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包括显微镜检查、分离培养及鉴定、药敏试验等在的临床微生物的检验方法（检验程序）如何验证？很多人对此非常困惑。
由CNAS2016.5.30新鲜发布的《临床微生物检验程序验证指南》犹如一盏明灯给大家指明了具体的方向。
虽然是针对认可实验室制定的指南文件，其他实验室亦可参考。
部分容节选4.3 显微镜检查显微镜检查程序包括涂片制备、染色镜检和结果报告过程。
实验室在开展各种类型显微镜检查（如革兰染色、抗酸染色、墨汁染色等）前应对本实验室使用的检验程序进行验证，并由经培训有涂片镜检能力的实验室人员操作。
检查方法可包括手工染片法和自动化染片法。
所有样品及其盛放容器均应当作有传染性物质，并按照实验室生物安全要求进行操作。
4.3.1 验证要求显微镜检查程序的验证应包括能力验证/实验室间比对和实验室人员比对（当多名人员从事该项目时）。
如果没有可获得的能力验证或室间质评，实验室应自行组织实验室间比对（宜与通过认可的实验室比对）。
若实验室同时开展手工染片法和自动化染片法，应进行两种方法的实验室部比对。
4.3.2比对方案4.3.2.1 样品数量每项检查应使用至少 5 份样品进行验证，覆盖全部样品类型，无菌样品类型包含阴性和阳性结果。
实验室应优先使用已知结果的留样样品，当不可获取时可采用模拟样品。
4.3.2.2 检验程序按临床标本常规方式处理,由本岗位工作人员使用实验室检验程序进行涂片制备、染色、镜检、判读。
4.3.2.3 结果报告根据实验室程序文件规定进行结果报告，其中抗酸杆菌应根据“分级报告标准”报告镜检结果。
4.3.3 可接受标准每项检查的比对结果符合率≥80% 。
4.4.1 血培养血培养检验程序包括从病人血液采集、运送、接收、孵育及监测的全过程。
目前临床实验室广泛使用全自动血培养系统。
临床微生物实验室血培养系统性能验证的主要目的是评估系统使用的培养基能否用于培养临床常见微生物（包括酵母菌、厌氧菌、苛养菌等）以及仪器（自动化系统）能否及时检测出血液中的大部分病原菌。
环境微生物监测标准操作规程一、监测指征1．感染暴发或感染流行时，环境因素在感染传播中有流行病学意义。
2．监测潜在的危险环境状况，证明有危险的病原体存在或证明危险的病原体已被成功清除。
3．当某项感染控制措施改变时，评估其效果；或者根据规范要求，仪器设备或系统启用时监测。
4．目标性监测的需要。
5．循证医学证据支持。
二、空气监测(沉降法)(一)采样时间：消毒处理后与进行医疗活动之前。
(二)采样高度：距地面垂直高度80～150 cm。
(三)采样点设置1．非洁净房间：室内面积≤30 ㎡，在对角线上设里、中、外3点。
里、外两点位置各距墙1 m；室内面积>30 ㎡，设东、西、南、北、中5点。
其中东、西、南、北4点均距墙1 m。
9 cm直径普通营养琼脂平板在采样点暴露5 min后送检培养。
2．洁净房间：清洁房间在空态或静态条件下，根据房间的不同清洁级别进行布点，操作按照GB 50333—2002。
9cm直径普通营养琼脂平板在采样点暴露30 min后送检培养。
(四)采样注意事项1．采样人员做好手部卫生，佩戴口罩、帽子等个人防护装备。
进入清洁房间采样须穿洁服。
2．皿盖打开顺序应先内后外；手臂及头不可越过培养皿上方；行走及放置动作要轻，尽量减少对空气流动状态的影响；皿盖应扣放，以防污染。
3．采样结束后，由外向内合上皿盖。
4．采样完毕的培养皿应在6 h内培养。
(五)实验室检验1．培养皿在37℃培养48 h后，进行菌落计数和致病菌检验。
