37℃30分钟，避光。

洗膜：BufferI洗膜，然后BufferIII(0.1Mtris-9.5,0.1MnaCl,0.05MMgCl2)，2分钟。

显色：显色液（NBT/BCIP）37℃10分钟，避光。

玻璃棒缠绕法提取dna
玻璃棒缠绕法（Glass Rod Wrapping Method）是一种用于从生物样本中提取DNA的简单而有效的方法之一。

这种方法通常用于小规模的DNA提取，例如从微生物或其他细胞样本中提取DNA。

以下是玻璃棒缠绕法提取DNA的基本步骤：
材料和试剂：
1. 玻璃棒：表面光滑，不释放DNA的材料。

2. DNA提取缓冲液：含有盐、缓冲液和蛋白酶等成分，有助于裂解细胞膜和蛋白质。

步骤：
1. 样本制备：
-从生物样本中取得待提取的细胞，例如细菌或真菌。

-将样本悬浮于DNA提取缓冲液中。

2. 均匀混合：
-用玻璃棒将样本和DNA提取缓冲液均匀混合，确保样本充分裂解。

3. 缠绕法提取：
-将玻璃棒浸入混合物中，通过在玻璃棒上缠绕的方式吸附DNA。

-玻璃棒的光滑表面有助于DNA的吸附，而且不会释放其他污染物。

4. 洗脱DNA：
-将玻璃棒取出，将DNA从玻璃棒上洗脱。

-通常使用洗脱缓冲液或纯水进行洗脱。

5. 沉淀和收集：
-将洗脱后的DNA用乙醇或异丙醇沉淀。

-使用离心机进行沉淀，然后去除上清液。

-将沉淀后的DNA溶解在适量的缓冲液中。

6. 储存：
-存储提取得到的DNA在冷冻或冷藏条件下，以防止降解。

请注意，这只是一种简单的提取方法，适用于一些小规模的实验。

对于大规模或更高纯度要求的DNA提取，可能需要使用其他专业的提取方法，如酚氯仿法或商业化的DNA提取试剂盒。

在实验设计和操作中，务必遵循相关实验室安全和伦理规定。

DNA及寡核苷酸探针在原位杂交组织化学虽然一般认为DNA探针敏感度不如cRNA探针，但在病毒的检测等领域中DNA探针仍得到广泛的应用。

在原位杂交细胞化学的操作步骤方面与cRNA探针基本相同，所不同的是：（1）杂交时需先在高温80～95℃短时处理，使DNA探针及细胞内靶DNA变性，解离成单链，迅置于冰上冷却。

然后置于37℃～42℃杂交过夜。

（2）RNA酶的溶液的冲洗不能减低背景，因此，在操作步骤中省略此步。

（一）地高辛-碱性磷酸酶（Dig -AKP）标记DNA探针在石蜡包埋切片检测病毒DNA中的应用1．组织前处理（1）固定：组织以10%中性福尔马林液或Bouins液固定，常规石蜡包埋，切片厚4～6μm，粘附于涂有粘附剂的玻片上，入烤箱60～80℃6～8h，使切片更紧贴玻片。

（2）脱蜡：二甲苯10min ×2，自100%乙醇，90%，70%，50%，30%各5min。

入PBS（含5mmol/l MgCl2,pH7.3～7.4）10min×2。

入0.2n HCl 20min以进一步去除蛋白。

（3）50℃2×SSC，含5mmol/l EDTA溶液中30min。

（4）蛋白酶K（1μg/ml溶于0.1mol/l PBS中，）37℃20～25min。

（5）0.2mol/l 甘氨酸液：室温10min，中止蛋白酶反应。

（6）4%多聚甲醛（PBS新鲜配制）：室温20min。

（7）PBS/5mmol/l MgCl2漂洗10min×2。

（8）脱水，自低浓度到高浓度，无水乙醇各3min，空气干燥。

2．预杂交封闭非特异性杂交位点，20μl/每张切片，42℃水浴半小时。

3．杂交10～20μl/每张切片，加盖硅化盖玻片，将切片置于95℃min，使探针及病毒DNA变性，然后迅速置于冰上1min（也有报告用乙醇使之冷却的），然后将切片置于盛有2×SSC湿盒内，42℃过夜（16～18h）。

