草原龙胆MADS_box基因的克隆及表达分析

园　艺　学　报　2008,35(6):917-925Acta Horticulturae Sinica矮牵牛M AD S2box基因郭余龙3(西南大学园艺园林学院,重庆400715)摘　要:综述了近年来研究观赏植物矮牵牛MADS2box基因的文献,重点介绍矮牵牛的研究对深入认识该家族基因在植物发育中的作用所做出的重要贡献,及其所揭示的基因功能的保守性和多样性。

对Gen2 Bank中登录的矮牵牛MADS2box基因进行了系统发育分析。

讨论了研究工作中存在的一些问题。

关键词:矮牵牛;MADS2box基因;花发育中图分类号:S68116 文献标识号:A 文章编号:05132353X(2008)0620917209Petun i a M AD S2box Gene Fam ilyG UO Yu2l ong3(Horticulture and L andscape A rchitecture College,Southw est U niversity,Chongqing400715,China)Abstract:MADS2box genes p lay p ivotal r oles in fl ower devel opment.This paper revie ws the p r ogress of petunia MADS2box gene research,and put s pecial e mphasis on the contributi ons of petunia research t o our knowledge about the r oles of p lantMADS2box fa m ily genes in p lant devel opment,and the functi onal conserva2 ti on and diversity ofMADS2box genes in angi os per m s.W e als o reconstruct a phyl ogenetic tree of petunia and other selected MADS2box genes repositted in GenBank and discuss the p r oble m s in the petunia MADS2box gene research.Key words:petunia;MADS2box gene;fl ower devel opmentMADS2box基因编码的蛋白都具有一个与DNA结合的结构域———MADS域(MADS源于最初发现的几个家族成员MC M12AG2DEF2SRF的首字母缩写),它是重要的转录调控因子,广泛存在于动物、植物和真菌中,在发育调控和信号传导等生命活动中发挥重要作用。

草莓MADSbox基因家族生物信息学分析摘要：通过生物信息学的方法，利用拟南芥、水稻的MADS-box基因对草莓MADS-box基因家族进行鉴定和分析，共得到83个草莓MADS-box候选基因，且MADS-box结构域高度保守。

进化分析表明，FvMADS1-FvMADS33可被细分为10个亚组，分别为AG、AGL12、AGL6、AGL2、SE、SVP、FLC、AP3、SOC1、AGL17；FvMADS34-FvMADS83可被细分为4个亚组，分别为Mα（22个成员）、Mβ（1个成员）、Mγ（17个成员）、Mδ（10个成员）。

关键词：草莓；MADS-box转录因子；基因家族；生物信息学S668.403文献标志码： A：1002-1302（2015）11-0021-05收稿日期：2014-12-22基金项目：中国教育学会学校文化研究分会“十二五”教育科研课题（编号：0613278A）。

作者简介：马明臻（1979—），女，山东寿光人，硕士，副教授，主要从事园艺植物栽培研究。

E-mail：[email protected]。

草莓因其浆果营养丰富、鲜红亮丽、酸甜可口、芳香多汁而深受消费者喜爱，我国是世界草莓第一生产大国，但产量水平仍不足发达国家的1/2[1-2]。

由于草莓存在高杂合性、多倍性等问题，使其常规育种周期长、工作量大、效率低。

近年来，随着分子生物学的兴起和发展，草莓生物技术育种获得了极大进步。

MADS-box 基因广泛参与植物花和果实的发育、成熟等多个过程。

开展草莓MADS-box转录因子的研究，有利于探索和解析草莓花、果实在发育成熟等生理过程中的调控机制，并能为生物技术育种提供有价值的信息。

MADS-box转录因子的N末端区域含有一段约为60个氨基酸残基的保守域，称为MADS-box 保守域，负责绑定目的基因中调控区域的CArG盒子（CC（A/T）6GG）[3]。

MADS-box基因家族成员可根据进化关系分为类型Ⅰ（Type Ⅰ）和类型Ⅱ（Type Ⅱ）[4]。

被子植物MADS-box基因研究进展作者：王鹏洋付泽元曲姗姗梁源来源：《农产品加工·上》2019年第07期摘要：MADS-box 基因在大多数被子植物的生长发育环节中发挥着重要的调控作用。

MADS-box基因在其进化史上有一个共同祖先，通过基因的复制和重复以实现进化。

典型的MIKC型MADS-box蛋白的结构域有4个区域，即MADS-box结构域（M）、Intervening结构域（I）、K-box结构域（K）和C-terminal区（C）。

MADS-box基因重要的一项功能就是调控花器官的发育，被人为分为ABCDE 5类，通过不同时间、空间上的特异性表达来实现对萼片、花瓣、雄蕊、心皮等器官发育的调控。

关键词：MADS-box基因;花发育;花器官识别;ABCDE模型中图分类号：Q94; ; ; 文献标志码：A; ; doi：10.16693/ki.1671-9646（X）.2019.07.025Abstract：The plant MADS-box gene plays an important regulatory role in the growth and development of plants. The MADS-box gene has a common ancestor in the history of evolution，and it is repeated through the replication of genes to achieve evolution. The typical MIKC type MADS-box protein has four regions，namely the MADS-box domain（M），the Intervening domain （I），the K-box domain（K）and the C-terminal region（C）. An important function of the MADS-box gene is to control the development of floral organs. It is divided into five categories of ABCDE，which regulate the development of organs such as sepals，petals，stamens，and carpels through specific expression in different time and space.Key words：MADS-box gene;flower development;floral organ recognition;ABCDE model0; ;引言MADS-box基因作为重要的调控基因，在植物生长和发育的许多方面发挥着重要的调节功能[1]。