普通营养琼脂培养基的配制按照GB／T 4789．28—2003；菌落计数方法按照GB\T 7918．2—1987；致病菌检验：溶血性链球菌检验按照GB／T 4789．11—2003，沙门菌检验按照CB\T 4789．4—2003，铜绿假单胞菌检验按照GB／T7918．4—1987，金黄色葡萄球菌检验按照CB\T 7918．5—1987,，2．计算结果：非洁净房间以100 c㎡的平皿在空气中暴露5 min即相当于10 L 空气中的细菌数，计算公式为：细菌数(cfu／m3)=1 000÷(A／100×t×10／5)×N=50 000N／At式中：t——平皿暴露于空气中的时间(min)；N—一培养后平皿上的菌落数(cfu／平皿)；A——所用平皿的面积(c㎡)。
微生物第章：分枝杆菌属一、概述分枝杆菌属（Bacillus）是革兰氏阳性的芽孢杆菌科中最常见的属之一。
其名称来源于其在培养基上形成的分枝的菌体形态。
该属菌体大小相对较大，形态多样，包括直形、杆形、梭形或球形等不同类型。
分枝杆菌属包括很多种类的细菌，一些种类在自然环境中很常见，有着重要的生态、工业和医学应用价值。
二、生态学和鉴定分枝杆菌属中的细菌生活在许多不同的环境中，包括土壤、水、植物、食品和动物的肠道中。
细菌在自然环境中存在着极为广泛的分布，在枯萎的植物、渣滓、泥炭、海水和河流等地方都可以发现其存在。
在实验室条件下，分枝杆菌属可以通过形态特征、代谢特性和生长特点等鉴定方法进行分离和鉴定。
最常用的方法是通过对分枝杆菌在特定培养基上的生长型态观察和菌落形态分析来确定其种属。
三、病原学分枝杆菌属在人类和动物中可以引起多种疾病，包括但不限于食物中毒、牲畜疾病和人类疾病。
尽管其中很多细菌是无害的或有益的，但某些菌株却可以对人类或动物健康构成威胁。
常见的分枝杆菌病原体包括：芽孢杆菌（B. anthracis）, 糖原芽胞杆菌（B. cereus），乳酸吸收性芽胞杆菌 (B. coagulans) 和枯草杆菌（B. subtilis）等。
分枝杆菌的病原性与其产生的细胞外毒素和内毒素有关，而这些毒素的分泌与生长环境和条件有很大关系。
四、工业应用除了在疾病治疗上的作用外，分枝杆菌属在工业生产中还有广泛的应用。
例如，在饮食加工业中，分枝杆菌可以用于制造豆腐、酱油等食品。
同时，分枝杆菌的一些菌株也可以进行微生物发酵生产出某些化合物，如抗生素、植酸酶、纤维蛋白溶酶等。
这些化合物在医药和普通日常生活中也被广泛使用。
五、分枝杆菌属在自然环境、医学、动物和食品加工业、以及其他工业领域都存在着广泛的应用和研究价值。
随着科学技术的发展和研究范围不断扩大，分枝杆菌属的多样性和作用将会得到更深入的了解和研究。
包括显微镜检查、分离培养及鉴定、药敏试验等在内的临床微生物的检验方法（检验程序）如何验证？很多人对此非常困惑。
由CNAS2016.5.30新鲜发布的《临床微生物检验程序验证指南》犹如一盏明灯给大家指明了具体的方向。
虽然是针对认可实验室制定的指南文件，其他实验室亦可参考。
部分内容节选4.3 显微镜检查显微镜检查程序包括涂片制备、染色镜检和结果报告过程。
实验室在开展各种类型显微镜检查（如革兰染色、抗酸染色、墨汁染色等）前应对本实验室使用的检验程序进行验证，并由经培训有涂片镜检能力的实验室人员操作。
检查方法可包括手工染片法和自动化染片法。
所有样品及其盛放容器均应当作有传染性物质，并按照实验室生物安全要求进行操作。
4.3.1 验证要求显微镜检查程序的验证应包括能力验证/实验室间比对和实验室内人员比对（当多名人员从事该项目时）。