有丝分裂的制片流程
丝分裂是一种制片技术，也叫折返式复制，是根据有机化学中的折返反应，把一条很
长的DNA变成两条较短的DNA条带。

它可以起到保护DNA，可以有效地防止DNA受到环境
压力和外界灰尘等影响。

丝分裂制片技术包括以下几个步骤：
1. 材料准备：从特定的细菌或植物中提取DNA，在离心台上离心收集悬浮液，然后用清洗液洗净收集的DNA液。

2. 连接：将DNA折起来，使用热力学力学将折线部分做键连，从而在连接处形成双键，形成 DNA双链的折线结构。

3. 分裂：用酶来破坏DNA双链的其中一条，这样就可以把一条较长的 DNA变成一条
较短的DNA条带，完成丝分裂反应。

4. 洗脱：通过洗涤，解离活性体系中的物质，获得丝分裂产物。

5.检测：将分裂后的丝状产物分别用原位杂交法、光波峰注射法、油脂底物染色等技术，对比实验和对照，检测丝分裂的结果。

6.克隆：将经过丝分裂所得到的 DNA放到对应的上清液中，进行克隆，然后将克隆出来的株系放到培养基中。

丝分裂技术不仅能应用于受体研究，还可以用于诊断DNA变异和显示O型抗原（O-Ag）及肠道菌群研究等，因此，它是制片研究中必不可少的技术。

一、细胞内有机物的鉴定1．通过颜色反应对化学物质或结构进行检测2.(1)还原糖的检测选材→制备组织样液→加斐林试剂→水浴加热→出现砖红色沉淀。

(2)脂肪的检测选材→制片→加苏丹Ⅲ(或苏丹Ⅳ)染液染色→漂洗→镜检呈橘黄色(或红色)。

(3)生物组织中蛋白质的鉴定制备样液(豆浆或蛋清稀释液)→鉴定样液(样液加A液1～2 mL振荡摇匀，再加B液3～4滴，摇匀)→呈紫色。

(4)观察DNA和RNA在细胞中的分布制片→用质量分数为8%的盐酸水解5 min→用蒸馏水缓慢冲洗掉盐酸→用吡罗红甲基绿染色剂染色5 min→观察→结果细胞核被染成了绿色，细胞质被染成了红色→结论：DNA主要分布在细胞核中，RNA主要分布在细胞质中。

3．物质鉴定类试题的3个易错点一是不清楚实验试剂的作用对象，如将甲基绿与吡罗红的作用混淆等。

二是不清楚鉴定试剂的使用方法，如还原糖与斐林试剂反应需要水浴加热，但双缩脲试剂、苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ染液、碘液的使用条件则为常温。

三是不清楚斐林试剂和双缩脲试剂的相关使用方法，前者是将甲液、乙液混合均匀后再加入样液，使用时需水浴加热，而双缩脲试剂是先加入A液，形成碱性环境后再滴加B液，使用时无需加热。

1．(2018·青海西宁模拟)下列关于“可溶性还原糖、蛋白质和脂肪鉴定”实验的叙述，正确的是()A.常用番茄、苹果等组织样液作为鉴定植物组织内还原糖的实验材料B.脂肪鉴定中观察花生子叶切片细胞间不可能出现橘黄色小颗粒C.脂肪鉴定中50%的酒精是为了溶解组织中的油脂D.蛋白质鉴定中加入的0.1 g/mL NaOH溶液可为反应提供碱性环境解析：斐林试剂可用于鉴定还原糖，在水浴加热的条件下，溶液的颜色变化为砖红色(沉淀)，番茄的红色会影响实验结果，A错误；切片时，被破坏的子叶细胞会释放出少量脂肪，细胞间会出现橘黄色小颗粒，B错误；脂肪鉴定中50%的酒精主要作用是洗去浮色，C错误；蛋白质在碱性环境中和铜离子反应产生紫色络合物，蛋白质鉴定中加入的0.1 g/mL NaOH溶液可为反应提供碱性环境，D正确。

彗星实验彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验。

实验原理：它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。

当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到电解液中，而核DNA由于分子量太大不能进入凝胶而留在原位。

在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。

由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成"彗星"状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。

DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。

通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。

该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。

同时，这种技术只需要少量细胞。

实验材料：玻片、琼脂糖、细胞裂解液、碱性解链溶液（PH>13,200mM NaOH,1Mm EDTA）、电泳槽、超纯水、DAPI、PBS、荧光显微镜。

实验步骤：1.制片：配制1%的琼脂糖凝胶，于微波炉中加热融化后，浸泡磨砂玻片，用吸水纸将玻片滑面及四周吸干，自然晾干备用；2.细胞处理：将细胞消化收集，离心后吸弃上清，用预冷的1*PBS清洗细胞一次，以1*10^5细胞/ml悬浮细胞；3.铺胶：将细胞与凝胶以一定的比例（1：10）混匀后迅速滴于玻片上，在显微镜下观察细胞的数目（注意调整比例及铺板均匀），4℃黑暗环境中固化10min；4.裂解：轻轻取出玻片，将玻片浸于预冷的细胞裂解液中，4℃避光裂解30-60min;5.解旋：从裂解液中取出载玻片，用PBS浸泡玻片3次，每次3mim,用纸巾吸去玻片上的液体，置于水平电泳槽，加入新鲜配制的碱性电泳缓冲液至高于玻片表面3mm以上，避光解旋30min;6.电泳：电压30V,电流300Ma,电泳30min。

DNA提取原理及步骤简述
DNA提取的步骤主要有裂解、结合、洗涤和洗脱。

以下是各步骤的作用原理：
1.裂解：这一步是必须的，因为DNA通常从细胞或其他生物
物质中被释放出来。

细胞裂解可以通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。

其中，酶作用主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶使细胞破裂，核酸释放。

蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。

2.结合：磁珠表面带负电荷，磁珠buffer是高盐环境有带
正电荷的盐离子，样本被buffer影响，磷酸基团带负电荷。

3.洗涤：核酸的高电荷磷酸骨架使其比蛋白质、多糖、脂肪
等其他生物大分子物质更具亲水性，根据它们理化性质的差异，用选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法
可将核酸分离、纯化。

用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。

乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此
是理性的沉淀剂。

当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。

4.洗脱：加水或者EB破坏高盐环境，形成低盐环境，使
DNA从磁珠上脱落。

请注意，以上步骤的作用原理可能因具体实验条件和设备而有所不同。

在进行实验时，请根据具体情况调整步骤和参数。