第32卷第2期V o l.32N o.2草地学报A C T A A G R E S T I A S I N I C A2024年2月F e b.2024d o i:10.11733/j.i s s n.1007-0435.2024.02.006引用格式:余江弟,李玉珠,苗佳敏,等.草地早熟禾B B M L基因的克隆及表达模式分析[J].草地学报,2024,32(2):396-408 Y UJ i a n g-d i,L IY u-z h u,M I A OJ i a-m i n,e t a l.C l o n i n g a n dE x p r e s s i o nP a t t e r nA n a l y s i s o f B B M L G e n e i n P o a p r a t-e n s i s(K e n t u c k y B l u e g r a s s)[J].A c t aA g r e s t i aS i n i c a,2024,32(2):396-408草地早熟禾B B M L基因的克隆及表达模式分析余江弟,李玉珠*,苗佳敏,丁菲菲,白小明,牛奎举(甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心,甘肃兰州730070)摘要:为探究婴儿潮(B A B YB O O M,B B M)基因诱导草地早熟禾(P o a p r a t e n s i s)体胚发生的潜在功能,本研究采用同源克隆方法获得P p B B M L(P p B B M-l i k e)基因,并对其进行生信分析㊁亚细胞定位和表达模式分析㊂结果表明: P p B B M L编码的蛋白具B B M特有的b b m-1基序且定位于细胞核,并与小麦(T r i t i c u ma e s t i v u m)B B M亲缘关系最近㊂P p B B M L的表达水平存在组织特异性,表达量为花药>茎基>幼叶>根茎>老叶>不定根㊂6-B A,N A A(除0h外),M e J A和E B R(除4h外)处理后的P p B B M L表达量均高于C K;G A3处理后的P p B B M L表达量均低于C K㊂在仅添加生长素的愈伤组织诱导培养基上,其表达量在接种第2d最高㊂综上所述,P p B B M L是A P2亚家族的转录因子基因,其表达量在幼嫩组织中最高且受到不同激素的诱导,并在愈伤组织形成初期表达量急剧上升,因此,该基因可能具有诱导草地早熟禾胚性愈伤组织发生的潜力㊂关键词:草地早熟禾;B B M基因;基因克隆;生物信息学分析;表达模式分析中图分类号:S688.4文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2024)02-0396-13C l o n i n g a n dE x p r e s s i o nP a t t e r nA n a l y s i s o f B B M L G e n e i nP o a p r a t e n s i s(K e n t u c k y B l u e g r a s s)Y UJ i a n g-d i,L IY u-z h u*,M I A OJ i a-m i n,D I N GF e i-f e i,B A IX i a o-m i n g,N I U K u i-j u(C o l l e g e o f P r a t a c u l t u r a l S c i e n c e,G a n s uA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y;K e y L a b o r a t o r y o fG r a s s l a n dE c o s y s t e m,M i n i s t r y o fE d u c a t i o n;S i n o-U.S.C e n t e r f o rG r a s s l a n dE c o s y s t e mS u s t a i n a b i l i t y,L a n z h o u,G a n s uP r o v i n c e730070,C h i n a)A b s t r a c t:T o e x p l o r e t h e p o t e n t i a l f u n c t i o no f t h eB A B YB O O M(B B M)g e n e i n i n d u c i n g s o m a t i c e m b r y o-g e n e s i s i n P o a p r a t e n s i s.T h e P p B B M L(P p B B M-l i k e)g e n ew a so b t a i n e dt h r o u g hh o m o l o g o u sc l o n i n g a n da n a l y z e du s i n g b i o i n f o r m a t i c s,s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n,a n de x p r e s s i o n p a t t e r na n a l y s i s.T h er e s u l t s s h o w e d t h a t t h e p r o t e i ne n c o d e db y P p B B M L h a d t h e u n i q u e b b m-1m o t i f o f B B M a n dw a s l o c a t e d i n t h e n u c l e u s,a n dw a s c l o s e l y r e l a t e d t ow h e a t(T r i t i c u ma e s t i v u m)B B M.T h e e x p r e s s i o n l e v e l o f t h e P p B B M L g e n e e x h i b i t s t i s s u e s p e c i f i c i t y,w i t h t h eh i g h e s t e x p r e s s i o n i na n t h e r s,f o l l o w e db y s t e mb a s e,y o u n g l e a v-e s,r h i z o m e s,o l d l e a v e s,a n d a d v e n t i t i o u s r o o t s.T h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f P p B B M L a f t e r t r e a t m e n tw i t h6-B A,N A A(e x c e p t0h),M e J A,a n dE B R(e x c e p t4h)w e r eh i g h e r t h a n t h o s eo f t h e c o n t r o l;h o w e v e r,t h e e x p r e s s i o no f P p B B M L a f t e rG A3t r e a t m e n tw a s l o w e r t h a n t h a t o f t h e c o n t r o l.I n c a l l u s i n d u c t i o nm e d i-u ms u p p l e m e n t e d o n l y w i t h a u x i n,t h e e x p r e s s i o no f P p B B M L p e a k e d o n t h e s e c o n dd a y o f i n o c u l a t i o n.I n s u m m a r y,P p B B M L i sat r a n s c r i p t i o nf a c t o r g e n eo f t h eA P2s u b f a m i l y.I t se x p r e s s i o ni s t h eh i g h e s t i n y o u n g t i s s u e s,i s i n d u c e db y d i f f e r e n th o r m o n e s,a n d i n c r e a s e ss h a r p l y i nt h ee a r l y s t a g eo f c a l l u s f o r m a-t i o n.T h e r e f o r e,t h i s g e n em a y h a v e t h e p o t e n t i a l t o i n d u c e e m b r y o n i c c a l l u s f o r m a t i o n i n P o a p r a t e n s i s. K e y w o r d s:K e n t u c k y B l u e g r a s s;B B M g e n e;G e n e c l o n i n g;B i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s;E x p r e s s i o n p a t t e r n a n a l-y s i s收稿日期:2023-10-30;修回日期:2023-12-07基金项目:草业生态系统教育部重点实验室(甘肃农业大学)2022年开放课题(K L G E202217);甘肃农业大学科技创新基金(青年导师扶持基金)(G A U-Q D F C-2021-02);草种创新与草地农业生态系统全国重点实验室开放基金课题(S K L H I G A202301)资助作者简介:余江弟(1999-),女,汉族,甘肃天水人,硕士研究生,主要从事草类植物分子育种方面研究,E-m a i l:2605257509@q q.c o m;*通信作者A u t h o r f o r c o r r e s p o n d e n c e,E-m a i l:l i y z@g s a u.e d u.c n第2期余江弟等:草地早熟禾B B M L基因的克隆及表达模式分析植物体细胞胚胎(体胚)发生是指由体细胞经过离体培养产生胚状体的过程,该过程可直接从外植体表皮㊁亚表皮㊁悬浮细胞㊁原生质体发生,也可以从脱分化的外植体形成愈伤组织的外部或内部产生[1]㊂玉米(Z e am a y s)㊁小麦和水稻(O r y z a s a t i v a)均可通过体胚发生途径再生完整植株,再生的体胚来自胚性愈伤组织[2-4]㊂随着对植物胚性愈伤组织发生分子机制研究的不断深入,隶属于A P2亚家族的转录因子基因B B M已被证明是植物胚胎发生的关键调节因子,该基因能促进细胞增殖㊁愈伤组织诱导及体胚形成等[5]㊂F l o r e z等[6]发现可可(T h e o b r o m ac a c a o)的B B M基因在种胚和胚性愈伤组织中均高表达,且过表达T c B B M可显著提高可可体胚的诱导率㊂M a u l i d i y a等[7]发现甘蔗(S a c c h a r u mo f f i c i n a r u m)的B B M基因可显著提高其胚性愈伤组织的诱导率及体胚的产生㊂最近的研究表明B B M基因能促进植物尤其是单子叶植物的遗传转化效率㊂L o w e 等[8]利用农杆菌胭脂碱合成酶启动子(N o s:Z m-WU S2)低水平表达WU S2,结合玉米泛素启动子(Z m U b i:Z m B B M)高水平表达B B M成功获得了玉米,高粱(S o r g h u mb i c o l o r),甘蔗和水稻经体胚发生途径再生的转基因植株㊂共表达B B M和WU S 也能明显提高玉米胚性愈伤组织诱导率,进而实现玉米组培执拗型品种的高效遗传转化[2,9]㊂草地早熟禾是温带地区应用最广泛的冷季型草坪草和重要牧草[10]㊂迄今为止,草地早熟禾通过愈伤组织分化再生的研究已有很多报道㊂M c D o n n e l l 等[11]首次用成熟种子诱导出胚性愈伤组织,但植株再生率仅有6%㊂之后,研究者们先后利用不同外植体(幼穂㊁根㊁芽㊁胚根和胚轴等)诱导草地早熟禾愈伤组织,其中,幼穗因组织幼嫩㊁分生能力强㊁再生频率高,其胚性愈伤组织率最高,但该外植体的取材受季节限制[12]㊂愈伤组织的诱导和分化是建立再生体系的关键,而高效的再生体系是草地早熟禾遗传转化的基础[13]㊂K e等[14]采用农杆菌介导法,以草地早熟禾品种 T o u c h d o w n 的胚芽鞘为外植体,通过愈伤组织再生途径最早实现了G U S和r o l C基因的遗传转化,但转化效率仅有3.7%㊂H a等[15]采用基因枪介导法,以草地早熟禾品种 K e n b l u e 的愈伤组织为受体细胞,用含有潮霉素磷酸转移酶基因(h p t)㊁β-葡萄糖醛酸酶基因(u i d A;g u s)和合成绿色荧光蛋白(G F P)基因[s g f p(S65T)]的三个质粒(p A c t1I H P T-4,p A H C15和p A c t1I s G F P-1)共转化,转化率为2.2%㊂佘建明等[16]利用农杆菌侵染草地早熟禾胚性愈伤的方法转化B t基因,共获得5株阳性转化植株,转化率为45%㊂由此可见,尽管草地早熟禾已建立了稳定遗传转化体系,但相对于水稻等模式物种而言,仍存在遗传转化效率低,可转化品种少的问题㊂利用B B M等胚胎发生标记基因提高草地早熟禾胚性愈伤组织诱导率和体胚发生率,有望缩短该草种的遗传转化时间,提高遗传转化效率,实现在更多品种上开展转基因和基因编辑技术㊂目前草地早熟禾的B B M基因仍未得到鉴定,本文以分蘖能力强,根系发达的野生栽培品种 清水 草地早熟禾(P o a p r a t e n s i s Q i n g s h u i )为材料,以Z m B B M1/2的蛋白序列为请求序列,基于本课题组的5个转录组数据库检索并克隆B B M L基因,进而分析其蛋白的理化性质和保守基序,构建系统进化树;通过构建该基因的过表达载体进行亚细胞定位试验;利用实时荧光定量P C R检测P p B B M基因在不同的组织器官和外源激素处理以及不同外植体诱导愈伤组织形成阶段表达水平的差异,以期为进一步验证草地早熟禾B B M基因的胚性愈伤组织诱导功能奠定基础㊂1材料与方法1.1试验材料及处理以 清水 草地早熟禾为材料,将其成熟种子栽种于育苗穴盘,于人工培养室中进行培养㊂期间每星期浇灌1次1/2H o a g l a n d营养液直至长出3~4个叶片,然后进行单株移栽,待移栽苗生长10d后,一部分材料混合单株采集叶片(幼叶㊁老叶)㊁不定根㊁茎(根茎㊁茎基)等不同的组织;另一部分材料叶面喷施N A A (N a p h t a l i cA c e t i cA c i d)(0.1m g㊃L-1),G A3(G i b b e r e l-l i cA c i d)(10μm o l㊃L-1),6-B A(6-B e n z y l a m i n o p u r i n e)(0.1m g㊃L-1),A B A(A b s c i s i cA c i d)(10m g㊃L-1),E T H(E t h y l e n)(200m g㊃L-1),E B R(24-E p i b r a s s i n o l-i d e)(0.01m g㊃L-1)和M e J A(M e t h y l J a s m o n a t e)(0.1 m m o l㊃L-1)等激素[17],每个处理3株以上,C K为喷施蒸馏水㊂喷激素后取样时间点分别为0,2,4,6,12和24h,混合单株采集叶片㊂于2022年5月单株种植 清水 草地早熟禾于甘肃农业大学草坪实训基地(103ʎ34'E,36ʎ5'N),试验地地势由西北向东南倾斜,海拔1517.30m,属中温带气候区,内陆性气候特征明显,易干旱㊂田间管理包括间苗㊁中耕除草㊁适时灌溉㊂于2023年6月10日混合单793草地学报第32卷株采集草地早熟禾的花药㊂将 清水 草地早熟禾成熟种子消毒后,置于1/2 M S基础培养基上,待胚根和初生叶分别长到15~ 20m m和9~10m m时,切取根尖(约5m m长)和叶基(约2~3m m长)为外植体,在添加外源激素(4m g㊃L-12,4-D)㊁3%碳源(根尖用蔗糖;叶基用麦芽糖)和0.7%琼脂的M S基础培养基上诱导愈伤组织[18],每个处理5皿,每皿30个外植体㊂预试验表明,以根尖和叶基为外植体时,均在第3d形成肉眼可见的愈伤组织㊂因此,取样时间设为接种后第0,1,2,3和8d㊂所有采集的样品存于冻存管中,液氮速冻后放于-80ħ冰箱保存,用于基因表达量的荧光定量P C R分析㊂1.2P p B B M L基因的鉴定以2个Z m B B M s蛋白序列(N M_001154063.1, N M_001138224.1)作为鉴定草地早熟禾P p B B M L 基因的请求序列,将本课题组已有的转录组数据作为本地数据库[19-23],利用B i o e d i t软件中的 b l a s t n 功能,E x p e c t a t i o nV a l u e选择1.0E-10,在本地数据库中进行检索㊂将所得到的序列通过N C B I(N a-t i o n a lC e n t e r f o rB i o t e c h n o l o g y I n f o r m a t i o n)网站中的b l a s t X进行验证,之后获得含完整开放阅读框(O R F)的P p B B M L基因㊂1.3P p B B M L基因的克隆采用天根生物科技有限公司的总R N A试剂盒提取草地早熟禾总R N A㊂利用N a n o d r o p2010/2020超微量紫外可见分光光度计检测R N A的浓度和纯度,并通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测R N A的完整性㊂c D N A由T a K a R a公司的P r i m e S c r i p t T M R Tr e a-g e n t K i t w i t h g D N AE r a s e r(P e r f e c t R e a l T i m e)试剂盒反转录生成㊂根据草地早熟禾转录组数据库中鉴定获得的P p B B M L基因序列,利用O l i g o7软件设计特异性引物(表1)㊂以反转录的c D N A为P C R扩增模板,使用P r i m e S T A R G X LD N AP o l y m e r a s e(T a K a-R a)高保真D N A聚合酶进行扩增㊂反应体系为: 12.5μL P r i m e S T A R G X L P r e m i x,1μL c D N A, 1μL P p B B M L-F,1μL P p B B M L-R,9.5μL d d H2O,共25μL㊂反应程序为:98ħ变性10s,55ħ退火15s, 68ħ延伸1m i n,30个循环㊂扩增结束后,将P C R产物经凝胶电泳检测后,切胶回收,进行加A尾反应(M i g h t y T A-c l o n i n g R e a g e n t S e t f o r P r i m e-S T A R ,T a K a R a),通过T A克隆(M i g h t y T A-c l o-n i n g K i t,T a K a R a),将含有P p B B M L基因片段的序列连接到入门载体p C R8/GW/T O P O上,转化大肠杆菌D H5α感受态细胞,获得含有准确目的基因片段的阳性克隆并进行P C R鉴定,挑选阳性克隆送华大基因进行测序并提交N C B I,获得G e n B a n k登录号㊂表1草地早熟禾B B M L基因克隆及q R T-P C R引物序列T a b l e1 C l o n i n g a n d q R T-P C R p r i m e r s e q u e n c e o f B B M L g e n e i n P o a p r a t e n s i s引物名称P r i m e r n a m e序列(5'-3')S e q u e n c e s(5'-3')功能F u n c t i o n P p B B M L-F A T G A T G A A A T C C G G G G A A G A A C基因克隆P p B B M L-R T T C T G G C T T T G T T G G A A T C A G G e n e c l o n i n gp E G101-P p B B M L-F A T G A T G A A A T C C G G G G A A G A A C亚细胞定位p E G101-P p B B M L-R T T C T G G C T T T G T T G G A A T C A G S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n Q-P p B B M L-F C A G A T G C G A A G A A C A A C A C C A q R T-P C RQ-P p B B M L-R T A T A C C C C G C A A T T G T T A C A G GQ-G A P DH-F A G G C C G C A T C T G A G G G A A A C内参基因Q-G A P DH-R T T G C T G T A A C C C C A C T C G T T G R e f e r e n c e g e n e1.4P p B B M L蛋白的生物信息学分析利用表2中的在线软件工具对草地早熟禾B B M L基因编码的蛋白进行生物信息学分析㊂1.5P p B B M L过表达载体构建及亚细胞定位利用L R重组技术,把克隆到入门载体(p C R8/ G W/T O P O)的目的基因片段连接到p E G101载体上,构建p E G101-35S-P p B B M L过表达载体㊂根据P p B B M L基因C D S区设计特异性引物p E G101-P p B B M L-F和p E G101-P p B B M L-R,以草地早熟禾叶片c D N A为模板进行P C R扩增,利用胶回收试剂盒回收D N A并与p E G101-35S-P p B B M L载体连接转化大肠杆菌D H5α,通过质粒小提取试剂盒(T I A N-G E N,北京)获得p E G101-35S-P p B B M L-G F P重组质粒㊂将构建好的载体质粒电转化法转入农杆菌(G V3101),30ħ培养2d,用接种环将农杆菌从固体培养皿上刮下,接于相应抗性的1m LL B液体培养基中,吹打均匀后摇床培养1h,5000r㊃m i n-1,离心893第2期余江弟等:草地早熟禾B B M L 基因的克隆及表达模式分析5m i n ,去上清,收集菌体,用10m m o l ㊃L -1M g C 12(含120μm o l ㊃L -1A S )悬浮液重悬菌体,调O D 600至0.6左右,室温静置3~4h ;挑选生长状况良好的烟草(N i c o t i a n a t a b a c u m )植株,用去枪头的1m L 注射器从烟草叶片下表皮注射,并做好标注;将注射完成的烟草植株弱光培养2d ,即可观察;取标记的农杆菌注射的烟草叶片,制作成玻片,激光共聚焦显微镜下观察,并拍照[24]㊂表2 生物信息学分析软件T a b l e 2 B i o i n f o r m a t i c s a n a l ys i s s o f t w a r e 软件名称S o f t w a r en a m e 分析项目A n a l y s i s p r o je c t 网址W e b s i t eE x P A S y 蛋白理化性质分析A n a l y s i so f p r o t e i n p h y s i c o c h e m i c a l p r o pe r t i e s h t t p s ://w e b .e x p a s y .o r g /p r o t pa r a m /P S I P R E D蛋白的二级结构预测P r e d i c t i o no f S e c o n d a r y S t r u c t u r eo fP r o t e i n s h t t p s ://w w w.n o v o p r o .c n /t o o l s /s e c o n d a r y -s t r u c t u r e -p r e d i c t i o n .h t m l /S W I S S -MO D E L 蛋白的三级结构预测P r e d i c t i o no f t e r t i a r y st r u c t u r eo f p r o t e i n s h t t p s ://s w i s s m o d e l .e x p a s y .o r g/i n t e r a c t i v e /S o f t B e r r y 亚细胞定位预测S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n p r e d i c t i o nh t t p ://w w w.s o f t b e r r y .c o m /b e r r y .p h t m l ?g r o u p =p r o g r a m s &s u b g r o u p =p r o l o c &t o p i c =p r o t c o m pa n E x P A S y 蛋白质亲/疏水性预测P r e d i c t i o no f p r o t e i nh y d r o p h i l i c i t y /h y d r o p h o b i c i t yh t t p s ://w e b .e x p a s y .o r g /pr o t s c a l e /S i g n a l P -5.0蛋白质信号肽预测P r o t e i nS i g n a lP e pt i d eP r e d i c t i o n h t t p s ://s e r v i c e s .h e a l t h t e c h .d t u .d k /s e r v i c e .p h p ?S i gn a l P -5.0D e e p TMHMM 蛋白质跨膜结构预测P r e d i c t i o no f p r o t e i n t r a n s m e m b r a n es t r u c t u r e h t t p s ://s e r v i c e s .h e a l t h t e c h .d t u .d k /s e r v i c e .p h p ?D e e p TMHMM N e t p h o s 蛋白的磷酸化位点预测P r e d i c t i o no f p r o t e i n p h o s p h o r yl a t i o ns i t e s h t t p s ://s e r v i c e s .h e a l t h t e c h .d t u .d k /s e r v i c e .p h p ?Ne t P h o s -3.1M EM E 保守结构域分析C o n s e r v a t i v e s t r u c t u r a l d o m a i na n a l ys i s h t t p s ://m e m e -s u i t e .o r g/m e m e /M E G A7.0进化树分析P h y l o g e n e t i c a n a l ys i s 本地软件L o c a l S o f t w a r e D N AMA N8多序列比对M u l t i p l eS e q u e n c eA l i g n m e n t 本地软件L o c a l S o f t w a r e 1.6 实时荧光定量P C R 分析本研究采用相对定量方法,G A P DH 为内参基因,用O l i go 7软件设计引物㊂选用T a K a R a 公司的T B G r e e n R P r e m i x E x T a q T M I I (T l i R N a s e H P l u s )试剂盒㊂20μL 反应总体积包括2μLc D N A ,6.4μL d d H 2O ,0.8μL 上游和0.8μL 下游引物(10μM )和10μL T B G r e e n P r e m i x E x T a q l l (T l i R N a s e H P l u s )(2ˑ)㊂反应程序为:95ħ预变性30s ,P C R 反应为95ħ变性5s 和60ħ退火30s ,40次循环,溶解曲线分析保留默认,为95ħ持续1s,65ħ持续15s ,95ħ持续1s㊂每个样品设生物学重复3次,技术重复4次,采用2-ΔΔC t法计算基因的相对表达水平[25]㊂利用S P S S22.0和O r i g i n2019软件进行统计分析和作图[26]㊂2 结果与分析2.1 植物总R N A 电泳及浓度检测提取草地早熟禾叶片R N A ,结果显示R N A 条带清晰且完整,符合后续试验要求(图1)㊂用N a n -o d r o p 2010/2020超微量紫外可见分光光度计检测R N A 的浓度和纯度符合要求,提取的草地早熟禾R N A 基本无酶和蛋白污染,可用于后续试验㊂图1 R N A 电泳检测图F i g .1 R N Ae l e c t r o ph o r e s i s d e t e c t i o n c h a r t 注:M 为M a r k e r 2000,1,2和3均为重复N o t e :M ,D L2000D N A M a r k e r ;1,2,a n d3a r e a l l d u pl i c a t e s 2.2 P pB B M L 基因的克隆根据NC B I 数据库中Z m B B M 2(A C G 29578.1)序列信息,在草地早熟禾u n i g e n e _t i l l e r (P R J N A 718697)转录组数据库中检索获得P p B B M L (O R 699039)的序列㊂经N C B I 比对分析,该序列与硬直黑麦草(L o l i -u m r i gi d u m )的B B M 序列比对完整,可进行后续试验㊂根据该基因序列设计特异性引物,以反转录获得的叶片c D N A 为模板,P p B B M L -F 和P p B B M L -R 为引物进行P C R 扩增,获得1个长度为1000b p 左右的基因片段(图2)㊂在筛选培养基上共挑选5个单克隆进行测序,结果正确的有4个㊂1个单克隆的测序结果中间有重叠区域,将序列拼接到一起后,获得的993草 地 学 报第32卷序列与转录组检索到的序列完全一致,目的片段长1128b p ,使用N C B I 在线软件进行比对分析,将其命名为P pB B M L ㊂图2 草地早熟禾B B M L 基因的扩增产物(M 为M a r k e r 2000)F i g .2 A m pl i f i c a t i o n p r o d u c t s o f B B M L g e n e i n P o a p r a t e n s i s (M :D L 2000D N A M a r k e r)2.3 P pB B M L 蛋白的生物信息学分析2.3.1 理化性质分析 利用E x P a S y 中的P r o t -P a r a m 软件对P p B B M L 蛋白进行理化性质分析㊂结果表明,P pB B M L 的分子量为41.05K D ,等电点为(pI )为6.12,属于酸性蛋白;蛋白质分子式为C 1763H 2803N 527O 582S 11;不稳定指数(I n s t a b i l i t y i n -d e x )为46.82,平均亲水指数(G r a n da v e r a g eo f h y -d r o p a t h i c i t y ,G R A V Y )为-0.680,说明P pB B M L 是不稳定的亲水性蛋白[27],脂肪指数(A l i ph a t i c i n -d e x )为68.80;该蛋白无跨膜结构和信号肽;磷酸化位点包括26个丝氨酸(S )㊁12个苏氨酸(T )和6个酪氨酸(Y )(图3)㊂图3 P pB B M L 蛋白磷酸化位点预测F i g .3 P r e d i c t i o no fP p B B M L p r o t e i n p h o s p h o r yl a t i o n s i t e s 2.3.2 二级和三级结构预测 通过在线网站预测了P p B B M L 蛋白质序列的二级结构㊂结果发现,P p B B M L 蛋白二级结构以不规则卷曲和α-螺旋为主,分别占42.82%和32.98%,其次是占13.30%的β-折叠和10.90%的β-转角(图4)㊂P p B B M L 蛋白三维结构均由1个P D B 号为7w q 5.1.A 的结构为模板建立,7w q5.1.A 属于乙烯反应性转录因子WR l 1(E t h y l e n e -r e s po n s i v e t r a n s c r i p t i o n f a c t o r )㊂P p B B M L 序列的一致性为56.32%,范围为185~356a a ㊂P pB B M L 蛋白三级结构与二级结构预测结果一致,均以不规则卷曲和α-螺旋为主(图5)㊂图4 P pB B M L 蛋白质二级结构图F i g .4 S e c o n d a r y s t r u c t u r e o f P pB B M L p r o t e i n 2.3.3 系统进化树构建和基序分析 通过NC B I(h t t p s ://w w w .n c b i .n l m.n i h .g o v /)/P h y t o z o m e v 13(h t t p s ://p h y t o z o m e -n e x t .j g i .d o e .go v /)共获得22个B B M /B B M L 蛋白序列,包括15个单子叶植物和9个双子叶植物,用于系统发育分析[17]㊂分析的B B M/B B M L 序列包括来自有性繁殖单子叶植物节节麦04第2期余江弟等:草地早熟禾B B M L基因的克隆及表达模式分析(T r i t i c u ma e s t i v u m)㊁野生二粒小麦(T r i t i c u m d i c o c-c o i d e s)㊁乌拉尔图小麦(T r i t i c u mu r a r t u)㊁旱麦草(E r-e m o p y r u m t r i t i c e u m)㊁小麦㊁硬直黑麦草(L o l i u mr i g i-d u m)㊁多年生黑麦草(L o l i u m p e r e n n e)㊁梁山慈竹(D e n d r o c a l a m u s f a r i n o s u s)㊁狗尾草(S e t a r i a v i r i d i s)㊁粱(S e t a r i a i t a l i c a)㊁水稻㊁大麦(H o r d e u mv u l g a r e)和玉米的B B M/B B M L序列,来自双子叶植物有性生殖物种拟南芥㊁甘蓝型油菜(B r a s s i c an a p u s)和大豆(G l y c i n e m a x)的B B M/B B M L序列,利用M e g a7.0软件绘制系统发育进化树㊂结果表明,所有的B B M s聚在3个不同的分支(图6)㊂草地早熟禾B B M L与节节麦㊁野生二粒小麦㊁乌拉尔图小麦及小麦的B B M蛋白位于第1分支,其中P p B B M L与T a B B M1亲缘关系最近㊂采用M E M E网站在线预测P p B B M L蛋白的保守基序,设置返回m o t i f参数为10,发现m o t i f1-10在众多物种的B B M/B B M L蛋白中都存在㊂比对发现, m o t i f1和m o t i f3是两个A P2保守结构域,即A P2-R1,A P2-R2㊂说明比对的不同物种B B M/B B M L成员在进化过程中其功能具有高度保守性㊂m o t i f8对应B B M-l i k e基因特有的b b m-1基序㊂根据m o t i f 分析结果,可归为3类:第1类具有10个m o t i f(m o-t i f1-10),包括P p B B M L,T a B B M1,E t B B M, T u B B M1,T d B B M1,A e t B B M1,L r B B M1, L p B B M1,D f B B M和H v B B M2;第2类具有9个m o t i f(m o t i f1-4和m o t i f6-10),包括Z m B B M2和Z m B B M L;第3类具有5个m o t i f(m o t i f1-4和m o-t i f6),包括A t B B M,S v B B M1,S i B B M1,O s B B M1, B n B B M1/2和G m B B M(图6)㊂图5P p B B M L蛋白质三级结构预测F i g.5 P r e d i c t e d t e r t i a r y s t r u c t u r e o fP p B B M L p r o t e in图6P p B B M L蛋白的基序结构和聚类分析F i g.6 M o t i f c o m p o s i t i o na n d c l u s t e r a n a l y s i s o fP p B B M L p r o t e i n注:A e t,节节麦;T d,野生二粒小麦;T u,乌拉尔图小麦;E t,旱麦草;T a,小麦;A t,拟南芥;L r,硬直黑麦草;L p,多年生黑麦草;D f,梁山慈竹; S v,狗尾草;S i,粱;O s,水稻;H v,大麦;B n,甘蓝型油菜;G m,大豆;Z m,玉米N o t e:A e t,A e g i l o p s t a u s c h i i;T d,T r i t i c u md i c o c c o i d e s;T u,T r i t i c u mu r a r t u;E t,E r e m o p y r u mt r i t i c e u m;T a,T r i t i c u ma e s t i v u m;A t,A r a b i-d o p s i s t h a l i a n a;L r,L o l i u m r i g i d u m;L p,L o l i u m p e r e n n e;D f,D e n d r o c a l a m u s f a r i n o s u s;S v,S e t a r i a v i r i d i s;S i,S e t a r i a i t a l i c a;O s,O r y z a s a-t i v a;H v,H o r d e u mv u l g a r e;B n,B r a s s i c a n a p u s;G m,G l y c i n em a x;Z m,Z e am a y s利用D N AMA N8软件对P p B B M L蛋白进行多序列比对发现:该蛋白中检测到2个A P2结构域(A P2-R1和A P2-R2)㊂此外,还检测到e u A N T2,e u A N T3,e u A N T4和b b m-1等4个基序,但P p B B M L蛋白的e u A N T2-e u A N T4基序中存在氨基酸残基差异,因此将其命名为P p B B M L(图7)㊂2.4P p B B M L蛋白亚细胞定位为探究P p B B M L基因编码的蛋白质在细胞内的具体存在部位,本研究构建了p E G101-35S-P p B B M L-G F P表达载体,通过注射烟草叶片观察荧光信号分布情况确定其位置㊂图8的结果表明,空载体在细胞膜及细胞核组分中荧光信号分布均匀且强104草地学报第32卷度较高,无特异性亚细胞定位现象;而P p B B M L-G F P 的较强荧光信号主要分布于细胞核中,与生信分析结构一致,这表明P p B B M L蛋白在细胞内的位置主要存在于细胞核中,该蛋白可能在细胞核中发挥作用㊂图7P p B B M L蛋白与不同植物B B M同源蛋白序列比对分析F i g.7 S e q u e n c e a l i g n m e n t a n a l y s i s o fP p B B M L p r o t e i n sw i t hd i f f e r e n t p l a n tB B M h o m o l o g o u s p r o t e i n s注:蛋白质序列从N C B I和转录组数据库获得㊂M o t i f序列被鉴定并用下划线标注㊂2个A P2结构域用A P2-R1和A P2-R2表示N o t e:P r o t e i n s e q u e n c e sw e r e o b t a i n e d f r o m N C B I a n d t r a n s c r i p t o m ed a t a b a s e s.M o t i f s s e q u e n c e sw e r e i d e n t i f i e da n du n d e r l i n e d.T h e t w o A P2d o m a i n s a r e r e p r e s e n t e db y A P2-R1a n dA P2-R2图8P p B B M L蛋白亚细胞定位情况F i g.8 S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o no fP p B B M L注:用含G F P空载及P p B B M L-G F P重组质粒瞬时转化烟草细胞(图中标尺:50μm)N o t e:T o b a c c oe p i d e r m a l c e l l s w e r e t r a n s i e n t l y t r a n s f o r m e dw i t h c o n s t r u c t s c o n t a i n i n g e i t h e r c o n t r o l(G F P a l o n e)o r P p B B M L-G F P f u s i o n p l a s m i d(b a r s:50μm) 2.5P p B B M L基因的表达分析2.5.1不同组织部位结果表明,P p B BML在不同组织部位的表达量差异较大,存在组织特异性㊂该基因在花药中的表达量最高,是不定根中的8.37倍,显著高于其它组织(P<0.05);在茎基和幼叶中的表达量显著高于根204第2期余江弟等:草地早熟禾B B M L 基因的克隆及表达模式分析茎㊁老叶和不定根(P <0.05),在不定根中表达量最低(图9)㊂2.5.2 不同外源激素处理 为了研究外源性激素对P p B B M L 表达量的影响,对分别喷施N A A ,G A 3,6-B A ,A B A ,E T H ,M e J A 和E B R 的草地早熟禾叶片进行荧光定量分析㊂结果表明,6-B A 处理后的P p B B M L 表达量均高于C K ,处理2h 时表达量最高,是对照的2.91倍,并显著高于其余时间(P <0.05)㊂N A A (除0h 外),M e J A 和E B R (除4h 外)处理后的P p B B M L 表达量均高于C K ,其中,N A A 处理12h ,P p B B M L 表达量最高,是对照的6.64倍;M e J A 和E B R 处理24h ,P p B B M L 的表达量最高,分别是对照的3.47倍和1.91倍㊂G A 3处理后的P pB B M L 表达量均低于C K ,且差异显著(P <0.05)㊂A B A 和E T H 处理后的P p B B M L 表达量在不同时间点表现出不同的变化,A B A 在处理24h 的表达量最高,E T H 在处理12h 表达量最高(图10)㊂图9 草地早熟禾B B M L 基因在不同组织中的表达分析F i g .9 E x p r e s s i o na n a l ys i s o f B B M L g e n e i nd i f f e r e n t t i s s u e s o f P o a p r a t e n s i s注:图中不同小写字母表示在0.05水平差异显著(P <0.05)㊂下同N o t e :D i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s i nt h ef i g u r er e p r e s e n ts i gn i f i c a n t d i f f e r e n c e a t t h e 0.05l e v e l .T h e s a m e a s b e l ow图10 P pB B M L 基因在激素处理下的表达分析F i g .10 E x p r e s s i o na n a l y s i s o f P pB B M L g e n eu n d e r h o r m o n e t r e a t m e n t 304草 地 学 报第32卷2.5.3 不同外植体愈伤组织形成阶段 分别以草地早熟禾的根尖和叶基为外植体,分析愈伤组织形成阶段P p B B M L 基因表达量的动态变化㊂结果显示,以根尖为外植体时,P p B B M L 表达量呈先上升后下降的趋势,接种第2d 时达最大,与其它时间点差异均显著(P <0.05);接种第8d 时,表达量最低,显著低于接种第1d 和第3d (P <0.05)㊂以叶基为外植体时,P pB B M L 表达量在接种第2-3d 时显著高于其它时间点(P <0.05),并在接种第2d 达最大值,显著高于接种第3d (P <0.05);接种第8d 时,表达量最低,与接种第3d 差异显著(P <0.05)(图11)㊂图11 P pB B M L 基因在愈伤组织中的表达分析F i g .11 E x p r e s s i o na n a l y s i s o f P pB B M L g e n e i n c a l l u s t i s s u e 注:RC 0,根尖诱导愈伤组织第0天;R C 1,根尖诱导愈伤组织第1天;R C 2,根尖诱导愈伤组织第2天;R C 3,根尖诱导愈伤组织第3天;R C 8,根尖诱导愈伤组织第8天㊂L C 0,叶基诱导愈伤组织第0天;L C 1,叶基诱导愈伤组织第1天;L C 2,叶基诱导愈伤组织第2天;L C 3,叶基诱导愈伤组织第3天;L C 8,叶基诱导愈伤组织第8天N o t e :R C 0,D a y 0o f r o o t t i p c a l l u s i n d u c t i o n ;R C 1,D a y 1o f r o o t t i p c a l l u s i n d u c t i o n ;R C 2,r o o t t i p c a l l u s i n d u c t i o n d a y 2;R C 3,r o o t t i p ca l l u s i n d u c t i o nd a y 3;R C 8,D a y 8o f r o o t t i p c a l l u s i n d u c t i o n .L C 0,D a y 0o f l e a fb a s ec a l l u s i nd u c t i o n ;L C 1,D a y 1of l e a f b a s e c a l l u s i n d u c t i o n ;L C 2,D a y 2o f l e a f b a s e c a l l u s i n d u c t i o n ;L C 3,D a y 3o f l e a f b a s e c a l l u s i n d u c t i o n ;L C 8,D a y 8of l e a f b a s e c a l l u s i n d u c t i o n 3 讨论3.1 草地早熟禾B B M L 蛋白的理化性质分析解析蛋白的理化性质和空间结构对于认识蛋白的功能㊁功能的执行㊁生物大分子间的相互作用等具有重要意义㊂Y a v u z 等[28]对高粱B B M s 蛋白进行理化性质分析发现,S b B B M -l i k e 1的等电点(p I )为4.85,S b B B M -l i k e 2的等电点为5.99,两个蛋白均为酸性蛋白;S b B B M -l i k e 1被分类为高分子量蛋白质(171k D a ),而S b B B M -l i k e 2为低分子量蛋白质(72k D a );两个蛋白均定位于细胞核㊂杨紫彤等[29]对毛白杨(P o pu l u s t o m e n t o s a )B B M s 蛋白进行理化性质分析发现,P t o B B M 1和P t o B B M 2蛋白分子量各为78.71k D a 和78.44k D a ,理论等电点为5.95和6.08,均属于酸性蛋白;不稳定系数为47.46和48.63,总平均疏水性为-0.816和-0.758,推测均为亲水性不稳定蛋白,不具有信号肽;二㊁三级结构均以不规则卷曲为主;2个B B M 蛋白均定位于细胞核㊂本文检索并克隆得到1个草地早熟禾B B M L基因,对该基因编码的蛋白进行理化性质分析,发现P pB B M L 蛋白属于酸性蛋白;并且是亲水性不稳定蛋白,无跨膜结构和信号肽;二㊁三级结构均以不规则卷曲和α-螺旋为主,与高粱和毛白杨B B M s 蛋白具有相似的理化性质和空间结构㊂蛋白结构决定着其功能,S b B B M 和P t o B B M 已被报道在胚性愈伤组织形成中发挥作用[28-29]㊂因此,推测P pB B M L 可能具有促进草地早熟禾胚性愈伤组织发生的功能㊂3.2 草地早熟禾B B M L 蛋白的保守结构域和基序分析基因的结构域是调控顺式作用元件活性和基因表达的重要因素[30]㊂B B M 基因隶属于A P 2亚家族,该亚家族具有2个A P 2结构域㊂此外,该亚家族还含有3个特定的e u A N T 2-4基序和e u A N T 5,e u A N T 6,b b m -1,b b m -2和b b m -5等5个基序[31]㊂b b m -1是B B M /B B M L 的特有基序,存在于所有已鉴定的B B M /B B M L 基因的蛋白序列中,而e u -A N T 5,b b m -2和b b m -5等基序并不一定在B B M /B B M L 中存在[32]㊂小麦的B B M s 蛋白均有两个404第2期余江弟等:草地早熟禾B B M L基因的克隆及表达模式分析A P2结构域,并具有保守的b b m-1和e u A N T2-e u-A N T6基序;T aB B M蛋白C端的b b m-2,b b m-3和b b m-4基序与其它植物的B B M同源蛋白相比,保守性较低[33]㊂高粱的B B M蛋白具有2个A P2保守结构域和保守的b b m-1,e u A N T2-e u A N T6基序; S b B B M蛋白的C端含有b b m-2,b b m-3和b b m-5基序,但保守性较低[32]㊂本研究通过对草地早熟禾B B M L蛋白序列的同源比对发现,该蛋白具有两个A P2结构域,同时具有b b m-1和e u A N T2,e u-A N T3,e u A N T4基序,但该蛋白的e u A N T2-4基序中存在个别氨基酸残基差异㊂研究表明,A P2结构域高度保守并能特异性结合顺式作用元件如GC C-b o x(核心元件A G C C G C C)或D R E/C R T(核心元件A/G C C G A C)等,在调控植物发育方面具有重要的功能[34]㊂b b m-1基序是B B M蛋白的识别基序,该基序与e u A N T2基序协同工作以调节体胚发生[35]㊂缺失和结构域交换分析表明,B n B B M1需要b b m-1基序协同e u A N T2来诱导拟南芥的体胚发生[35]㊂由此推断,B B M蛋白中的b b m-1和e u A N T2基序协同作用是该蛋白发挥功能的关键㊂草地早熟禾B B M L蛋白的e u A N T2基序存在氨基酸残基变异,这是否会对该蛋白的功能产生影响还有待进一步的研究㊂3.3草地早熟禾B B M L蛋白的系统进化分析系统进化分析可以反映物种之间的进化关系,以及某个基因或蛋白质之间的关系或功能㊂李晓慧[33]检索得到3个小麦B B M基因(T a B B M-3A, T a B B M-3B和T a B B M-3D),进化树分析结果显示3个小麦B B M与二穗短柄草(B r a c h y p o d i u m nd i s-t a c h y o n)的A I L7(A I N T E G UM E N T A-L I K E7)㊁水稻的B B M3和P L T1(P L E T H O R A1)以及玉米㊁谷子(S e t a r i a i t a l i c a)㊁高粱等的B B M蛋白在同一分支上,同源性较高㊂韩少鹏[32]检索得到2个高粱的B B M基因(S b B B M-p u t a t i v e1和S b B B M-p u t a t i v e2),对高粱B B M基因编码的蛋白进行系统进化分析发现,高粱B B M蛋白与拟南芥的B B M㊁水稻的B B M㊁玉米的B B M和油菜的B B M蛋白聚在一起㊂D u等[2]对玉米B B M s基因编码的蛋白进行系统进化分析发现,玉米B B M与水稻B B M3聚集在一起;玉米B B M2与水稻B B M2聚在一起,具有78%的相似性;玉米B B M2与玉米B B M具有43%的相似性㊂本研究对草地早熟禾B B M L蛋白进行系统进化树分析发现,P p B B M L与拟南芥的B B M L 和小麦的B B M1聚集在一起,并与小麦B B M1的亲缘关系最近㊂有研究指出,T a B B M1基因的异位表达可促进体胚的形成[33],因此,推测P p B B M L基因也具有诱导草地早熟禾体胚形成的功能㊂3.4草地早熟禾B B M L基因的组织特异性表达模式分析表达模式分析可揭示不同物种的基因在不同细胞类型㊁组织器官或发育阶段中的表达差异,以此推测基因的功能㊂Y a v u z等[28]研究了高粱的B B M基因在不同组织中的表达模式,发现S b B B M-l i k e1在幼苗的根中表达量最高,其次为胚性愈伤组织,在叶片和地上部组织中表达量较低;与S b B B M-l i k e1相比,S b B B M-l i k e2在胚性愈伤组织中的表达增加了近200倍㊂李晓慧[33]研究了小麦的幼根㊁节间㊁叶㊁茎尖㊁小穗㊁小花㊁14d的胚和不同时期的籽粒中B B M基因的表达模式,结果表明T a B B M s在14d 的胚中的表达水平最高,在幼根㊁叶和不同发育时期的籽粒中也有不同程度的表达,其他部位几乎不表达㊂B i l i c h a k等[36]在小麦胚性小孢子培养中发现T a B B M的表达在籽粒和根中富集㊂B o u t i l i e r等[37]利用m R N A原位杂交技术研究了甘蓝型油菜小孢子衍生的胚和拟南芥种子发育过程中B B M的表达,发现在发育的早期和晚期,在整个小孢子和合子胚发育时期中都检测到B B M表达㊂D u等[2]对培养0,1,2,4,6和8d的玉米未成熟胚进行表达模式分析,发现Z m B B M和Z m B B M2在培养的第2d 开始显著且快速的表达,Z m B B M在第6d时达到峰值,Z m B B M2在第8d时达到峰值㊂本研究发现草地早熟禾的P p B B M L在花药中的表达量最高,其次是茎基,在不定根中的表达量最低㊂K h a n d a y 等[38]发现O s B B M1是在花药中特异表达的转录因子基因㊂在甘蓝型油菜未成熟的花粉粒诱导产生的体胚中分离获得了B B M基因,该基因过表达能促进体胚的发生[37]㊂因此,过表达草地早熟禾的P p B B M L基因很可能也会促进体胚的发生㊂3.5草地早熟禾B B M L基因在激素诱导下的表达模式分析L i等[39]在落叶松(L a r i xk a e m p f e r iˑL.o l-g e n s i s)的B B M中鉴定了许多重要的潜在顺式作用元件,例如A U X R E P S I A A4元件(参与生长素反应性和根分生组织基因表达的元件)㊁A R R1A T元件(参与细胞分裂素反应的元件)㊁G A R E1O S R E P1元504。