如果没有可获得的能力验证或室间质评，实验室应自行组织实验室间比对（宜与通过认可的实验室比对）。
若实验室同时开展手工染片法和自动化染片法，应进行两种方法的实验室内部比对。
4.3.2比对方案4.3.2.1 样品数量每项检查应使用至少 5 份样品进行验证，覆盖全部样品类型，无菌样品类型包含阴性和阳性结果。
实验室应优先使用已知结果的留样样品，当不可获取时可采用模拟样品。
4.3.2.2 检验程序按临床标本常规方式处理,由本岗位工作人员使用实验室检验程序进行涂片制备、染色、镜检、判读。
4.3.2.3 结果报告根据实验室程序文件规定进行结果报告，其中抗酸杆菌应根据“分级报告标准”报告镜检结果。
4.3.3 可接受标准每项检查的比对结果符合率≥80% 。
4.4.1 血培养血培养检验程序包括从病人血液采集、运送、接收、孵育及监测的全过程。
目前临床实验室广泛使用全自动血培养系统。
临床微生物实验室血培养系统性能验证的主要目的是评估系统使用的培养基能否用于培养临床常见微生物（包括酵母菌、厌氧菌、苛养菌等）以及仪器（自动化系统）能否及时检测出血液中的大部分病原菌。
临床微生物实验室血培养操作标准1 范围本标准规定了血培养标本临床微生物检验的技术要求。
本标准适用于开展血培养的临床微生物实验室。
2 术语一套血培养：从同一穿刺点同时采集的血液标本，分别注入需氧和厌氧瓶；静脉输液港：一种植入皮下，可长期留置在体内的静脉输液装置；HACEK菌群：嗜沫嗜血杆菌、伴放线放线杆菌、人心杆菌、啮氏艾肯菌和金氏金菌；血培养污染率：一般由凝固酶阴性葡萄球菌、革兰阳性棒状杆菌、芽孢杆菌、痤疮丙酸杆菌和微球菌等污染引起的阳性瓶占总送检瓶数的比例。
3 导言人体血液中有很多物质，包括溶菌酶、白细胞、免疫球蛋白、补体等，可在几分钟内将入侵血流的微生物清除。
当微生物感染超出人体免疫系统的防御能力时，人体不能将微生物局限于原始感染的部位，或在治疗中不能通过切除、引流等措施清除感染源，那这些微生物将侵入血液迅速繁殖形成菌血症或真菌血症。
一过性菌血症常发生于对感染灶的外科处理、黏膜的创伤操作和易污染的外科手术，亦可发生于全身或局部感染的早期；间歇性菌血症常发生于腹腔等部位未能及时引流的脓肿；持续性菌血症常发生于感染性心内膜炎等血管内膜感染以及伤寒和波浪热的最初几周。
菌血症是临床急症，应尽快采集血液进行培养。
血培养是对入住急诊科、ICU患者、移植患者以及静脉插管患者的败血症进行早期诊断的一种方法，并根据阳性血培养病原菌的药物敏感性试验，可为临床医生提供最佳的抗菌药物治疗方案，对降低病死率有很大帮助，血培养对于临床诊断和预后评估也具有重要的意义。
4 血样采集和培养瓶接种4.1 采血指证可疑感染患者出现以下一种或几种特征时，可以考虑采集血培养：发热（≧38℃）或低温（≤36℃），寒战，白细胞计数增多（计数＞10.0×109 /L，特别有“核左移”时）或减少（计数＜3.0×109 /L），皮肤黏膜出血，昏迷，多器官衰竭，血压降低，C反应蛋白、降钙素原（PCT）、1，3-β-D-葡聚糖（G试验）升高及突然发生的急性呼吸、体温和生命体征改变。
医院微生物室细菌的形态检查操作规程
一、不染色标本的检查
压滴法和悬滴法。
主要用于检查生活状态下的细菌的动力及运动状况。
将特制好的标本置于显微镜载物台中央，先以低倍镜观察，再用高倍镜观察。
结果：有鞭毛的细菌呈穿梭似流星状运动(有明显的方向性)：无鞭毛的细菌呈布朗运动(只在原地颤动而无位置的改变)。
二、细菌染色标本的检查
染色的第一步是制作涂片。
菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布。
菌落涂片时，先取生理盐水l滴，置玻片上，用接种针挑取菌落，在盐水中涂布。
涂片时必须注意应轻轻操作。
猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式，或造成细菌鞭毛脱落，影响结果的准确性。
制备的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细胞形态改变。
将固定后的涂片进行染色。
2.1、革兰染色
本染色是最基本的染色法，可用于标本涂片或菌落涂片。
染色结果将细菌分为革兰阳性(紫色)和革兰阴性(红色)两类。
2.1.1、试剂。
微生物检验实验室分枝杆菌属检验标准操作规程
1. 概述
分枝杆菌属是一类细长的、具有分枝生长趋势的需氧杆菌，因具有耐受或抵抗酸和乙醇脱色的特点，又称为耐酸或抗酸菌。
分枝杆菌属至今已发现80多个种，除结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌外，其他分枝杆菌，如堪萨斯分枝杆菌、耻垢分枝杆菌等，统称为非结核分枝杆菌。
2. 标本类型
痰液、体液（包括脑脊液、腹水、胸水）组织，粪便等标本。
3. 鉴定
3.1 形态与染色：菌体细长，或稍弯曲，两端钝圆，大小为（0.2~0.5um）
×（1~5um）。
革兰染色不易着色，抗酸染色呈红色。
以痰液直接涂片，结核分枝杆菌多为单个存在，有时呈V、Y、人字形排列，痰菌量多时可排列为束状或集聚成团。
荧光染料金胺“O”染色，在荧光显微镜下观察呈金黄色荧光。
3.2 培养特性：结核分枝杆菌生长缓慢，繁殖一代约需18h，因此在罗氏固
体培养基上需要培养2~6星期方可见到菌落。
菌落多为粗糙型，不透明，乳白为米黄色，呈干燥颗粒状，形似菜花。
液体培养基中结核分枝杆菌生长较快，可形成表面菌膜或沉
于管底。
3.3 生化反应：不发酵糖类，耐热触酶、耐热磷酸酶和吐温80水解试验均
阴性，尿素酶、中性红、结核分枝杆菌烟酸、烟酰胺酶和硝酸盐还原试验均阳性。
3.4鉴别要点：
3.4.1 本菌特征：菌体细长，抗酸染色呈红色；生长缓慢，菌落乳白或米黄
色，呈干燥颗粒状，形似菜花状；不发酵糖类，尿素酶、中性红试验阳性。
3.4.2 与牛分枝杆菌的鉴别：结核分枝杆菌菌体细长，烟酸、烟酰胺酶、硝酸盐还原试验均为阳性；牛分枝杆菌菌体较短、较粗，烟酸、烟酰胺酶、硝酸盐还原试验均为阴性。
3.5 操作步骤
3.5.1 中性培养基
3.5.1.1 标本的处理
痰液：挑取约5ml痰液至已标记的50ml离心试管中，加等量的2%N-乙酰
半胱胺-氢氧化钠前处理液（去污染）；漩涡振荡20秒；静置15分钟，勿超过20分钟；加无菌PBS（pH6.8）至约50ml,盖紧盖子；离心3000r/min，15分钟；倒掉上清液；添加1-3mlPBS(pH6.8)以中和pH至6.8.
体液（包括脑脊液、腹水、胸水）：无菌体液直接接种；标本量>10ml,离心3000r/min，15分钟，取沉淀物接种；污染标本，须同痰液处理方法后再接种。
组织：加1gNALC至组织上溶解组织；加5ml7H9肉汤，以剪刀或研磨器将
组织均匀研碎；取约5ml研磨液至标记的50ml离心试管中，加等量的2%N-乙酰半胱胺-氢氧化钠前处理液；漩涡振荡20秒；静置15分钟，勿超过20分钟；加无菌PBS（pH6.8）至约50ml,盖紧盖子；离心3000r/min，15分钟；倒掉上清液；添加1-3mlPBS(pH6.8)以中和pH至6.8.
