2012_2013年新流行猪伪狂_省略_及其gE_TK_gD基因序列分析_余秋颖

目的基因 ｇＥ 基因 ｇＥ 基因 ＴＫ 基因 ｇＤ 基因
片 段 长 度／ｂｐ ８０２ １ ７８７ ９２３ １ ２７５
１．４ 病毒分离 采 集 河 南 省 不 同 发 病 猪 场 的 疑 似 ＰＲ 病猪 脑、扁 桃 体 等 组 织 材 料，剪 碎 后，按 照 １∶５ 加入灭菌 ＰＢＳ液（０．１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ７．２），用组织研磨 棒研 碎，制 成 悬 液，冻 融 ３ 次，８ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离 心５ ｍｉｎ，取上清液用０．２２μｍ 微孔滤器过滤除菌。 取０．５ ｍＬ 的 组 织 滤 液 接 种 到 Ｖｅｒｏ 细 胞，盲 传 ４ 代，待病变稳定、病变率 达 ８０％ 左 右 时 收 获 病 毒 液， 空斑纯 化 后［７］，经 ＰＣＲ 鉴 定 ＰＲＶ 阳 性 者 作 为 第 １ 代 纯 化 病 毒 。 置 －７０℃ 冻 存 备 用 。 １．５ 病 毒 ＴＣＩＤ５０ 测 定 取 病 毒 培 养 物，用 无 血 清 的 ＤＭＥＭ 作 １０ 倍 系 列 稀 释，按 １００μＬ／孔 接 种 １０－４～１０－ ９ 稀 释 度 病 毒 液 到 ９６ 孔 细 胞 培 养 板，每 稀释度８孔，并设正常细胞对照，连续 ４ｄ观察各个 稀释度 ＣＰＥ 产 生 情 况，记 录 结 果，按 Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ 法计算毒株的 ＴＣＩＤ５０［８］。 １．６ 病 毒 中 和 试 验 采 用 固 定 病 毒 稀 释 血 清 法 ，将 伪狂犬 病 病 毒 标 准 阳 性 血 清 用 ５０μＬ 无 血 清 的
＊ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｌｕｈａｕ＠１２６．ｃｏｍ
伪 狂 犬 病 病 毒 （ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ＰＲＶ）属 于 疱疹病 毒 科 α－疱 疹 病 毒 亚 科，又 称 猪 疱 疹 病 毒 Ｉ 型［１］。ＰＲＶ 基因组为线状双链 ＤＮＡ，长 约 １４３ｋｂ，
中 国 兽 医 学 报 ２０１４年１０月 第３４卷 第１０期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｖｅｔ Ｓｃｉ Ｏｃｔ． ２０１４ Ｖｏｌ．３４ Ｎｏ．１０
１５７３
２０１２－２０１３年新流行猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及其 ｇＥ、ＴＫ、ｇＤ 基因 序列分析
余秋颖，常洪涛，陈文定，陈 陆＊ ，明 星，郑关民，张玉娟，韩 莎，王川庆 （河南农业大学 牧医工程学院，
引物名称 ｇＥ－Ｆ１ ｇＥ－Ｒ１ ｇＥ－Ｆ２ ｇＥ－Ｒ２ ＴＫ－Ｆ ＴＫ－Ｒ ｇＤ－Ｆ ｇＤ－Ｒ
上／下 游 上游 下游 上游 下游 上游 下游 上游 下游
表１ ＰＲＶ ｇＥ、ＴＫ 和 ｇＤ 基因扩增引物
引 物 序 列 （５′→３′） ＴＴＧＧＡＴＣＣＣＴＴＴＣＣＧＣＣＧＡＧＡＣＧＡＣＣＣ ＣＧＧＡＡＧＣＴＴＣＧＣＧＧＧＴＧＧＴＡＧＡＴＧＣＡＧ ＧＡＧＡＣＣＡＴＧＣＧＡＣＣＣＴＴＴＣ ＧＴＧＧＧＧＡＴＧＴＣＧＧＡＡＴＧＣ ＧＣＧＴＡＣＴＧＧＣＧＣＡＣＴＣＴＧ ＡＣＧＣＣＧＴＣＧＴＣＧＴＴＧＣ ＣＣＣＡＧＧＴＴＣＣＣＡＴＡＣＡＣＴＣＡＣＣ ＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＧＡＣＧＣＣＧ
收 稿 日 期 ：２０１３－１０－２９ 基 金 项 目 ：国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 （３１２７２５６７） 作 者 简 介 ：余 秋 颖 （１９８７－），女 ，硕 士 。 ＊ 通 讯 作 者 ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｌｕｈａｕ＠１２６．ｃｏｍ