植物学通报Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　ｏｆ　Ｂｏｔａｎｙ ２００７，　２４　（１）：　６０－７０，　ｗｗｗ．ｃｈｉｎｂｕｌｌｂｏｔａｎｙ．ｃｏｍ收稿日期：　２００６－０９－２９；　接受日期：　２００６－１１－２４基金项目：　国家自然科学基金（Ｎｏ．　３０１７００９３）＊　通讯作者。

Ｅ－ｍａｉｌ：　ｚｈｍｅｎｇ＠ｉｂｃａｓ．ａｃ．ｃｎＭＡＤＳ－ｂｏｘ基因家族基因重复及其功能的多样性吕山花１，　２　，　孟征２＊１聊城大学农学院园艺工程系，　聊城２５２０５９２中国科学院植物研究所植物信号转导与代谢组学研究中心，　北京１０００９３摘要 基因的重复（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）及其功能的多样性（ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）为生物体新的形态进化提供了原材料。

ＭＡＤＳ－ｂｏｘ基因在植物（特别是被子植物）的进化过程中发生了大规模的基因重复事件而形成一个多基因家族。

ＭＡＤＳ－ｂｏｘ基因家族的不同成员在植物生长发育过程中起着非常重要的作用，　在调控开花时间、决定花分生组织和花器官特征以及调控根、叶、胚珠及果实的发育中起着广泛的作用。

探讨ＭＡＤＳ－ｂｏｘ基因家族的进化历史有助于深入了解基因重复及随后其功能分化的过程和机制。

本文综述了ＭＡＤＳ－ｂｏｘ基因家族基因重复及其功能分化式样的研究进展。

关键词 ＭＡＤＳ－ｂｏｘ基因，　基因重复，　功能分化吕山花，　孟征　（２００７）．　ＭＡＤＳ－ｂｏｘ基因家族基因重复及其功能的多样性．　植物学通报　２４，　６０－７０．在生物体中经常发生基因、基因组片段或整套基因组加倍（ｐｏｌｙｐｌｏｉｄｉｚａｔｉｏｎ）重复现象。

对几种完成或接近完成全基因组测序的真细菌（ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ）、古细菌（ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）和真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ）的基因组序列分析、群体遗传学模拟和分子遗传学实验显示，　在基因组中存在大量的重复基因（Ｚｈａｎｇ，　２００３）。

早在１９３６年，　Ｂｒｉｄｇｅｓ报道了一段染色体带的加倍引起基因重复，从而导致果蝇眼睛严重变小的突变体（Ｂｒｉｄｇｅｓ，　１９３６）。

《羊草类受体蛋白激酶基因鉴定与功能研究》篇一一、引言羊草作为一种重要的牧草资源，在农业生态系统中扮演着重要的角色。

近年来，随着分子生物学技术的快速发展，基因鉴定与功能研究逐渐成为生物学领域的研究热点。

本文以羊草类受体蛋白激酶基因为研究对象，旨在通过对该基因的鉴定及功能研究，为羊草的遗传育种、生态利用和改良提供理论基础。

二、材料与方法1. 材料本研究所用材料为羊草的基因组DNA及cDNA。

2. 方法（1）基因克隆与序列分析：利用PCR技术，从羊草基因组DNA中克隆出受体蛋白激酶基因，并进行序列分析。

（2）生物信息学分析：利用生物信息学软件，对克隆得到的基因序列进行注释、预测其编码的蛋白质结构及功能。

（3）转基因技术：构建过表达和敲低表达载体，利用转基因技术将其导入羊草细胞或组织中，研究其对羊草生长发育及抗逆性的影响。

（4）生理生化分析：通过对转基因羊草的生理生化指标进行测定，如酶活性、蛋白质含量等，探究受体蛋白激酶基因的功能。

三、结果与分析1. 基因克隆与序列分析通过PCR技术成功克隆出羊草类受体蛋白激酶基因，序列分析表明该基因具有典型的激酶结构域，属于受体蛋白激酶家族成员。

2. 生物信息学分析利用生物信息学软件对克隆得到的基因序列进行注释，预测其编码的蛋白质具有激酶活性，参与信号传导等生物学过程。

此外，通过跨膜结构域预测，发现该蛋白具有多个跨膜结构域，可能为膜蛋白。

3. 转基因技术及生理生化分析（1）过表达实验：将过表达载体导入羊草细胞或组织中，发现过表达该基因的羊草表现出更强的抗逆性及生长优势。

（2）敲低表达实验：通过RNA干扰技术敲低该基因的表达，发现羊草的生长速度及抗逆性明显降低。

（3）生理生化分析：测定转基因羊草的酶活性、蛋白质含量等生理生化指标，发现过表达该基因的羊草具有更高的酶活性和蛋白质含量，有利于提高其生物量和抗逆性。

四、讨论本研究鉴定了羊草类受体蛋白激酶基因，并对其功能进行了初步研究。

兰花MADS—box基因研究进展作者：李琼洁江周来源：《安徽农业科学》2017年第06期摘要 MADS-box基因是一类非常重要的转录调控因子，在植物发育和信号传导中起着关键性作用。