粪便：挑取约1g粪便至已标记的50ml离心试管中，；加5ml7H9肉汤，混匀；等量的2%N-乙酰半胱胺-氢氧化钠前处理液（去污染）；漩涡振荡20秒；静置15分钟，勿超过20分钟；加无菌PBS（pH6.8）至约50ml,盖紧盖子；离心3000r/min，15分钟；倒掉上清液；添加1-3mlPBS(pH6.8)以中和pH至6.8.
3.5.1.2 固体培养基接种无菌毛细管吸取消化液后标本0.1ml,滴于中性罗
-琼培养基，将接种过的斜面来回晃动，使菌液均匀铺于斜面上，斜面朝上放37 恒温箱内培养。
每一标本同时接种2支。
3.5.1.3 液体培养基接种标本接种前，在BBL MGIT
便培养管中先加入0.5ml营养添加剂（OADC）和0.1ml杂菌抑菌剂（PANTA）。
接种0.5ml标本至BBL MGIT培养管中。
若一次处理标本较多，可用营养添加剂（OADC）直接溶解杂菌抑菌剂（PANTA），在BBL MGIT培养管中0.8ml混合添加剂；然后接种0.5ml标本至BBL MGIT培养管中。
3.5.2 酸性培养基培养在约5ml痰液中加入等量的4%nNaOH溶液，漩涡振荡20秒；静置15分钟，勿超过20分钟。
无菌吸取消化后标本0.1ml滴于酸性罗-琼培养基，将接种过的斜面来回晃动，使菌液均匀铺于斜面上，斜面朝上放37 恒温箱内培养。
每一标本同时接种2支。
3.6 结果观察
3.6.1 固体培养基接种后3日、7日观察，此后，每周观察一次。
阳性结果涂片证实随时报告。
若7日内报阳，则为快速生长菌，超过7日则为缓慢生长菌。
阴性结果至8周后报告，必要时可延长。
3.6.2 液体培养基系统每天自动记录信号的变化而测知有无分枝杆菌生长，阳性结果经涂片证实后报告。
4. 检验结果解释与分析
4.1 固体培养基报告方式
菌落生长不足斜面1/4 分枝杆菌培养阳性（N个细菌）。
菌落生长占整个斜面1/4 分枝杆菌培养阳性（1+）。
菌落生长占整个斜面1/2 分枝杆菌培养阳性（2+）。
菌落生长占整个斜面3/4 分枝杆菌培养阳性（3+）。
菌落生长铺满整个斜面分枝杆菌培养阳性（4+）。
培养8周仍无菌落生长分枝杆菌培养阴性
4.2液体培养基报告方式
42日内系统显示养阳性，涂片染色抗酸杆菌阳性分枝杆菌液体培养阳性。
42日内系统显示养阳性，涂片染色为非抗酸杆菌阳性标本污染，请重送。
42日内系统显示养阴性，涂片染色为无细菌生长分枝杆菌液体培养阴性。
5.药敏
6. 质量控制
以结核分枝杆菌H37RV为阳性质控，大肠杆菌ATCC25922为阴性质控，每次检测均进行质量控制。
7. 临床意义
结核分枝杆菌为结核病的病原体，不产生内、外毒素，其毒性物质为索状因子硫脂。
人类对其有较高的易感性，最易受损的器官是肺，绝大多数由呼吸道入侵导致感染和发病，很少经消化道和接触感染。
人类初次感染以后有较高的免疫力，可阻止入侵的细菌经淋巴-血流播散，但不能预防再感染。
8.安全防护
8.1 所有操作均在生物安全柜中进行。
8.2 检验人员操作时要穿隔离衣，戴口罩和手套。
8.3 痰盒、试管、离心后上清液、剩余或废弃物标本等污染物装入生物危险袋中，先浸泡消毒，再放入防漏容器中经高压灭菌30分钟后，才能丢弃或清洗。
8.4 实验结束后以75%酒精喷洒安全柜台面；必要时对地面和墙面进行消毒，每周至少一次；清洗完毕，安全柜至少工作15分钟后关机。
打开安全柜及实验室紫外灯消毒2小时。
培养阳性标本的保存参见菌种保存程序。
参考文献
[1]ISO15189；2003医学实验室---质量和能力认可准则
[2]严碧涯,端沐宏瑾主编.结核病变.北京:北京出版。