Ｇ＋Ｃ 含 量 高 达 ７３％ 。 ［２］ 基 因 组 由 独 特 长 区 段 （ＵＬ）、短区段（ＵＳ）、及短区段 ２ 侧的末端 重 复 序 列 （ＴＲ）和 内 部 重 复 序 列 （ＩＲ）组 成，基 因 组 可 编 码７０～１００种蛋白［３］。ｇＥ 和 ＴＫ 基因 均 是 ＰＲＶ 的 主要毒力基因和 病 毒 增 殖 的 非 必 需 基 因，编 码 的 蛋 白 在 介 导 细 胞 的 感 染 融 合 、病 毒 在 细 胞 间 的 扩 散 、病 毒粒子的 释 放 及 病 毒 的 嗜 神 经 方 面 发 挥 着 重 要 作 用［４］。ｇＤ 基因所 编 码 的 糖 蛋 白 是 刺 激 机 体 产 生 中
１５７４
中 国 兽 医 学 报 ２０１４年１０月 第３４卷 第１０期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｖｅｔ Ｓｃｉ Ｏｃｔ． ２０１４ Ｖｏｌ．３４ Ｎｏ．１０
和抗体和病毒特异性的细胞免疫应答反应的主要免 疫原性蛋白之一，在 病 毒 复 制 和 细 胞 融 合 过 程 中 是 必需的 。 ［５］
猪是 ＰＲＶ 的原发 感 染 宿 主 和 长 期 储 存 及 排 毒 者。不同年龄段的猪均可以感染 ＰＲＶ，其 中 以 妊 娠 母猪繁殖障碍和哺乳仔猪神经症状及高死亡率为特 征。猪伪狂 犬 病 （ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ，ＰＲ）曾 经 在 世 界 上 广泛分 布，是 危 害 养 猪 业 健 康 发 展 的 重 要 疫 病 之 一 。 ［６］ 随着 ＰＲＶ 基 因 缺 失 疫 苗 及 淘 汰 野 毒 感 染 猪 的综合净化措施 在 规 模 化 猪 场 的 普 遍 推 广，使 得 该 病在世界范围 内 得 到 有 效 控 制。 但 自 ２０１２ 年 初 以 来，河南省部分 地 区 许 多 使 用 基 因 缺 失 活 疫 苗 的 规 模化猪场均出现了疑似 ＰＲ 流行，为 寻 找 其 中 缘 由， 对 ２０１２ 年 ３ 月 至 ２０１３ 年 ６ 月 间 采 集 自 河 南 省 不 同 规模猪场的 ３０ 份 疑 似 ＰＲ 病 猪 脑、扁 桃 体 等 组 织， 经 ｇＥ－ＰＣＲ 方法 检 测 确 定 为 ＰＲＶ 阳 性，接 种 Ｖｅｒｏ 细胞进行病毒分 离 鉴 定 及 部 分 基 因 序 列 分 析，以 探 寻本病再次在中国中部流行的原因及为该病的预防
河南 郑州 ４５０００２）
摘要：２０１２年伊始，猪伪狂犬病（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ，ＰＲ）在河南省部分地区再次暴发。 为 探 寻 其 中 缘 由，对 ２０１２ 年 ３ 月 至 ２０１３年６月间采集的疑似 ＰＲ 病 料 接 种 Ｖｅｒｏ 细 胞 并 经 ＰＣＲ 鉴 定，分 离 到 ４ 株 伪 狂 犬 病 病 毒 （ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ， ＰＲＶ）。同时对该４株病毒的 ｇＥ、ＴＫ 和 ｇＤ 基因进行 ＰＣＲ 扩 增、克 隆、测 序 及 分 析。 序 列 分 析 显 示：４ 株 ＰＲＶ 河 南 分离株的 ｇＥ、ＴＫ、ｇＤ 基因有些核苷酸及氨基酸发生变化，不 同 于 参 考 毒 株；遗 传 进 化 分 析 显 示：４ 株 ＰＲＶ 河 南 分 离 株形成单独１个小亚群，与中国其他地区分离株之间的亲 缘 关 系 较 近，与 欧 洲、南 美 洲 分 离 株 之 间 的 亲 缘 关 系 较 远 ， 推测此４株河南分离毒株是新型国内流行株。 关键词：伪狂犬病病毒；分离鉴定；ｇＥ、ＴＫ、ｇＤ 基因；序列分析 中 图 分 类 号 ：Ｓ８５２．６５ 文 献 标 志 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１００５－４５４５（２０１４）１０－１５７３－０６
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ（ＰＲ）ｈａｓ ｒｅ－ｅｍｅｒｇｅｄ ｗｉｔｈ ｄｅｖａｓｔａｔｉｎｇ ｉｍｐａｃｔ ｉｎ Ｈｅｎａｎ ｓｉｎｃｅ ｅａｒｌｙ ２０１２．Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｒｅａｓｏｎ ｏｆ ｔｈｉｓ ｏｕｔｂｒｅａｋ，ｆｏｕｒ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ（ＰＲＶ）ｗａｓ ｉ－ ｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ＰＲＶ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｒｅａｓ ｏｆ Ｈｅｎａｎ ｄｕｒｉｎｇ Ｍａｒｃｈ ２０１２ｔｏ Ｊｕｎｅ ２０１３ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐａｓｓａｇｅｓ ｉｎ Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌ．Ｔｈｅ ｇＥ，ＴＫ ａｎｄ ｇＤ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ＰＲＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ，ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ｐｏｌｙ－ ｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ｃｌｏｎｅｄ，ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ，ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｇＥ 、ＴＫ ａｎｄ ｇＤ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ＰＲＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｈｅｎａｎ ｈａｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｄｉｆｆｅｒ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＰＲＶ ｓｔｒａｉｎｓ；ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｆｏｕｒ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ＰＲＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｏｔｈｅｒ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｃｈｉｎａ，ｂｕｔ ｄｉｆｆｅｒ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｆｒｏｍ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ａｎｄ Ｓｏｕｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｉｓｏ－ ｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｎｅｗ ＰＲＶ ｐｒｅｖａｉｌｉｎｇ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ Ｈｅｎａｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ（ＰＲＶ）；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｇＥ－ｇｅｎｅ，ＴＫ－ｇｅｎｅ，ｇＤ－ｇｅｎｅ；ｓｅ－ ｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ｐｒｅｖａｉｌｉｎｇ ｆｒｏｍ ２０１２ｔｏ ２０１３ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇＥ，ＴＫ，ｇＤ ｇｅｎｅ
ＹＵ Ｑｉｕ－ｙｉｎｇ，ＣＨＡＮＧ Ｈｏｎｇ－ｔａｏ，ＣＨＥＮ Ｗｅｎ－ｄｉｎｇ，ＣＨＥＮ Ｌｕ＊ ，ＭＩＮＧ Ｘｉｎｇ，ＺＨＥＮＧ Ｇｕａｎ－ｍｉｎ， ＺＨＡＮＧ Ｙｕ－ｊｕａｎ，ＨＡＮ Ｓｈａ，ＷＡＮＧ Ｃｈｕａｎ－ｑｉｎｇ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａ－ ｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２，Ｃｈｉｎａ）
１．７ ｇＥ、ＴＫ 和ｇＤ 基因扩 增 与 克 隆 基 因 组 ＤＮＡ 提 取 按 照 常 规 酚／氯 仿 抽 提 法 进 行，所 提 基 因 组