包括花器官发育基因，花分生组织特异性基因，促进开花的基因。

研究表明，A类基因可能与花器官发育和控制开花有关；B类基因可能与花被片形态和结构特异有关，并且有些基因在营养器官中也有表达。

关键词 MADS-box基因；兰科植物；花器官发育；表达模式中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）06-0137-04Research Progress of MADS-box Gene in OrchidLI Qiong-jie1，JIANG Zhou2（1.Weinan Normal University， Weinan，Shaanxi 714000；2.Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201）Abstract The MADS-box gene is an important transcription factor， and is the key gene involved in plants growth and signal transmission. Recently， some floral growth genes including floral organ identity genes， meristem identity genes and some genes promoting flower have been identified and separated from different orchids. These researches indicated that the A-function genes might relate to the floral organ development and controlling flower. The B-function genes might regulate the tepals form and special structure. And some genes are expressed in vegetative organs.Key words MADS-box gene；Orchidaceae；Floral development；Expression pattern兰花泛指兰科（Orchidaceae）的所有植物，包括地生兰、附生兰和腐生兰，而我国习惯上将它们分为国兰和洋兰。

棉花学报Cotton Science2020,32(5):404—417https:///10.11963/1002-7807.zamxf.20200831陆地棉MADS-box家族基因鉴定及组织特异性表达分析张爱",王彩香2,宿俊吉2,张先亮3,史春辉2,刘娟娟2,彭云玲卩,马雄风心4*(1.甘肃农业大学农学'，兰州730070；2.甘肃省干旱生境作物学重点实验室/甘肃农业大学生命科学技术学'，兰州730070；3.中国农业科学'棉花研究所，河南安阳455000；4.郑州大学农学'，郑州450001)摘要：％目的]MADS-box蛋白是1种重要的转录因子,参与调控棉花生长发育进程°鉴定分析陆地棉MADS-box家族基因，可为研究其生物学功能奠定基础。

【方法】基于2019年最新组装的陆地棉TM-1参考基因组，通过HMMER3.0软件鉴定陆地棉Type I型及MIKC型MADS-box基因。

利用MapInspect、MEGA7.0(MEME和TBtools软件以及omicshare网站进行染色体定位、多序列比对聚类分析、Motif预测、基因结构鉴定以及组织特异性表达分析。

【结果】从全基因组水平上鉴定出181个陆地棉MADS-box基因(66个Type I型和115个MIKC型),染色体定位发现该181个基因在陆地棉26条染色体上均有分布，其中A组染色体上分布有78个基因、D X上分布有103个基因。

系统进化分析显示Type I型MADS-box蛋白有3个亚家族,MIKC *型和含有10个亚家族的MIKC C型；motif预测结果显示所有MADS-box蛋白均含有型蛋白包括MIKCMADS结构域，基因结构分析结果显示，外显子、内含子结构和长度在各亚家族内具有同一性；组织特异性表达分析发现MADS-box家族基因中有33个在纤维组织中优势表达，103个在花器官中优势表达,41个基因在根茎中优势表达。

第31卷 第11期V o l .31 No .11草 地 学 报A C T A A G R E S T I A S I N I C A2023年 11月N o v . 2023d o i :10.11733/j.i s s n .1007-0435.2023.11.009引用格式:南彦斌,唐德靖,杨永超,等.青海草原毛虫化学感受蛋白基因的鉴定与组织表达分析[J ].草地学报,2023,31(11):3299-3309N A N Y a n -b i n ,T A N G D e -j i n g ,Y A N G Y o n g -c h a o ,e t a l .I d e n t i f i c a t i o na n dE x p r e s s i o nP r o f i l i n g o fC h e m o s e n s o r y P r o t e i nG e n e s i n G y n a e p h o r a q i n gh a i e n s i s (L e p i d o p t e r a :L y m a n t r i i d a e )[J ].A c t aA g r e s t i aS i n i c a ,2023,31(11):3299-3309青海草原毛虫化学感受蛋白基因的鉴定与组织表达分析南彦斌,唐德靖,杨永超,孔一森,周渊涛*(青海大学农牧学院,青海西宁810016)摘要:青海草原毛虫(G y n a e p h o r a q i n g h a i e n s i s )是青藏高原上严重危害高寒草甸的重大害虫㊂本研究基于青海草原毛虫转录组测序数据,利用生物信息学方法及q R T -P C R 技术,对G q i n C S P s 基因进行鉴定及表达谱分析,共鉴定出11个G q i n C S P s 基因,均具有完整的编码区序列㊂其中,G q i n C S P 5和G q i n C S P 8两个基因没有信号肽,G qi n C -S P 4与G q i n C S P 9相似性最高,二三级结构主要由α螺旋和无规则卷曲组成,系统进化表明青海草原毛虫C S P s 与棉铃虫和柑橘凤蝶的亲缘关系较近㊂基因表达谱分析显示,11个青海草原毛虫C S P 基因在雌雄成虫头部㊁雄虫触角以及2龄至7龄阶段中均有表达,且体现不同的表达水平㊂G q i n C S P 1,G q i n C S P 3,G q i n C S P 5,G qi n C S P 8,G qi n C S P 9在2龄阶段的相对表达量显著高于其他阶段(P <0.05)㊂本研究为深入了解青海草原毛虫化学感受机制奠定基础,同时也为寻找青海草原毛虫绿色防治的分子靶标提供理论依据㊂关键词:青海草原毛虫;化学感受蛋白;生物信息学分析;表达谱分析中图分类号:Q 753 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2023)11-3299-11I d e n t i f i c a t i o na n dE x p r e s s i o nP r o f i l i n g o fC h e m o s e n s o r y Pr o t e i nG e n e s i n G y n a e p h o r a q i n g h a i e n s i s (L e p i d o p t e r a :L ym a n t r i i d a e )N A N Y a n -b i n ,T A N G D e -j i n g ,Y A N G Y o n g-c h a o ,K O N G Y i -s e n ,Z H O U Y u a n -t a o *(S c h o o l o fA g r i c u l t u r e a n dA n i m a lH u s b a n d r y ,Q i n g h a iU n i v e r s i t y ,X i n i n g ,Q i n gh a i P r o v i n c e 810016,C h i n a )A b s t r a c t :G y n a e p h o r a q i n gh a i e n s i s i s a s e r i o u s p e s t o f t h e a l p i n em e a d o wo n t h eQ i n g h a i -T i b e tP l a t e a u .I n t h i s s t u d y ,b a s e d o n t h e t r a n s c r i p t o m e s e q u e n c i n g d a t ao f G .q i n gh a i e n s i s ,t h e i d e n t i f i c a t i o na n de x p r e s s i o n p r o f i l eo f G q i n C S P s g e n e sw e r e p e r f o r m e du s i n g b i o i n f o r m a t i c sm e t h o d s a n d q R T -P C R ,11G qi n C S P s g e n e sw e r e i d e n t i f i e d ,a l l o f t h e mc o n t a i n i n g c o m p l e t e c o d i n g r e g i o n s e q u e n c e s .G q i n C S P 5a n d G q i n C S P 8h a d n o s i g n a l p e p t i d e ,G qi n C -S P 4h a d t h e h i g h e s t s i m i l a r i t y t o G q i n C S P 9,a n d t h e s e c o n d a r y a n d t e r t i a r y s t r u c t u r e sw e r em a i n l y c o m p o s e do f αh e l i x a n d r a n d o mc o i l .T h e p h y l o g e n y s u g g e s t e d t h a t C S P s o f G .q i n g h a i e n s i s w e r e c l o s e l y r e l a t e d t o t h o s e o f H e -l i o t h i s a r m i g e r a a n d P a pi l i o x u t h u s .G e n e e x p r e s s i o n p r o f i l i n g s h o w e d t h a t 11C S P g e n e sw e r e e x p r e s s e d i n t h e h e a d s o fm a l e a n d f e m a l e a d u l t s ,m a l e a n t e n n a e a n d t h e s e c o n d a n d s e v e n t h i n s t a r s t a g e sw i t hd i f f e r e n t e x pr e s s i o n l e v e l s .T h e r e l a t i v e e x p r e s s i o no f G q i n C S P 1,G q i n C S P 3,G q i n C S P 5,G q i n C S P 8,a n d G qi n C S P 9w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r i n t h e s e c o n d i n s t a r t h a n i n t h e o t h e r s t a g e s (P <0.05).T h i s s t u d y l a y s a f o u n d a t i o n f o r d e e p un d e r s t a n d -i n g t h e c h e m o s e n s o r y m e c h a n i s m i n G .q i n gh a i e n s i s ,a n d p r o v i d e s a t h e o r e t i c a l b a s i s f o r f i n d i n g t h em o l e c u l a r t a r -g e t s o f gr e e n p r e v e n t i o n a n d c o n t r o l .K e y w o r d s :G y n a e p h o r a q i n g h a i e n s i s ;C h e m o s e n s o r yp r o t e i n s ;B i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s ;E x p r e s s i o n p r o f i l i n g 收稿日期:2023-06-06;修回日期:2023-09-20基金项目:青海省科技厅青年基金项目;草原毛虫嗅觉感受分子机理的研究(2022-Z J -949Q )资助作者简介:南彦斌(1997-),男,汉族,甘肃会宁人,硕士研究生,主要从事昆虫化学生态学研究,E -m a i l :3028356591@q q.c o m ;*通信作者A u t h o r f o r c o r r e s p o n d e n c e ,E -m a i l :1282186715@q q.c o m 化学感受蛋白(C h e m o s e n s o r ypr o t e i n s ,C S P s )是类似六棱柱的小球状蛋白质,以其在信息素感知方面复杂的功能而闻名[1]㊂它有四个保守的半胱氨酸位点,构成C 1-C 2和C 3-C 4两个二硫键,具草地学报第31卷有6个α螺旋[2]㊂在C S P s的研究进程中,其命名发生数次变动,起初由于其在触角中优先表达因此为其命名为嗅觉特异-D蛋白质(O l f a c t o r y-s p e-c i f i c-D p r o t e i n s,O S-D)或信息素结合蛋白A-10 (P h e r o m o n e-b i n d i n gp r o t e i n sA-10)[3],后又在一些昆虫中的感觉器官中(如下唇须和足等)发现该家族基因也可以表达,故又称为感受器官蛋白(S e n-s o r y a p p e n d a g e p r o t e i n,S A P)㊂事实上,它们属于同一类基因,通常作为气味分子和化学信号刺激物的载体蛋白,在感受器树突膜上的受体位点与受体蛋白结合㊂当前,这类蛋白被称为化学感受蛋白(C S P)[4]㊂C S P s可感知宿主气味和性信息素[5],且其功能也可能与肢体修复㊁昼夜节律周期调节㊁生长发育㊁免疫反应㊁摄食行为和杀虫剂抗性有关[6]㊂昆虫触角和下颚须等化学感受部位可以合成化学感受蛋白,合成的C S P s被分泌到淋巴液中,其携带的信息素或挥发物等疏水性物质进入化学感受器的神经元中,引起下游行为反应的发生,因此,化学感受蛋白在昆虫感知外部环境的过程中C S P s起到重要作用[7]㊂C S P s在昆虫中具有高度的保守性,它们的主要功能是与气味分子结合,然后将这些分子运输到受体[8]㊂近年来,随着转录组测序技术的发展,各种昆虫基因组序列被检测,大量的昆虫C S P s基因被鉴定出来㊂C S P s的数量因不同的昆虫物种而异㊂例如,在家蚕B o m b y xm o r i中发现20个C S P,在东亚飞蝗L o c u s t am i g r a t o r i a中发现70个C S P,在意大利蜜蜂A p i s m e l l i f e r a中仅发现6个C S P[9]㊂目前大多数C S P s的功能是未知的㊂因此,C S P s的嗅觉和非嗅觉功能需要进一步研究[10]㊂随着生物技术的快速发展,利用实时荧光定量P C R技术成为研究基因表达与定位的重要手段㊂青海草原毛虫(G y n a e p h o r a q i n g h a i e n s i s)俗称红头黑毛虫,属于鳞翅目(L e p i d o p t e r a)毒蛾科(L y-m a n t r i i d a e)草原毛虫属(G y n a e p h o r a)[11]㊂迄今为止,全球共有15个物种被发现,其中8个是青藏高原特有种[12,13]㊂青海草原毛虫幼虫具有7个龄期,雌雄成虫具有显著的不同,其雌成虫翅㊁触角㊁胸足皆退化[14]㊂在青海地区重点分布在门源㊁海晏㊁天俊㊁泽库㊁玛多㊁甘德㊁祁连㊁杂多和治多等地方[15]㊂此外,其幼虫背部有毒腺,可导致家畜和野生动物的口腔溃疡和断舌病,使它们无法进食,最终导致死亡[16,17]㊂近年来,青海草原毛虫在青藏高原爆发成灾的报道很多,反映出其已能够很好的适应青藏高原缺氧㊁严寒㊁强紫外辐射的极端恶劣的环境[18]㊂青海草原毛虫适应环境能力和繁殖能力强,防治困难,当前青海草原毛虫主要采取化学防治,长期的化学防治必然导致抗药性和农药残留的问题[19]㊂昆虫的C S P s具有作为害虫防控新靶标的潜力,为害虫的绿色防治提供了方向[4]㊂当前,已经获得多种鳞翅目昆虫的C S P s基因[20],但是在青海草原毛虫嗅觉方面的研究较少,且未见关于该虫C S P s基因的研究报道㊂因此,本研究基于青海草原毛虫幼虫及雌雄成虫转录组拟筛选鉴定青海草原毛虫C S P s 并进行生物信息学分析,通过R T-q P C R技术分析青海草原毛虫C S P s基因在不同组织和发育阶段中的表达量,以期为深入研究青海草原毛虫化学感受机制奠定基础㊂1材料与方法1.1供试昆虫供试青海草原毛虫幼虫及成虫来源于2020年5 8月采集自青海省海北州(36ʎ59'06.6ᵡN, 100ʎ52'19.1ᵡE,海拔3095.1m)的野外种群㊂在人工气候箱中将采集的部分青海草原毛虫成虫雌雄配对,置于塑料盒(d=10c m)中进行短期饲养,用牧草提供营养且作为产卵场所收集卵期样品㊂饲养条件:温度(26ʃ1)ħ,光周期16Lʒ8D,相对湿度60%~80%㊂对采集的青海草原毛虫幼虫根据头壳宽度挑选出7龄幼虫,进行短期饲养直至化蛹以收集蛹期样品㊂收集青海草原毛虫雄成虫的触角㊁头(去除触角)㊁胸㊁腹㊁翅和足,获得雄成虫共6种部位的样品㊂青海草原毛虫雌成虫触角㊁翅和足发生退化,收集到头(去除触角)㊁胸㊁腹共3种部位的样品,另外收集了青海草原毛虫卵㊁2至7龄的幼虫和蛹,每种样品取3个生物学重复㊂每个重复收集数量根据组织或个体大小从3~30不等,用液氮速冻分装储存在-80ħ冰箱中备用[21]㊂1.2总R N A提取及c D N A合成通过T r i z o l法提取青海草原毛虫各个样品的总R N A㊂用1%琼脂糖凝胶电泳分析样品R N A完整性及是否存在D N A污染㊂同时,利用超微量分光光度计检测R N A纯度,当O D260n m/O D280n m的范围为1.8~2.2,表明提取的R N A合格㊂之后对检测纯度合格的R N A样品利用反转录试剂盒T R U E s c r i p t1s t S t r a n d c D N AS y n t h e s i sK i t(艾德0033第11期南彦斌等:青海草原毛虫化学感受蛋白基因的鉴定与组织表达分析莱,北京)的说明进行c D N A第一链的合成并置于 20ħ冰箱中保存备用㊂1.3引物设计与合成根据青海草原毛虫转录组数据信息确定并获得青海草原毛虫C S P s基因序列,利用O l i g o7软件设计引物,内参基因(E F1-α-F)引物由兰州大学昆虫实验室筛选获取[18],引物委托北京睿博兴科生物技术有限公司合成㊂表1本研究所用引物T a b l e1 P r i m e r su s e d i n t h e s t u d y基因G e n e上游引物(5'-3')F o r w a r d p r i m e r下游引物(5'-3')R e v e r s e p r i m e r产物大小P r o d u c t s i z e/b p G q i n C S P1G T A A T G G C A G T C G T C G T G T C C T T G T T C G T G A A G A G C T G C A114G q i n C S P2A C C A G A T G C T C T T G A A C A C G T T C C A T A A G T C C G G T C G C T T105G q i n C S P3A C G T T T A C C A G A C T G C T T G C A G C T T T C A A T C C G T C C A A G G80G q i n C S P4C T G T A T G C G G C T G T C A G T G C C A T C A G G T G A A C A C T T T C C C146G q i n C S P5T G A T T G C T T T G A T G A C A C C C A A C G T A A A C A A G G C A T C G T C G96G q i n C S P6G G T G C T T G C C C T C A A T G T A C G C G G A C G A T T T T A G C C C A T T102G q i n C S P7G C C T T G A T T G G G T T G G T T G T T G C C A G T A T C G A G G A A A C A C A127G q i n C S P8C A C C C C A A A A G C A A C C T C T G T G A G C T G T C C T A T T T G C G T G90G q i n C S P9C A T A G T C C T G T G T T G C G T C G T C G T C C A A G T T G A T G T T G T C G81G q i n C S P10T T A G C T T G T G T C A T G G C A G C T C C A T G C T G C A G T C G A A G T A125G q i n C S P11C G A C A A A T G T A C G C C T G A A G A G G A A C G T A T C T T C T G T C G G G117E F1-α-F C C CG C C A A C A T C A C C A C T C G T A A C C A C G A C G C A A C T C C1301.4青海草原毛虫C S P s基因序列获取基于前期通过第二代高通量测序技术对青海草原毛虫4龄幼虫㊁雌雄成虫进行转录组测序的结果[15],以 C S P 和 c h e m o s e n s o r yp r o t e i n s 为关键词在各个库中进行查找,为确定候选基因将所有化学感受蛋白基因序列在N C B I网站的数据库中进行B L A S T n比对㊂利用O R F f i n d e r(h t t p s://w w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/o r f f i n d e r/)预测出O R F完整的核苷酸和氨基酸序列,之后在N C B I中对预测出的O R F氨基酸序列进行B L A S T p验证,设定e值小于10-5,相似性大于40%,得到推测的C S P s蛋白序列㊂1.5青海草原毛虫C S P s基因的生物信息学分析利用E x P A S y-P r o t P a r a m t o o l(h t t p://w e b.e x p a s y.o r g/p r o t p a r a m/)软件对化学感受蛋白氨基酸序列组成㊁相对分子量㊁等电点㊁正负电荷残基数㊁不稳定系数㊁脂肪系数和总平均疏水性进行计算[22]㊂采用S i g n a l p4.1S e r v e r(h t t p://c b s.d t u.d k/se r v i c e s/S i g n a l p/)预测其信号肽㊂利用在线预测网站C l u s t a lO m e g a(h t t p:ʊw w w.e b i.a c.u k/T o o l s/m s a/c l u s t a l o/)对筛选获得的青海草原毛虫C S P s进行同源性比对[23]㊂采用S O P MA(h t t p s://n p s a-p r a b i.i b c p.f r/ c g i-b i n/n p s a_a u t o m a t.p l p a g e=n p s a%20_s o p m a.h t m l)进行蛋白质二级结构预测;S W I S S MO D E L (h t t p s://w w w.s w i s s m o d e l.e x p a s y.o r g/)进行蛋白质的三级结构预测[24]㊂采用D N A M A N6.0软件进行氨基酸多序列比对㊂使用M E G A7.0[25]软件中的邻位相邻算法同其他昆虫构建系统进化树㊂设置参数为重复频次1000,替换方法J o n e s-T a y l o r-T h o r n t o n(J T T)m o d e l,空缺数据的处理95%部分删除,其他参数默认㊂1.6青海草原毛虫C S P s基因的q P C R检测以1.2节合成的c D N A样品为模板,每个样品含3次生物学重复,每次生物学重复进行3次技术重复,通过熔解曲线评估引物的特异性㊂扩增体系为20μL:S Y B R G r e e nR e a l-t i m eP C R M a s t e rM i x 10μL,正反向引物(10μm o l㊃μL-1)各0.8μL,c D-N A1μL(100n g),d d H2O7.4μL㊂在A B I7500型实时荧光定量P C R仪中进行q R T-P C R反应,运行条件:95ħ1m i n;95ħ15s,60ħ15s,循环40次;72ħ45s㊂在成虫的各组织中以每个C S P在雌性头部的表达量为基准,在幼虫中以7龄幼虫为阳性对照㊂1.7数据分析青海草原毛虫C S P s基因在不同组织及不同龄期中的相对表达量利用2-ΔΔC t值法进行计算,其中,ΔC t=C t目的基因-C t内参基因;ΔΔC t=ΔC t样品-ΔC t对照[26]㊂通过S P S S26.0软件进行统计学分析,对C S P s基因在不同组织㊁不同发育阶段的表达量差异进行单因素方差分析(A N O V A),同时利1033草 地 学 报第31卷用D u n c a n 氏新复极差法进行多重比较;最后使用G r a p h pa d p r i s m 绘制基因的组织表达谱㊂2 结果与分析2.1 青海草原毛虫C S P s 的生物信息学分析在青海草原毛虫的基因组数据库中筛选出11个C S P s (表2),经过O R F f i n d e r 与N C B IB L A S T p 验证后,其核苷酸长度大小介于222~381b p 之间㊂G q i n C S P s 的氨基酸大小差异很大,最短的有74个氨基酸,最长的有127个氨基酸,平均长度为112个氨基酸㊂采用软件T r a n s D e c o d e r 预测出该11个G qi n C S P s 的编码区序列都是完整的㊂采用在线网站S i g n a I P 4.1预测其信号肽,结果表明G q i n C S P 5和G q i n C S P 8两个基因没有信号肽㊂将G qi n C S P s 与其他昆虫序列相似性进行比较,G q i n C S P 6基因与菊黄花粉蝶Z e r e n e c e s o n i a 基因序列(G e nB a n k 登录号为X P _038221853)相似度最高,达到84.11%㊂其次,G q i n C S P 2基因与苜蓿盲蝽A d e l p h o c o r i s l i n e o l a t u s 基因序列(G e nB a n k 登录号为A X S 78221)的相似度达到了83.33%㊂G q i n C S P s 基因与其他昆虫物种相似性高于60%的有8个,占总数的72.73%,表明G qi n C S P s 与这些鳞翅目昆虫序列可能同源㊂表2 青海草原毛虫C S P s 生物信息学分析T a b l e 2 B i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s o fC S P s i n G .q i n gh a i e n s i s 基因G e n e登录号G e n B a n ka c c e s s i o nN o .核苷酸长度N u c l e o t i d el e n g t h /b p氨基酸长度A m i n oa c i dl e n gt h /a a C D S 完整性C D Si n t e g r i t y信号肽S i gn a l p e pt i d e B l a s t P 验证B l a s t Pt e s t a n dv e r i f y物种名称B L A S Ta n n o t a t i o n登录号G e n B a n ka c c e s s i o nN o .E 值E -v a l u e相似性I d e n t i t y /%G q i n C S P 1O N 365510378126是Y e s 19A t h e t i s d i s s i m i l i sA N D 824435e -6472.44G q i n C S P 2O N 365511378126是Y e s 16A d e l p h o c o r i s l i n e o l a t u s A X S 782213e -7183.33G q i n C S P 3O N 365512360120是Y e s 19S p o d o p t e r a e x i g u a A K T 264818e -3652.02G q i n C S P 4O N 36551324381是Y e s 17H e o r t i a v i t e s s o i d e sA ZB 493934e -2267.21G q i nC S P 5O N 365514375125是Y e s 无N o n e S p o d o p t e r a e x i g u a A K T 264916e -6575.41G q i n C S P 6O N 365515315105是Y e s 19Z e r e n e c e s o n i a X P _0382218535e -5984.11G q i n C S P 7O N 365516381127是Y e s 16S p o d o p t e r a e x i g u a A K T 264885e -3355.34G q i n C S P 8O N 365517357119是Y e s 无N o n e E o g y s t i a h i p p o p h a e c o l u s A O G 128892e -4270.59G q i n C S P 9O N 36551822274是Y e s 17H e l o p e l t i s t h e i v o r a Q C X 430856e -2270.00G q i n C S P 10O N 365519378126是Y e s 17A t h e t i s d i s s i m i l i s A L J 938103e -5565.87G qi n C S P 11O N 365512330110是Y e s 17H e l i c o v e r pa a s s u l t a A S A 400816e -2239.83利用在线预测网站C l u s t a lO m e g a (h t t p ://w w w.e b i .a c .u k /T o o l s /m s a /c l u s t a l o/)对筛出的11条G qi n C S P s 进行比对(表3),其中相似性最高的是G q i n C S P 4与G q i n C S P 9,为56.76%,相似性最低的是G q i n C S P 5与G qi n C S P 8,为8.05%,G qi n C S P s 序列之间的相似性反映出它们之间的同源性,由此可以得出G q i n C S P 1与G q i n C S P 2和G q i n C S P 4,G q i n C S P 2和G q i n C S P 9以及G q i n C S P 4和G q i n C S P 9之间的同源性都比较高㊂表3 青海草原毛虫化学感受蛋白C S P s 氨基酸序列之间的相似性T a b l e 3 T h e s i m i l a r i t y o f a m i n o a c i d s e q u e n c e s o f c h e m o s e n s o r yp r o t e i n sC S P s f r o m G .q i n gh a i e n s i s 单位:%蛋白P r o t e i n G q i n C S P 1G q i n C S P 2G qi n C S P 3G qi n C S P 4G qi n C S P 5G qi n C S P 6G qi n C S P 7G qi n C S P 8G q i n C S P 9G q i n C S P 10G qi n C S P 11G q i n C S P 1100.00G q i n C S P 244.26100.00G q i n C S P 324.5827.73100.00G q i n C S P 445.6835.9017.95100.00G q i n C S P 529.5132.5237.5022.78100.00G q i n C S P 627.1822.5520.5925.0017.48100.00G q i n C S P 738.5232.2635.9030.7735.5420.00100.00G q i n C S P 814.2917.4411.7617.658.0517.2815.48100.00G qi n C S P 947.3048.6119.7256.7620.8326.0933.3317.74100.00G q i n C S P 1043.9042.2825.8639.2429.1721.7834.6819.2855.41100.00G q i n C S P 1122.2224.5535.7815.2826.3623.4028.7015.3821.2125.23100.002.2 青海草原毛虫C S P s 理化性质分析利用E x P A S y -P r o t P a r a m t o o l (h t t p ://w e b .e x -p a s y .o r g /p r o t pa r a m /)软件对青海草原毛虫化学感受蛋白理化性质进行预测(表4),青海草原毛虫11个C S P s 的氨基酸长度区间是74~127a a,相对分子量在8~15k D 之间㊂其理论等电点大多数位于6附近,如2033第11期南彦斌等:青海草原毛虫化学感受蛋白基因的鉴定与组织表达分析G q i n C S P3-5㊁G q i n C S P7㊁G q i n C S P9-11,表明其属于偏酸性蛋白㊂G q i n C S P1,G q i n C S P2,G q i n C S P6,G q i n C-S P8蛋白理论等电点位于8附近,表明其属于偏碱性蛋白㊂C S P带正电荷和负电荷的残基数目基本相同㊂G q i n C S P1-3,G q i n C S P6-11这7个化学感受蛋白的不稳定系数高于40,表明这些蛋白的性质不稳定㊂从脂肪系数可以看出11个C S P s均为热稳定性蛋白㊂除G q i n C S P1,G q i n C S P2,G q i n C S P8,G q i n C S P10四个蛋白外,其余青海草原毛虫C S P s的总平均疏水性都介于-0.5~0.5之间㊂因此,判定剩余蛋白为两性蛋白质(+值为疏水性,-值为亲水性,-0.5~0.5之间为两性蛋白质)㊂表4青海草原毛虫化学感受蛋白理化性质T a b l e4 T h e p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f c h e m o s e n s o r yp r o t e i n sC S P s f r o m G.q i n g h a i e n s i s蛋白P r o t e i n 氨基酸残基数A m i n o a c i d s相对分子量M o l e c u l a rw e i g h t/K D等电点I s o e l e c t r i c p o i n t/P I负电荷残基N e g a t i v e l y c h a r g e dr e s i d u e s正电荷残基P o s i t i v e l y c h a r g e dr e s i d u e s不稳定系数I n s t a b i l i t yi n d e x脂肪系数A l i p h a t i ci n d e x总平均疏水性A v e r a g eh y d r o p a t h i c i t yG q i n C S P112614.518.24182056.2686.83-0.556 G q i n C S P212614.318.53202341.1892.94-0.533 G q i n C S P312013.394.92171440.5383.83-0.056 G q i n C S P4819.296.54111129.47114.320.211 G q i n C S P512514.004.88211532.3196.88-0.052 G q i n C S P610511.859.2171341.9993.81-0.196 G q i n C S P712714.346.81171734.0096.77-0.112 G q i n C S P811913.419.14131747.2585.29-0.522 G q i n C S P9748.616.91111137.6594.73-0.142 G q i n C S P1012614.445.45221941.1280.63-0.542 G q i n C S P1111012.665.29171450.1688.73-0.2542.3青海草原毛虫C S P s的二级结构预测分析利用S O P M A(h t t p s://n p s a-p r a b i.i b c p.f r/c g i-b i n/n p s a_a u t o m a t.p l p a g e=n p s a%20_s o p m a.h t m l)在线网站预测G q i n C S P s二级结构(图1),发现α螺旋是青海草原毛虫化学感受蛋白的二级结构主要组成部分,除G q i n C S P8和G q i n C S P9外,其他G q i n C S P s的α螺旋含量都比较高,其中G q i n C S P3α螺旋含量最高㊂其次是无规则卷曲㊂β折叠和延伸链的氨基酸残基较少㊂由此,我们推测青海草原毛虫C S P s的二级结构主要由α螺旋和无规则卷曲形成并维持稳定㊂图1青海草原毛虫C S P s的二级结构F i g.1 S e c o n d a r y s t r u c t u r e o fC S P s i n G.q i n g h a i e n s i s注:蓝色竖线为α螺旋㊁绿色竖线为β折叠㊁红色竖线为延伸链㊁紫色竖线为无规则卷曲N o t e:T h eb l u e l i n e i sA l p h ah e l i x;t h e g r e e n l i n eB e t a t u r n;t h e r e d l i n eE e t e n d e d s t r a n d;t h e p u r p l e l i n eR a n d o mc o i l3033草 地 学 报第31卷2.4 青海草原毛虫C S P s 的三级结构的预测采用S W I S S MO D E L (h t t p s ://w w w.s w i s s -m o d e l .e x p a s y .o r g /)网站同源建模得到青海草原毛虫C S P s 蛋白的三级结构模型,结果发现,G qi n C -S P 1-3,G q i n C S P 5-7,G q i n C S P 10和G qi n C S P 11,都由6个α螺旋组成,各个螺旋之间都由半胱氨酸形成二硫键相互缔合,二硫键对三级结构起到支撑作用,其三维结构形成一个亲水的表面和一个疏水的空腔,由此形成一个闭合的可以容纳小分子的疏水性结合腔(图2)㊂G q i n C S P 4,G q i n C S P 8和G qi n C -S P 9建模后,与其他的蛋白三级结构差异较大,α螺旋结构较少㊂图2 青海草原毛虫C S P s 的三级结构F i g .2 P r e d i c t i o nm a p o fC S P s t e r t i a r y s t r u c t u r e i nG .q i n gh a i e n s i s 2.5 青海草原毛虫C S P s 基因的多序列比对利用D N A M A N 6.0软件对G q i n C S P s 进行多序列比对,通过比对得到10个G q i n C S P s 的半胱氨酸模式识别序列为C 1-X 6-C 2-X 11-19-C 3-X 2-C 4(C 为半胱氨酸,X 为任意氨基酸)(图3),这和已经发现的鳞翅目昆虫C S P s 家族无差异㊂但是,图中反映出G qi n C -S P 8序列不属于保守半胱氨酸序列,原因可能是在青海草原毛虫的进化过程中某些基因片段自然消除㊂图3 青海草原毛虫11个化学感受蛋白C S P 1~C S P 11的氨基酸序列比对F i g .3 S e q u e n c e a l i g n m e n t o f a m i n o a c i d s o f 11c h e m o s e n s o r yp r o t e i n sC S P 1-C S P 11i nG .q i n gh a i e n s i s 注:图中黑色C 1-4代表保守半胱氨酸模式序列N o t e :T h eb l a c kC 1-4r e p r e s e n t s t h e c o n s e r v e d c y s t e i n e p a t t e r n s e q u e n c e i n t h e f i gu r e 2.6 青海草原毛虫C S P s 基因的系统进化分析为明确青海草原毛虫C S P 与其他近缘种的进化关系,采用N J 法构建青海草原毛虫化学感受蛋白与其他昆虫的C S P s 系统发育树,参与建树的包4033第11期南彦斌等:青海草原毛虫化学感受蛋白基因的鉴定与组织表达分析括青海草原毛虫的11个C S P 氨基酸序列和其他5种昆虫的68个C S P 氨基酸序列㊂结果显示青海草原毛虫11个C S P 在整个进化系统中分布比较分散,但所有的G q i n C S P s 与鳞翅目昆虫C S P s 聚到一起(图4)㊂其中G qi n C S P 1和H a r m C S P 19㊁G q i n C S P 2和H a r m C S P 20㊁G qi n C S P 5和P x u t C -S P 12㊁G q i n C S P 8和E h i p C S P 5㊁G q i n C S P 10和P x u t C S P 8及G qi n C S P 11和P x u t C S P 11b 聚到同一个小分支中㊂因此,青海草原毛虫C S P s 与棉铃虫和柑橘凤蝶亲缘关系最近㊂图4 基于氨基酸序列采用邻接法构建的青海草原毛虫化学感受蛋白与其他昆虫化学感受蛋白的系统进化树F i g .4 P h y l o g e n e t i c t r e e o fC S P s i n G .q i n gh a i e n s i s w i t h t h o s e f r o mo t h e r i n s e c t sb a s e do na m i n o a c i d s e q u e n c e s b y t h en e i g h b o r j o i n i n g me t h o d 注:青海草原毛虫化学感受蛋白1-11㊁沙棘木蠹蛾㊁柑橘凤蝶㊁小线角木蠹蛾㊁棉铃虫㊁东亚飞蝗N o t e :G q i n C S P 1~11,E o g y s t i ah i p p o p h a e c o l u s (E h i p ),P a p i l i ox u t h u s (P x u t ),S t r e l t z o v i e l l ai n s u l a r i s (S i n s ),H e l i o t h i sa r m i g e r a (H a r m ),L o c u s t am i gr a t o r i a (L m i g )2.7 青海草原毛虫C S P 基因的组织表达谱为明确青海草原毛虫功能,以雄虫头部作为阳性对照,通过R T -q P C R 技术测定11个C S P 基因在青海草原毛虫不同部位的相对表达量差异情况,结果表明,11个G q i n C S P s 基因在雌雄成虫头部和雄虫触角中均有表达,且体现不同的表达水平,其中:G qi n C -S P 2在雄虫头部的表达量显著高于雌虫头部(P <0.05),其余C S P 基因在雌雄成虫头部的表达无显著差异,而G q i n C S P 1,G q i n C S P 2,G q i n C S P 4,G q i n C -S P 5,G qi n C S P 10在雌性成虫头部的相对表达量显著高于其他组织(P <0.05);G q i n C S P 3,G qi n C S P 7,G q i n C S P 10,G qi n C S P 11在雄成虫触角的相对表达量显著高于其他组织(P <0.05)㊂此外,G qi n C S P 1,G q i n C S P 3,G q i n C S P 4,G q i n C S P 5,G q i n C S P 9,G qi n C -S P 10在雌雄成虫胸部不表达或微量表达;G q i n C -S P 1,G q i n C S P 2,G q i n C S P 8,G q i n C S P 10在雌雄成虫腹部的表达存在显著差异,且呈现雄性偏好表达模式,而G qi n C S P 3则呈现雌性偏好表达模式(P <0.05);G q i n C S P 2,G qi n C S P 10在雌雄成虫胸翅部不表达或微量表达;G q i n C S P 4,G q i n C S P 5,G q i n C S P 6,G q i n C S P 8,G q i n C S P 9在雄性成虫足中的相对表达量显著高于其他组织(P <0.05)(图5)㊂5033草 地 学 报第31卷2.8 青海草原毛虫C S P 基因不同发育阶段表达谱不同发育阶段,青海草原毛虫C S P 基因表达水平显著不同㊂以7龄幼虫作为阳性对照,测定11个C S P 基因在青海草原毛虫不同发育阶段的相对表达量差异情况㊂结果表明,11个青海草原毛虫C S P 基因在2龄与7龄阶段均有表达,且体现不同的表达水平,G q i n C S P 1,G q i n C S P 3,G qi n C -S P 5,G q i n C S P 8,G qi n C S P 9在2龄阶段的相对表达量显著高于其他阶段(P <0.05)㊂此外,G q i n C -S P 11在卵中的相对表达量明显高于其他发育阶段(P <0.05);G q i n C S P 7在3龄阶段的表达量极高,是4龄幼虫表达量的140倍;G qi n C S P 9和G qi n C S P 4分别在三龄和四龄幼虫中不表达(图6)㊂图5 青海草原毛虫雌雄成虫化学感受蛋白基因组织表达谱分析F i g .5 T h e t i s s u e e x p r e s s i o n p r o f i l e o f c h e m o r e c e p t o r p r o t e i n g e n e s i nm a l e a n d f e m a l e a d u l t s o fG .q i n gh a i e n s i s 注:雌虫;雄虫;头(去除触角);胸;腹;触角;翅;足㊂E F -1-α作为内参基因进行校正各组织的表达量,目的基因在雄性头部中表达量作为阳性对照㊂误差线表示3次独立试验的标准误,不同的大小写字母表示不同的雌雄组织之间的显著性差异(D u n c a n :P <0.05)㊂单星号和双星号表示目的基因在同一组织的相对表达量雌雄间差异显著(t 检验,*P <0.05;**P <0.01)N o t e :H e a d (w i t h a n t e n n a e r e m o v e d )(H d ),T h o r a x (T h ),A b d o m e n (A b ),A n t e n n a e (A n ),W i n g s (W g ),L e g s (L g).E F -1-αw a s u s e d a s a r e f e r e n c e g e n e t o c o r r e c t t h e e x p r e s s i o n l e v e l i n e a c h t i s s u e ,a n d t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f t h e t a r g e t ge n e i n t h em a l e h e a d s e r v e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l .E r r o r l i n e s r e p r e s e n t t h e s t a n d a r d e r r o r of 3i n d e p e n d e n t t r i a l s .D i f f e r e n t u p p e r c a s e l e t t e r s i n d i c a t e a s i gn i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n d i f f e r e n t t i s s u e s o fm a l e a n d f e m a l e (D u n c a n :P <0.05).As i n g l e a s t e r i s ko r d o u b l e a s t e r i s k i n d i c a t e a s i g n i f i c a n t o r v e r y s i gn i f i c a n t d i f f e r -e n c e o f t h e r e l a t i v e e x p r e s s i o no f t h e t a r ge t g e n e i n t h e s a m e t i s s u e (t -t e s t ,*P <0.05;**P <0.01)6033第11期南彦斌等:青海草原毛虫化学感受蛋白基因的鉴定与组织表达分析图6 青海草原毛虫化学感受蛋白基因在不同发育阶段的表达谱F i g .6 E x p r e s s i o n p r o f i l e o f c h e m i c a l s e n s o r yp r o t e i n g e n e s i nG .q i n gh a i e n s i s a t d i f f e r e n t d e v e l o p m e n t s t a g e s 注:E g g ,卵;2L ,二龄幼虫;3L ,三龄幼虫;4L ,四龄幼虫;5L ,五龄幼虫;6L ,六龄幼虫;7L ,7龄幼虫;P u p a ,蛹㊂统计分析所用的方法为单因素方差分析(D u n c a n 检验,不同字母代表差异显著,P <0.05);误差棒代表3次生物学重复试验的标准误N o t e :2L ,s e c o n d i n s t a r ;3L ,t h i r d i n s t a r ;4L ,f o u r t h i n s t a r ;5L ,f i f t h i n s t a r ;6L ,s i x t h i n s t a r ;7L ,s e v e n t h i n s t a r .T h em e t h o d u s e d f o r s t a t i s t i c a l a n a l y s i sw a s o n e -w a y a n a l y s i s o f v a r i a n c e (D u n c a n t e s t ,d i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s r e p r e s e n t a s i gn i f i c a n t d i f f e r e n c e a t P <0.05);e r r o rb a r s t h e s t a n d a r d e r r o r s f o r 3b i o l o g i c a l r e pl i c a t e s 3 讨论本研究从青海草原毛虫的基因组数组库中,共鉴定得到11个青海草原毛虫C S P s 基因,其数目少于菜粉蝶P i e r i s r a pa e (38个C S P s )[27],悬铃木方翅网蝽C o r yt h u c h ac i l i a t a (26个C S P )[28],蚜虫A c y r t h o s i p h o n p i s u m (13个C S P s )但数目多于意大利蜜蜂A p i sm e l l i fe r a (6个C S P s )[29],甘蓝蚜L i -p a p h i s e r y s i m i (8个C S P s )[30],点蜂缘蝽R i p t o r t u s pe d e s t r i s (4个C S P )基因[31]㊂青海草原毛虫C S P s 属于分泌型疏水性蛋白,热稳定性较高㊂除G qi n C -S P 5和G qi n C S P 8外都有信号肽㊂全长的C S P s 序列,无信号肽的原因推测是不具有信号肽剪切位点造成的[24]㊂二级结构预测显示,G qi n C S P s 主要由α螺旋和无规则卷曲组成㊂三级结构预测显示,8个G qi n C S P s 三级结构具有6个α螺旋,表明青海草原毛虫C S P s 种内结构相似度高,三维结构相似的化学感受蛋白可能在昆虫寻找寄主㊁识别定位中具有相似的功能[32]㊂多序列比对的结果表明G qi n C S P 8蛋白序列不属于保守半胱氨酸序列,推测其原因可能有两点:一是青海草原毛虫在进化时自然丢失[33]㊂二是在高通量转录过程中造成基因片段的缺失㊂G qi n C S P s 系统发育分析表明,大部分G q i n C S P s 与柑橘凤蝶P a pi l i ox u t h u s 和棉铃虫H e l i o t h i s a r m i g e r a 聚到同一个小分枝上㊂只有少数几个G qi n C S P s 没有聚在同一个小分枝上,但聚7033草地学报第31卷集在同一个大进化枝上,表明这些物种的C S P基因可能拥有共同的祖先,但为了适应不同的环境,后来逐渐分化成不同的基因型㊂基因功能研究的重要参考手段是表达谱分析[34]㊂本研究利用用q R T-P C R技术对青海草原毛虫不同发育阶段和成虫不同组织中的表达情况进行了分析,G q i n C S P s基因在雌雄成虫头部和雄虫触角中均有表达,且体现不同的表达水平㊂这与张志春等[35]研究的小菜蛾C S P不仅在化学器官中表达,而且在其它非感受器官也有表达的结果相同,表明G q i n C S P s可能参与昆虫化学感受以外的其它生理过程㊂G q i n C S P3在雌虫的腹部高表达,推测其原因:G q i n C S P3对雌虫激素分泌㊁卵巢发育及产卵等众多生理过程起着重要作用[36]㊂G q i n C S P2在雄虫头部的表达量显著高于雌虫头部,这表明该基因可能与性别特异性行为有关[37]㊂本研究获得的G q i n C S P3,G q i n C S P7,G q i n C S P10,G q i n C S P11在雄成虫触角中表达量较高,推测其在雄虫寻找和定位寄主植物的过程中发挥重要作用[38]㊂G q i n C-S P4,G q i n C S P5,G q i n C S P6,G q i n C S P8,G q i n C S P9在雄足中的表达量最高,推测这五个基因可能与昆虫的运动行为相关,有助于其生长发育并扩大分布范围[39],同时也反应了青海草原毛虫对外环境的一种适应机制㊂不同发育阶段的青海草原毛虫表达谱显示, G q i n C S P1,G q i n C S P3,G q i n C S P5,G q i n C S P8, G q i n C S P9在2龄阶段的相对表达量显著高于其他阶段,推测其原因是这些基因在幼虫信息素运输中发挥着关键作用[40]㊂G q i n C S P11在卵中的相对表达量明显高于其他发育阶段,这与谭瑶等[41]的研究结果,G d H s p70在卵期高表达相同,推测其可能参与胚胎的正常发育[42]㊂因此,G q i n C S P s在不同组织与发育阶段的表达谱非常复杂,表明它们在青海草原毛虫的生长发育和化学感受过程中起着至关重要的作用㊂4结论本研究基于青海草原毛虫转录组测序数据,利用生物信息学方法首次鉴定出青海草原毛虫的11个C S P基因,之后对其表达谱进行分析,发现11个青海草原毛虫C S P基因在雌雄成虫头部㊁雄虫触角以及2龄至7龄阶段中均有表达,且体现不同的表达水平,为进一步研究青海草原毛虫嗅觉识别机制提供了理论基础㊂参考文献[1] L I U G X,X U A N N,R A J A S H E K A RB,e t a l.C o m p r e h e n s i v eh i s t o r y o fC S P g e n e s:E v o l u t i o n,p h y l o g e n e t i cd i s t r i b u t i o na n df u n c t i o n s[J].G e n e s,2020,11(4):413-413[2] B A 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o f o d o r a n t-b i n d i n g a n dc h e m o s e n s o r yp r o t e i n g e n e s i nv i r u s v e c t o r N e p h o t e t t i x c i n c t i c e p s[J].I n s e c t s,2022,13(11): 1024-1024[7] P E N T Z O L DS,B U R S EA,B O L A N D W.C o n t a c t c h e m o s e n s a-t i o no f p h y t o c h e m i c a l s b y i n s e c t h e r b i v o r e s[J].N a t u r a l P r o d-u c tR e p o r t s,2017,34(5):478-483[8] WA N G K,H E Y Y,Z HA N G YJ,e ta l.C h a r a c t e r i z a t i o no ft h e c h e m o s e n s o r yp r o t e i nE f o r C S P3a n d i t s p o t e n t i a l i n v o l v e-m e n t i n h o s tl o c a t i o n b y E n c a r s i a f o r m o s a[J].J o u r n a lo fI n t e g r a t i v eA g r i c u l t u r e,2023,22(2):514-525[9]A G N I H O T R IA,L I U N Y,X U W.C h e m o s e n s o r yp r o t e i n s(C S P s)i n t h e c o t t o nb o l l w o r m H e l i c o v e r p a a r m i g e r a[J].I n-s e c t s,2021,13(1):29-29[10]MA C,Y U E Y,Z H A N G Y,e ta l.S c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o-s c o p i c a n a l y s i so fa n t e n n a l s e n s i l l aa n dt i s s u e-e x p r e s s i o n p r o-f i l e so fc h e m o s e n s o r y p r o t e i ng e n e si n O ph r a e l l ac o m m u n a(C o l e o p t e r a:C h r y s o m e l i d a e)[J].I n s e c t s,2022,13(2):183-183[11]Y U A N M L,Z H A N G QL,G U OZL,e t a l.T h e c o m p l e t em i-t o c h o n d r i a l g e n o m eo f G y n a e p h o r aa l p h e r a k i i(L e p i d o p t e r a: L y m a n t r i i d a e)[J].M i t o c h o n d r i a lD N A P a r tA,2016,27(3): 984175[12]WA N G H Z,Z H O N G X,Z H A N G G R,e t a l.T r a n s c r i p t o m ec h a r a c t e r i z a t i o na nd ge n ee x p r e s s i o na n a l y s i sr e l a t e dt oi m-m u n e r e s p o n s e i n G y n a e p h o r a q i n g h a i e n s i s p u p a e[J].J o u r n a l o fA s i a-P a c i f i cE n t o m o l o g y,2020,23:458-469[13]Y A NL,WA N G G,L I U CZ.N u m b e ro f i n s t a r sa n ds t a d i u md u r a t i o n o f G y n ae p h o r am e n y u a n e n s i s(L e p i d o p t e r a:L y m a n t r i-i d a e)f r o m Q i n g h a i-T i b e t a nP l a t e a u i nC h i n a[J].A n n a l s o f t h eE n t o m o l o g i c a l S o c i e t y o fA m e r i c a,2006,99(6):1012-1018[14]严林.草原毛虫属的分类㊁地理分布及门源草原毛虫生活史对8033。

麦类作物学报 2024,44(1):46-55J o u r n a l o fT r i t i c e a eC r o ps d o i :10.7606/j.i s s n .1009-1041.2024.01.06网络出版时间:2023-12-08网络出版地址:h t t ps ://l i n k .c n k i .n e t /u r l i d /61.1359.S .20231206.1722.002黑麦M I K C 型M A D S -b o x 家族基因的鉴定和表达分析收稿日期:2023-06-19 修回日期:2023-09-28基金项目:中央引导地方科技发展资金项目(236Z 6303G );河北省科技厅重点研发项目(21326340D );河北省高校基本科研业务费项目(2022J K 04)第一作者E -m a i l :180********@163.c o m (汪凯旋)通讯作者E -m a i l :t x a m e u px @163.c o m (魏莱)汪凯旋,车永和,杨赟杰,杨静,杨燕萍,魏莱(河北科技师范学院农学与生物科技学院/河北省作物逆境生物学重点实验室,河北秦皇岛066000)摘 要:M I K C 是MA D S -b o x 蛋白家族中一类保守的转录因子家族,参与调控植物的开花时间和花器官发育㊂通过对黑麦M I K C 基因家族的分析,为研究黑麦各时期组织器官的功能奠定基础㊂利用P F a m 和B L A S T P 两种方法确定黑麦M I KC 家族共47个蛋白序列,将以上蛋白序列利用T B t o o l s 软件进行理化性质㊁进化关系㊁保守基序和基因结构㊁共线性及聚类分析等生物信息学分析㊂将黑麦47个M I K C 基因分为12个亚家族,共线性分析发现黑麦与小麦的共线性基因多于黑麦与水稻间的共线性基因,说明黑麦与小麦的亲缘关系更近㊂聚类结果结合黑麦物种内共线性分析发现,S c M I K C 31基因仅在穗子表达,于其他植物组织器官及发育时期均无表达,选用课题组材料进行R N A -s e q 验证,结果与生物信息学结果一致,推测S c M I K C 31基因为黑麦中与开花有关的基因㊂以上结果说明M I K C 家族基因在黑麦中存在功能分化,为进一步研究该家族基因的功能提供信息参考㊂关键词:生长因子;黑麦;进化分析;表达分析;M I K C 基因中图分类号:S 512.5;S 330 文献标识码:A 文章编号:1009-1041(2024)01-0046-10I d e n t i f i c a t i o n a n dE x p r e s s i o nA n a l y s i s o fM I K C M A D S -B o xG e n e F a m i l y i nR ye W A N G K a i x u a n ,C H EY o n g h e ,Y A N GY u n j i e ,Y A N GJ i n g ,Y A N GY a n p i n g,W E IL a i (C o l l e g e o fA g r o n o m y a n dB i o t e c h n o l o g y ,H e b e iN o r m a lU n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n dT e c h n o l o g y /H e b e iK e y L a b o r a t o r yo fC r o p S t r e s sB i o l o g y ,Q i n h u a n gd a o ,He b e i 066000,C h i n a )A b s t r a c t :M I K C i s a c o n s e r v e d t r a n s c r i p t i o nf a c t o r f a m i l y i n t h eMA D S -b o x p r o t e i n f a m i l y,i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o no f f l o w e r i n g t i m ea n df l o r a l o r g a nd e v e l o p m e n t i n p l a n t s .T h ea n a l ys i so f t h e M I K C g e n e f a m i l y i n r y e l a y s t h e f o u n d a t i o n f o r t h e s t u d y o f t h e f u n c t i o n o f t h e r y e t i s s u e s a n d o r g a n s a t v a -r i o u s s t a g e s .P F a m a n dB L A S T P m e t h o d sw e r eu s e dt o i d e n t i f y 47p r o t e i ns e q u e n c e so f r ye M I K Cf a m i l y ,a n dT B t o o l s s o f t w a r ew a s u s e d t o c o n d u c t p h y s i c o -c h e m i c a l p r o p e r t y,e v o l u t i o n ,c o n s e r v a t i v e m o t i f a n d g e n e s t r u c t u r e ,c o l l i n e a r i t y ,c l u s t e r a n a l y s i s o f t h e a b o v e p r o t e i n s e qu e n c e s a n d o t h e r b i o i n -f o r m a t i c s a n a l y s i s .T h e 47M I K C g e n e s i n r y ew e r e d i v i d e d i n t o 12s u b f a m i l i e s .T h e c o l l i n e a r i t y a n a l -y s i s s h o w e d t h a t t h e c o l l i n e a r i t yg e n e sb e t w e e nr y e a n dw h e a tw e r em o r e t h a nt h e c o l l i n e a r i t yge n e s b e t w e e n r y e a n d r i c e ,i n d i c a t i n g t h a t t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n r ye a n dw h e a tw a s c l o s e r .T h e c l u s t e -r i n g r e s u l t s c o m b i n e dw i t h t h e c o l l i n e a r i t y a n a l y s i sw i t h i n r y e s pe c i e sf o u n d t h a t S c M I K C 31g e n ew a s o n l y e x p r e s s e d a t th e s pi k e ,a n d i tw a s n o t e x p r e s s e d i no t h e r p l a n t t i s s u e s a n do r g a n s a n d a t t h e d e -v e l o p m e n t a l s t a g e .M a t e r i a l s f r o mt h e r e s e a r c h g r o u p w e r e s e l e c t e d f o rR N A -s e q a n a l ys i s ,a n d t h e r e -s u l t sw e r ec o n s i s t e n tw i t ht h eb i o i n f o r m a t i c sr e s u l t s .T h e r e f o r e ,i tw a ss p e c u l a t e dt h a t S c M I K C 31g e n e i s a f l o w e r i n g r e l a t e d g e n e i n r y e .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h eM I K C f a m i l y ge n e s h a v ef u n c t i o n -a l d i f f e r e n t i a t i o n i n r ye ,w h i c h p r o v i d e i nf o r m a t i o na n d r e f e r e n c e f o r f u r t h e r r e s e a r c ho n t h e f u n c t i o no f t h i s f a m i l yg e n e.K e y w o r d s:G r o w t h f a c t o r s;R y e;R e v o l u t i o n a r y a n a l y s i s;E x p r e s s i o na n a l y s i s;M I K C g e n eM I K C是MA D S-b o x蛋白家族中一类具有MA D S和K-b o x结构域的植物特异转录因子㊂研究发现,MA D S-b o x转录因子在调控植株的生长发育,尤其是在花器官形成中发挥重要作用㊂MA D S-b o x分为M I K C型和M I K C C型两类[1-2]㊂目前有关M I K C家族的研究已在茄子[3]㊁甘蓝型油菜[4]㊁玉米[5]㊁小麦[6]㊁花生[7]㊁番茄[8]㊁鹅掌楸[9]等植物上开展和报道㊂按照系统进化分类,M I K C类MA D S-b o x转录因子家族可分为s u p p r e s s o r o f o v e r e x p r e s s i o n o f c o n s t a n s(S O C)㊁s e p a l l a t a/a g a m o u s-l i k e g e n e 2(S E P/A G L2)㊁a g a m o u s-l i k e g e n e17(A G L17)㊁s h o r t v e g e t a t i v e p h a s e(S V P)㊁p i s t i l l a t a(P I)㊁a p-e t a l a3(A P3)㊁g n e t u m g n e m o n m a d s13 (G GM13)㊁a g a m o u s-l i k e g e n e6(A G L6)㊁a g a-m o u s-l i k e g e n e12(A G L12)㊁a g a m o u s(A G)和s q u a m o s a/a p e t a l a1(S Q U A/A P1)亚家族[10]㊂编码M I K C蛋白的基因在不同的物种中具有不同的名称,在拟南芥和温带植物(小麦㊁大麦)中,含有名称相同但所示基因不同的春化基因,如V R N1和V R N2,参与了春化的遗传网络[11],春化介导开花的遗传路径在不同植物中存在明显的差异㊂例如,F L C为拟南芥的开花抑制基因,当其在春化过程中受到抑制时,则会启动春季花的转变㊂在拟南芥中,控制开花转变的基因不仅有F L C亚家族的基因,S V P和S O C亚家族的基因也和其开花转变有关㊂相反,温度升高时诱导开花促进基因V R N1保持较高的转录水平,从而为小麦和大麦春季开花提供保障㊂在小麦中, V R N1编码一个类似A P1的MA D S-b o x转录因子,在春化过程中被诱导,促进营养发育到生殖发育的转变㊂V R N2编码一种锌指蛋白,是一种开花阻遏因子,可以延迟开花直到植物春化㊂V R N3编码一种聚乙醇结合蛋白,它的表达受光周期和春化的介导,并加速开花㊂水稻MA D S-b o x基因家族也具有调控开花的作用[12]㊂黑麦(S e c a l e L.,2n=2x=14)是一种二倍体生物,隶属于小麦族(小麦科)小麦亚族(T r i t i c i-n a e),是小麦的近缘物种之一,其M I K C基因家族先前未被研究㊂本研究中,采用多种生物信息学方法对黑麦基因组的M I K C基因家族进行了分析,为进一步探索编码M I K C蛋白的基因功能奠定了基础㊂首先,从基因组筛选得到黑麦中编码M I K C蛋白的基因㊂其次,对这些基因的理化性质有关数据进行了处理,然后对其进行系统发育分析㊂最后,分析了它们在正常生长条件下不同发育阶段根㊁叶和穗子等不同组织的表达谱㊂本研究结果不仅对黑麦M I K C家族的功能研究提供基础,还可以为通过基因改善黑麦的春冬性研究提供参考㊂1材料及方法1.1黑麦M I K C家族基因鉴定本研究采用两种方法鉴定威宁黑麦(W e i n i n g r y e)M I K C家族成员㊂第一步,通过P F a m下载M I K C 蛋白的M A D S(P F00319)和K-b o x(P F01486)结构域的H MM模型,利用H MM E RV3.0程序搜索黑麦蛋白㊂第二步,从P l a n t T F D B下载拟南芥M I K C 蛋白序列,以拟南芥M I K C蛋白为参考序列,于N C B I中对黑麦全基因组蛋白质进行本地B l a s t p,得到候选蛋白序列㊂两个结构域都包含的蛋白为黑麦M I K C蛋白,结合上述两种方法,对所有鉴定出来的蛋白序列在N C B I中C D D[13]在线网站确定保守结构域,最终得到确切的黑麦M I K C蛋白,在E x P A S y网站对蛋白的等电点等理化性质进行分析㊂1.2黑麦M I K C蛋白系统进化分析利用从P l a n t T F D B(h t t p://p l a n t t f d b.c b i.p k u.e d u.c n/)下载的76个拟南芥和51个小麦的M I K C蛋白序列,以及鉴定出来的黑麦M I K C蛋白序列,基于M E G A[14]的邻近法构建物种间系统进化树,1000次B o o t s t r a p抽样,分析其系统发育关系㊂1.3基因结构、保守基序和黑麦的共线性分析利用G E N ES t r u c t u r eD i s p l a y S e r v e分析外显子-内含子结构[15]㊂用M E M E进行保守基序分析,默认参数,参数设置为基序长度(最长100个氨基酸),最大基序数量设置为10,利用T B t o o l s中的G e n eS t r u c t u r eV i w e r进行可视化[16-17]㊂用M C-S c a n X获取M I K C家族种间共线性关系,并利用T B t o o l s软件D u a l S y n t e n y P l o t程序对物种间的结果可视化㊂㊃74㊃第1期汪凯旋等:黑麦M I K C型MA D S-b o x家族基因的鉴定和表达分析1.4黑麦M I K C基因表达分析及验证在小麦多组学网站W h e a t O m i c s[18]数据库(h t t p://w h e a t o m i c s.s d a u.e d u.c n/)下载威宁黑麦(W e i n i n g r y e)不同组织的转录表达谱数据,通过T B t o o l s软件绘制黑麦M I K C基因的表达热图㊂为验证以上生物信息学所分析的黑麦M I K C 基因表达量的变化,大田种植3个春秋播农艺性状差异较大的冬性㊁半冬性黑麦品系89R66㊁90R32㊁90R2用于试验验证,试验材料由河北科技师范学院收集保存,所选材料均设春化组和非春化组2个处理㊂春化组材料于河北科技师范学院昌黎校区实验室内催芽处理后,移到4ħ冰箱进行为期40d的春化处理,非春化组材料于春化组结束春化前3d进行催芽处理,(23ʃ1)ħ室温放置,当两组材料处于相同生长时期时,于2023年3月移栽到河北科技师范学院施各庄农场进行大田种植㊂待植株生长到孕穗期时,植株长势出现明显差异,成熟期的结实率也出现较大差异(表1),3个材料的2个处理组均选6次重复于幼穗处取样,取下的样品做好标记并迅速放到液氮中急速冷冻,用于R N A-s e q测序㊂表1黑麦结实率统计表T a b l e1S t a t i s t i c s o f r y e s e t t i n g r a t e材料名称M a t e r i a l n a m e结实率S e t t i n g r a t e/%春化处理V e r n a l i z a t i o n非春化处理N o n-v e r n a l i z i n g89R6672.0353.5590R3265.6742.3190R270.3835.302结果与分析2.1黑麦M I K C型M A D S-b o x蛋白氨基酸分析黑麦7条染色体上均有M I K C基因分布(表2)㊂黑麦M I K C型MA D S-b o x蛋白的等电点范围5.04(S c M I K C36)~9.5(S c M I K C32),其中有11个蛋白等电点小于7,所有蛋白中既有酸性蛋白,又有碱性蛋白,均为亲水蛋白;平均分子量范围22303.6k D(S c M I K C17)~34117.38k D(S c-M I K C20);氨基酸数量范围196(S c M I K C17)~ 298(S c M I K C20)a a;脂溶指数66.05~93.28,其中有25个蛋白的脂溶指数超过80,属于嗜热型蛋白㊂脂溶指数较高使得蛋白可以较好地适应各种环境㊂2.2黑麦M I K C型M A D S-b o x基因家族系统进化分析为确定黑麦M I K C基因家族和其他物种M I K C基因家族之间的关系,利用M E G A软件对黑麦㊁小麦和拟南芥3个物种共174个M I K C蛋白质序列采用N e i g h b o r-j o i n(N J)法构建家族系统发育进化树(图1),再根据小麦中编码M I K C 蛋白的基因对黑麦中编码M I K C蛋白的M I K C 基因进行分类㊂分析结果显示,黑麦M I K C基因家族共分成12个亚家族㊂其中,属于C GM13㊁A P3㊁S V P㊁A G L17㊁A G L12㊁A G L6㊁S E P/A G L2㊁F L C㊁S O C㊁S Q U A/A P I㊁A G㊁P I亚家族在黑麦中编码M I K C蛋白的基因分别有8㊁2㊁3㊁5㊁2㊁1㊁10㊁0㊁5㊁4㊁4和3个,黑麦S E P/A G L2亚家族中编码M I K C蛋白的基因最多,A G L6亚家族中编码M I K C蛋白的基因最少,无F L C亚家族㊂2.3黑麦M I K C型M A D S-b o x蛋白质保守基序、基因结构和共线性分析为进一步了解M I K C蛋白质保守基序,使用M E M E在线工具对黑麦M I K C家族成员进行分析㊂用M E M E软件预测得到黑麦M I K C蛋白的10个m o t i f(图2),分析结果发现,M I K C蛋白包含m o t i f1㊁m o t i f2㊁m o t i f4和m o t i f6,经验证以上4个m o t i f中含有MA D S-b o x㊁I(i n t e r v e n i n g)区㊁K(k e r a t i n)区和C末端(C-t e r m i n a l)保守结构域㊂不同亚家族K区结构域包含的基序略有不同㊂MA D S位于MA D S-b o x的N末端,为大约60个氨基酸组成的高度保守结构,可以与特异D N A 结合[19];紧接其后为I区,由序列保守性较低的区域构成,大约含有30个氨基酸,对MA D S-b o x 转录因子与D N A的特异结合起到决定性作用;K 区是一个中度保守区域,由大约70个氨基酸构成具有3个α螺旋组成的c o i l e d-c o i l结构,主要参与蛋白质间的相互作用;C末端主要由疏水氨基酸组成,是最不保守的区域,在转录激活中起作用[20]㊂为了解M I K C基因结构,根据其系统发育关系,比较了M I K C基因的内含子和外显子,利用软件T B t o o l s对黑麦M I K C基因进行结构分析(图3)㊂基因结构分析表明,M I K C型编码MA D S-b o x蛋白的基因结构比较保守,黑麦M I K C家族基因大部分包含外显子和内含子㊂植物中大部分M I K C型编码MA D S-b o x蛋白的基因由7个外显子组成,也有少数基因由8个外显子组成㊂图3结果显示,其中10个基因符合植物中编码M A D S-b o x蛋白的基因的典型结构,即7个外显子㊂每个基因的长度不同,可能与黑麦在进化过程中的染色㊃84㊃麦类作物学报第44卷表2 黑麦M I K C 基因及其蛋白质理化特征T a b l e 2 R y eM I K C g e n e s a n d t h e i r p r o t e i n p h ys i c o -c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s 基因名称N a m e基因I DG e n e等电点p I 平均分子量MW /k D 氨基酸数N o .o f a m i n o a c i d 脂溶指数A l i ph a t i c i n d e x 亲水性总平均值G R A V YS c M I K C 01S c WN 1R 01G 047800.36.9130814.6426883.69-0.745S c M I K C 02S c WN 6R 01G 221300.18.9027224.9524184.61-0.679S c M I K C 03S c WN 4R 01G 486200.19.0724139.5121482.99-0.633S c M I K C 04S c WN 7R 01G 163800.18.2727263.7423874.16-0.829S c M I K C 05S c WN 5R 01G 632300.17.6323997.6321391.55-0.406S c M I K C 06S c WN 2R 01G 176500.18.8430080.7026778.16-0.884S c M I K C 07S c WN 4R 01G 225600.18.7428518.4024675.28-0.825S c M I K C 08S c WN 1R 01G 361700.19.3827151.0723372.83-0.862S c M I K C 09S c WN 7R 01G 377700.18.7425984.4322972.88-0.648S c M I K C 10S c WN 5R 01G 619100.18.9923882.3321381.08-0.615S c M I K C 11S c WN 7R 01G 497600.15.4225338.4422584.13-0.570S c M I K C 12S c WN 4R 01G 449900.18.8325994.6722993.28-0.607S c M I K C 13S c WN 1R 01G 219700.19.3827151.0723372.83-0.862S c M I K C 14S c WN 2R 01G 360300.19.0027480.2324090.17-0.672S c M I K C 15S c WN 2R 01G 493000.17.7928071.2624179.67-0.615S c M I K C 16S c WN 4R 01G 610800.18.2528316.1625980.46-0.554S c M I K C 17S c WN 3R 01G 376600.18.8822303.6019684.13-0.531S c M I K C 18S c WN 3R 01G 125800.35.2524317.4721784.56-0.531S c M I K C 19S c WN 7R 01G 305000.16.5325210.1222493.21-0.283S c M I K C 20S c WN 3R 01G 210900.39.0634117.3829870.70-0.737S c M I K C 21S c WN 7R 01G 163700.18.2428502.1124878.27-0.782S c M I K C 22S c WN 7R 01G 129600.16.4028263.9524780.97-0.725S c M I K C 23S c WN 5R 01G 122300.19.0328421.4425488.86-0.443S c M I K C 24S c WN 1R 01G 171500.19.3030399.2626767.64-0.810S c M I K C 25S c WN 4R 01G 197800.17.7926304.2222777.71-0.580S c M I K C 26S c WN 5R 01G 450800.18.9227789.6324479.18-0.765S c M I K C 27S c WN 5R 01G 314800.18.9929056.0425276.67-0.809S c M I K C 28S c WN 6R 01G 087300.16.4528474.2325380.63-0.514S c M I K C 29S c WN 5R 01G 466000.18.7227730.7624078.42-0.671S c M I K C 30S c WN 5R 01G 315200.18.9929056.0425276.67-0.809S c M I K C 31S c WN 3R 01G 493600.17.1324070.5520984.45-0.716S c M I K C 32S c WN 1R 01G 359300.19.5027697.3725183.78-0.469S c M I K C 33S c WN 5R 01G 450700.18.9227789.6324479.18-0.765S c M I K C 34S c WN 4R 01G 392300.18.5032681.7428569.12-0.929S c M I K C 35S c WN 6R 01G 060000.19.0425516.0422366.05-0.759S c M I K C 36S c WN 7R 01G 509800.15.0424757.8122179.95-0.461S c M I K C 37S c WN 2R 01G 279900.29.1431520.6927570.00-0.906S c M I K C 38S c WN 5R 01G 450900.18.9428220.2624776.23-0.688S c M I K C 39S c WN 6R 01G 055600.17.7928071.2624179.67-0.615S c M I K C 40S c WN 6R 01G 211900.18.9029583.4526072.88-0.755S c M I K C 41S c WN 6R 01G 259400.18.9027224.9524184.61-0.679S c M I K C 42S c WN 1R 01G 257800.29.3925844.6223086.13-0.692S c M I K C 43S c WN 4R 01G 329500.15.7325233.4422682.04-0.549S c M I K C 44S c WN 4R 01G 392800.18.5326251.7122778.63-0.785S c M I K C 45S c WN 7R 01G 276300.16.4528288.0125280.95-0.513S c M I K C 46S c WN 6R 01G 261400.15.6425412.5722887.28-0.605S c M I K C 47S c WN 7R 01G 097500.16.7825668.1222886.49-0.589㊃94㊃第1期汪凯旋等:黑麦M I K C 型MA D S -b o x 家族基因的鉴定和表达分析图1 黑麦(S c )与拟南芥(A t )和小麦(T a )M I K C 蛋白的系统进化分析F i g .1 P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s o fM I K C p r o t e i n s i n r ye (S c ),A r a b i d o p s i s (A t ),a n dw h e a t (T a)图2 黑麦M I K C 蛋白的保守基序F i g .2 C o n s e r v a t i v em o t i f s o f r yeM I K C p r o t e i n s 体片段交换有关㊂MA D S -b o x 家族基因是在进化过程中通过基因重复事件产生的[20]㊂由黑麦分别与小麦和水稻间的共线性结果(图4)可知,黑麦与水稻间共有35对共线性基因,其中4R L 和5R L 与水稻的共线性基因最多㊂黑麦与小麦间共有90对共线性基因,其中4R L 与小麦7A ㊁7B ㊁7D L 的共线性基因最多,7R L 与小麦4A ㊁4B ㊁4D L 的共线性基因最多,㊃05㊃麦 类 作 物 学 报 第44卷说明黑麦4R L与小麦7A㊁7B㊁7D L的亲缘关系更近,黑麦7R L与小麦4A㊁4B㊁4D L的亲缘关系更近㊂有研究表明,黑麦4R L与7R L两条染色体出现非同源染色体间的易位现象,推测这是导致黑麦的4R L和7R L与小麦染色体间出现反向对应关系的主要原因[22]㊂根据3个物种的共线性基因数量可知黑麦与小麦的亲缘关系较水稻更近㊂利用T B t o o l s软件对黑麦进行物种内的潜在共线性分析发现(图5),黑麦M I K C家族基因在每条染色体上均有分布,且分布不均㊂其中5R L 和7R L上含有的编码M I K C蛋白的基因最多,各有9个㊂共有3个同源基因对,即S c M I K C37和S c M I K C33,S c M I K C31和S c M I K C08,S c M I K C42和S c M I K C10㊂根据小麦的亚家族分析可知,以上3对基因分别属于同一个亚家族,即S Q U A/A P I㊁P I和S O C㊂这些同源基因的序列相似性表明它们可能具有相似的功能㊂2.4黑麦M I K C基因的组织表达分析为了研究M I K C基因的表达特征,在W h e a t-O m i c s网站下载来源于威宁黑麦(W e i n i n g r y e)的图3黑麦M I K C的基因结构F i g.3M I K C g e n e s t r u c t u r e s o f r ye图中蓝色线条表示物种间的基因存在共线性关系㊂T h e b l u e l i n e s i n t h e f i g u r e i n d i c a t e t h a t t h e r e i s a c o l l i n e a r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n g e n e s.图4黑麦M I K C基因与水稻和小麦基因组的共线性关系F i g.4C o l l i n e a r i t y r e l a t i o n s h i p b e t w e e n r y eM I K C g e n e s a n d r i c e a n dw h e a t g e n o m e s㊃15㊃第1期汪凯旋等:黑麦M I K C型MA D S-b o x家族基因的鉴定和表达分析R N A -s e q 数据,利用T B t o o l s 软件H e a t M a p 程序分析了M I K C 基因在抽穗期采集的根㊁茎㊁叶㊁穗样,以及开花后10㊁20㊁30和40d 采集的籽粒样品㊂根据组织器官和发育时期表达的特征(图6),M I K C 家族基因可分为11个亚族㊂编码S E P /A G L 2㊁A G L 6㊁A G ㊁C GM 13蛋白的基因(除S c M I K C 11)以及S c M I K C 17基因,上述基因在穗子处均有较高表达量,在开花后10和20d 采集的籽粒中也有表达,但表达量低于穗子,总的来说,4个亚族基因整体在穗部的表达量较高,但在其他部位无表达;S c M I K C 09㊁S c M I K C 35和S c -M I K C 31㊁S c M I K C 13等4个基因在穗子处的表达量高,其他部位和生长时期均无表达㊂利用R N A -s e q 数据分析不同基因在黑麦中的表达模式,黑麦表达结果如图7所示㊂经筛选,共选出18个具有差异表达的基因,其中17个M I K C 基因均出现了不同程度的上调表达,1个基因下调表达,其余基因未出现明显的表达差异㊂ 图中红色线条表示黑麦物种内染色体间的共线性基因对㊂T h e r e d l i n e s i n t h e f i g u r e r e p r e s e n t c o l l i n e a r g e n e p a i r sb e -t w e e nc h r o m o s o m e sw i t h i n r y e s pe c i e s .图5 黑麦47个M I K C 基因的染色体分布和染色体间关系F i g.5 C h r o m o s o m a l d i s t r i b u t i o na n d i n t e r c h r o m o s o m a l r e l a t i o n s h i p of 47S c M I K Cg e n es 10D A F ㊁20D A F ㊁30D A F ㊁40D A F :花后10㊁20㊁30及40d 采集的籽粒㊂10D A F ,20D A F ,30D A F ,a n d40D A F i n d i c a t e s e e d c o l l e c t e d 10,20,30,a n d 40d a y s a f t e r f l o w e r i n g ,r e s p e c t i v e l y.图6 M I K C 基因在黑麦不同组织器官中的表达F i g .6 E x p r e s s i o no fM I K C g e n e s i nd i f f e r e n t t i s s u e s a n do r g a n s o f r ye ㊃25㊃麦 类 作 物 学 报 第44卷1~6代表6个生物学重复,T代表实验组,C K代表对照组㊂1-6i n d i c a t e6b i o-r e p l i c a t e s,T m e a n s t r e a t m e n t,C K m e a n s c o n t r o l.图7M I K C基因在黑麦幼穗中的表达F i g.7E x p r e s s i o no fM I K C g e n e s i n y o u n g e a r s o fR y e3讨论黑麦是小麦的三级基因源,是小麦育种中重要的遗传资源[23],黑麦属植物基因可以增加小麦的遗传变异来源,为创制优良的新品种提供可能㊂花器官发育影响黑麦产量和质量㊂M I K C型编码MA D S-b o x蛋白的基因在植物发育过程中起核心作用㊂豆科[24]㊁大麻[25]㊁甘蓝型油菜[26]㊁杉木[27]㊁玫瑰[28]㊁西瓜[29]㊁辣椒[30]㊁菊花[31]等生物的M I K C型MA D S-b o x基因家族鉴定和表达分析已完成㊂本研究利用生物信息学方法在黑麦基因组中鉴定出M I K C型编码MA D S-b o x蛋白的基因共47个,基因数目多于小麦和水稻,比拟南芥此类型基因少29个㊂通过生物信息学相关软件对黑麦47个M I K C转录因子的编码序列进行分析,获得黑麦各个转录因子的蛋白理化性质㊁系统进化树㊁基因结构㊁保守基序㊁共线性和聚类分析等信息㊂这是国内外首次开展黑麦M I K C基因家族生物信息学分析的报道,为黑麦M I K C基因家族的序列克隆和功能验证等研究提供理论基础,也为进一步探索M I K C基因家族在黑麦生长发育以及春化过程中所扮演的角色提供思路㊂编码F L C蛋白的基因通过参与春化途径控制拟南芥的春化和开花转变,其同源基因也在小麦春化过程中起重要作用㊂黑麦M I K C型编码MA D S-b o x蛋白的基因可进一步分为11个亚家族,但本次分析未发现F L C亚家族成员㊂其原因可能是所选用的威宁黑麦(W e i n i n g r y e)参考基因组测序不完整㊂另外,黑麦中相关的基因与小麦和拟南芥同源性较差㊂小麦与拟南芥编码F L C蛋白同源的春化相关基因,如T a A G L24和T a A G L33[32],与黑麦编码M I K C蛋白的基因同源率分别为50%和51%,推测由于同源性较低,黑麦F L C亚家族未归类到基因㊂同源性较低这种现象可能是黑麦的异花授粉与小麦的自花授粉方式不同,在长期进化中表现的差异㊂在拟南芥中,控制开花转变的基因不仅有F L C亚家族, S V P和S O C亚家族基因也和其开花转变有关㊂F L C亚家族的缺失不仅限于黑麦,在高粱㊁水稻㊁黄瓜等植物的MA D S-b o x基因家族中同样没有F L C亚家族成员㊂M I K C型编码MA D S-b o x蛋㊃35㊃第1期汪凯旋等:黑麦M I K C型MA D S-b o x家族基因的鉴定和表达分析白的基因也对植物生长发育起调控作用㊂不同亚家族中编码MA D S-b o x蛋白的基因表达模式不同[33]㊂陆地棉中M I K C型编码MA D S-b o x蛋白的基因调控胚胎发育和控制开花时间㊂高粱中的M I K C型编码MA D S-b o x蛋白的基因同样在花发育和胚胎发育过程中表达[34]㊂基因结构分析发现,该类家族基因非常保守㊂MA D S-b o x不同亚类间基因结构较为保守,所含m o t i f相似,揭示亚类功能的保守性㊂保守基序分析发现m o t i f1㊁m o t i f2㊁m o t i f4和m o t i f6在所有M I K C蛋白中都有㊂全基因组复制事件是许多植物基因进化和扩展的关键驱动因素㊂物种间的共线性分析发现,黑麦与小麦间的共线性基因数多于黑麦与水稻的共线性基因数,证明黑麦与小麦的亲缘关系较黑麦与水稻的亲缘关系更近;根据发表的R基因组序列,1R与小麦共线性最好,但由于黑麦的4R L与7R L之间发生了非同源染色体间的易位,导致不同物种间中黑麦与小麦的共线性出现反向对应㊂黑麦的4R L与小麦和水稻的共线性基因均最多,说明4R L与其他2个物种的基因组重叠最多㊂聚类分析发现,黑麦中编码M I K C蛋白的基因整体在穗子表达量最高,其次是开花后10d采集的籽粒,其他植物组织器官及发育时期也有表达,但表达量较低㊂编码S E P/A G L2㊁A G L6㊁A G㊁C GM13蛋白的基因(除S c M I K C11)以及S c-M I K C17基因在穗子中均有较高表达,在开花后10和20d采集的籽粒中也有表达,但表达量低于穗子,总的来说,4个亚族基因整体在穗部的表达量较高,但在其他部位无表达;编码A G L17蛋白的基因和S O C中的S c M I K C05基因在根部表达量高,其他部位和生长时期均无表达;而A P3亚家族中的S c M I K C09㊁S c M I K C35基因和P I亚家族中的S c M I K C31㊁S c M I K C13基因在穗子的表达量高,其他部位和生长时期均无表达㊂本研究根据转录组数据得出,经春化处理后,部分基因出现不同程度的响应,其中有17个基因出现上调表达,1个基因出现下调表达,其余29个基因未出现明显的表达差异,推测这些具有表达差异的基因在黑麦春化过程中发挥重要作用,与聚类分析中数据库分析结果一致㊂而29个未具有差异表达的基因中可能仍存在与黑麦春化有关的基因,这些基因通过碱基结构的改变等其他方式引起性状差异,无法通过转录组数据检测出表达量差别,具体原因有待通过基因测序等方法进行鉴定㊂通过本次生物信息学分析发现,利用自W h e a t O m-i c s网站上下载的R N A-s e q数据进行聚类分析时, S c M I K C09㊁S c M I K C35㊁S c M I K C31和S c M I K C13等4个基因在穗子的表达量较高,而其他部位和生长时期均无表达;再结合物种内共线性分析发现,黑麦中存在3对同源基因且每对各属于一个亚家族,其中S c M I K C31基因仅在穗子表达,且表达量高;通过R N A-s e q进行验证分析发现,S c-M I K C31基因出现上调表达现象,此基因在黑麦中的表达模式与S O C亚家族基因在拟南芥中与其开花转变有关的基因的表达模式相似,本次R N A-s e q验证结果与生物信息学所得结论一致,初步推测S c M I K C31基因为黑麦中与春化开花有关的基因㊂以黑麦为研究对象,在黑麦的基因组中,共鉴定出47个编码M I K C蛋白的基因,并对这些基因进行了理化性质㊁进化树㊁基因结构㊁基因保守基序㊁共线性㊁聚类分析等生物信息学分析,并利用课题组材料做转录组测序进行验证,较为全面㊁系统地鉴定了黑麦M I K C基因家族㊂结合生物信息学分析和R N A-s e q验证结果一致发现,S c-M I K C31基因仅在穗子处表达量高,因此推测该基因为黑麦中与春化开花有关的基因㊂参考文献:[1]A L V A R E Z-B U Y L L AER,L I L J E G R E NS J,P E L A ZS,e t a l. 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甜菜MADS-box家族基因的全基因组鉴定及进化分析孔维龙;张康达;吴俊池;张丽平;潘辉;唐嘉蔚;傅小鹏【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2018(033)001【摘要】为了进一步了解MADS-box家族基因的功能,利用生物信息学的手段,首次对甜菜MADS-box基因进行了全基因组的鉴定,并对其染色体定位、系统发生关系、基因结构、保守元件、表达模式以及蛋白功能联系进行预测和分析.结果表明,甜菜MADS-box基因共34个成员,其中,type Ⅰ成员7个和type Ⅱ成员27个,type Ⅰ进一步分为Mα (3)、Mβ(1)、Mγ(3)3个组;type Ⅱ进一步分为MIKCC(22)和MIKC?(5) 2个组,MIKCC组可进一步分为AG(2)、AGL12(2)、AP3-PI(4)、Bs(2)、SOC1(1)、SVP(1)、SEP(3)、AGL17(5)、AP1-FUL(1)和FLC(1)10个亚组.MADS-box家族基因在染色体上呈不均匀分布,同一染色体上的基因簇状分布,其中,第6号染色体上分布最多,在第7号染色体上没有分布.甜菜MADS-box家族基因虽然基因结构差别较大,但蛋白序列相对保守.基因表达谱显示,大部分MADS-box基因优势表达于分生组织,部分MADS-box基因在种子、直根、幼叶等组织亦有较高表达.部分MADS-box基因响应盐、热胁迫轻微上调,可能参与甜菜逆境生理调控.【总页数】10页(P86-95)【作者】孔维龙;张康达;吴俊池;张丽平;潘辉;唐嘉蔚;傅小鹏【作者单位】华中农业大学园艺林学学院,园艺植物生物学教育部重点实验室,农业部华中都市农业重点实验室,湖北武汉 430070;北京百迈客生物科技有限公司,北京101300;华中农业大学园艺林学学院,园艺植物生物学教育部重点实验室,农业部华中都市农业重点实验室,湖北武汉 430070;华中农业大学园艺林学学院,园艺植物生物学教育部重点实验室,农业部华中都市农业重点实验室,湖北武汉 430070;华中农业大学园艺林学学院,园艺植物生物学教育部重点实验室,农业部华中都市农业重点实验室,湖北武汉 430070;华中农业大学园艺林学学院,园艺植物生物学教育部重点实验室,农业部华中都市农业重点实验室,湖北武汉 430070;华中农业大学园艺林学学院,园艺植物生物学教育部重点实验室,农业部华中都市农业重点实验室,湖北武汉 430070;华中农业大学园艺林学学院,园艺植物生物学教育部重点实验室,农业部华中都市农业重点实验室,湖北武汉 430070【正文语种】中文【中图分类】Q78;S566.03【相关文献】1.成骨细胞特异因子2基因家族的全基因组鉴定、分类及进化分析 [J], 谭婧玉;刘海文2.谷子CDPK基因家族全基因组序列鉴定及进化分析 [J], 魏萌涵;宋慧;王素英;刘海萍;邢璐;解慧芳;王淑君;刘金荣3.小麦KUP/HAK/KT基因家族的全基因组鉴定、系统进化和表达模式分析 [J], 吴胜男;杨媛;李英壮;王娜;谢彦周;简俊涛;杨辉;王成社4.三浅裂野牵牛MADS-box基因家族全基因组鉴定与组织特异性表达分析 [J], 姚旭峰;贺立恒;李润植;贾小云;董静静;刘世芳;张毅;唐锐敏;王文斌;解红娥;吴宇浩;武宗信5.蓖麻LBD基因家族全基因组鉴定、进化和表达分析 [J], 段强;何智彪;李国瑞;赵秀平;张帅;韩雯毓;陈永胜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

大花蕙兰MADS-box基因ChMADS1的克隆及表达分析陈小强;王春国;李秀兰;宋文芹;陈瑞阳【期刊名称】《南开大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2008(041)006【摘要】根据MADS-box基因保守区结构,设计简并性引物,从大花蕙兰(Cymbidium hybridium)子房中分离和克隆到一个MADS-box基因全序列cDNA(ChMADS1),序列分析表明该基因长871 bp,含一个编码228个氨基酸的完整开放读码框,具有典型的植物MADS-box蛋白结构,由MADS盒、I、K、C区四部分组成.该基因编码的蛋白质与另两种兰花的AP3类MADS盒基因蛋白质PeAP3(89%/94%)和DcOAP3A(89%/95%)同源性较高,属于B组AP3基因家族中的paleoAP3基因.RT-PCR和反Northern杂交分析进一步证实其在子房以及花的各个器官中表达,是B组AP3基因家族中具特殊表达功能的一个新成员.【总页数】7页(P1-7)【作者】陈小强;王春国;李秀兰;宋文芹;陈瑞阳【作者单位】南开大学,生命科学学院,天津,300071;天津农学院,农学系,天津,300384;南开大学,生命科学学院,天津,300071;南开大学,生命科学学院,天津,300071;南开大学,生命科学学院,天津,300071;南开大学,生命科学学院,天津,300071【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.向日葵MADS-Box基因HAM23-like克隆和表达分析 [J], 苏周;吴雨;雷豆;韦小英;何卓远;杨军;邹建2.茶树MADS-box家族基因AGL9的克隆及表达分析 [J], 杨方慧; 夏丽飞; 孙云南; 陈林波; 田易萍; 宋维希; 梁名志3.荷花B类MADS-box基因家族NnDEF基因的克隆及表达分析 [J], 丁献华; 陈伟; 张直峰4.铁皮石斛AP1 MADS-box基因克隆与表达分析 [J], 袁慧;邹玉顺;赵银河5.甜樱桃成花相关MADS-box基因的克隆及表达分析 [J], 段续伟;倪杨;张晓明;闫国华;王晶;周宇;张开春因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

火龙果MADS-box基因家族鉴定及表达分析魏开发;张薇【期刊名称】《漳州师范学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(031)004【摘要】目的为了探索火龙果中MADS-box转录因子在成花诱导及花器官形成中的作用机制.方法针对9月份取材的\"大红二号\"8个不同的组织进行火龙果从头测序,并对MADS-box转录因子全基因家族进行生物信息学的分析.结果在火龙果转录组中一共鉴定出48个具完整结构域HuMADS蛋白,氨基酸长度65～411 aa.依据系统发育分析和结构域的差异,HuMADS基因分布在4个亚家族:Mα(6),Mγ(5),MIKCC(33)和MIKC*(2)以及none组(2),未发现Mβ成员.表达谱分析显示相对于Lineage I而言Lineage II表达水平整体较高,其中Group 1基因主要在花和果实中表达;Group 2基因在枝条、花和果实中均有表达;Group 3基因在Fl510、Fl513和枝条中组织特异性表达.同源分析得到与花器官形成相关的5类功能基因,A类基因AP1(HuMADS18),B类AP3(HuMADS33)和PI(HuMADS38)、C类AG(HuMADS12)、以及D类STK(HuMADS11)和E类SEP1(HuMADS16)、SEP3(HuMADS15和HuMADS17).结论本研究为进一步探索火龙果花发育提供了理论基础.【总页数】8页(P53-60)【作者】魏开发;张薇【作者单位】闽南师范大学生物科学与技术学院,福建漳州363000;闽南师范大学生物科学与技术学院,福建漳州363000【正文语种】中文【中图分类】S667.9【相关文献】1.红莲型水稻不育系统花粉发育不同时期MADS-box基因家族的表达分析 [J], 孙清萍;汪莉;易平;朱英国2.火龙果MADS-box基因家族鉴定及表达分析 [J], 魏开发;张薇;;3.荷花B类MADS-box基因家族NnDEF基因的克隆及表达分析 [J], 丁献华; 陈伟; 张直峰4.陆地棉MADS-box家族基因鉴定及组织特异性表达分析 [J], 张爱;王彩香;宿俊吉;张先亮;史春辉;刘娟娟;彭云玲;马雄风5.三浅裂野牵牛MADS-box基因家族全基因组鉴定与组织特异性表达分析 [J], 姚旭峰;贺立恒;李润植;贾小云;董静静;刘世芳;张毅;唐锐敏;王文斌;解红娥;吴宇浩;武宗信因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

灰毡毛忍冬MADS-box基因家族鉴定与CMB1基因克隆付学森;刘紫璇;王玲;龙雨青;曾娟;周日宝;刘湘丹【期刊名称】《湖南中医药大学学报》【年(卷),期】2024(44)3【摘要】目的鉴定灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides MADS-box家族基因并进行生物信息学分析与表达模式验证,克隆湘蕾型和野生型灰毡毛忍冬MADS-box 家族成员CMB1全长。

方法基于转录组数据,利用在线工具对灰毡毛忍冬MADS-box进行生物信息学分析,并利用qRT-PCR验证MADS-box基因在不同品种中的表达模式,通过RT-PCR、RACE技术克隆湘蕾型和野生型灰毡毛忍冬CMB1基因全长。

结果28个灰毡毛忍冬MADS-box蛋白长度为89~359 aa,碱性蛋白占比85.7%,不稳定蛋白占比96.4%,亲水性蛋白占比96.4%,均定位于细胞核,均为无跨膜结构的非分泌蛋白。

转录组显示,与野生型比较,湘蕾型中28个MADS-box基因有17.86%表达下调,MIKCC型基因中有18.75%表达下调。

克隆得到在两个品种的灰毡毛忍冬花中高度特异性表达的CMB1基因全长,均包含一个738 bp的ORF,编码245个氨基酸。

CMB1基因在两个品种的花中表达量存在显著差异(P<0.01),且与茎、叶相比,在花中高度特异性表达(P<0.01)。

结论基于灰毡毛忍冬转录组数据,鉴定了28个MADS-box家族基因,克隆得到湘蕾型与野生型灰毡毛忍冬CMB1基因全长,为进一步研究灰毡毛忍冬花发育、优良表型形成的分子机制提供研究基础与理论依据。

【总页数】12页(P383-394)【作者】付学森;刘紫璇;王玲;龙雨青;曾娟;周日宝;刘湘丹【作者单位】湖南中医药大学药学院;湘产大宗道地药材种质资源及规范化种植重点研究室;湖南省普通高等学校中药现代化研究重点实验室;湖南省中药饮片标准化及功能工程技术研究中心【正文语种】中文【中图分类】R28【相关文献】1.适用于基因全长克隆的灰毡毛忍冬不同器官总RNA提取方法筛选2.灰毡毛忍冬Lm4CL基因克隆及表达分析3.灰毡毛忍冬与忍冬HQT2基因的克隆及表达分析4.灰毡毛忍冬苯丙氨酸解氨酶(LmPAL2)基因的克隆与表达分析5.灰毡毛忍冬UGTPg17、UGTPg36基因克隆及功能研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。