ELISA检测方法中最佳封闭液和样品稀释液的筛选研究杜改梅1,2，刘茂军1，陈熠夕1，韦艳娜1，甘源1，吴叙苏，邵国青17（1. 江苏省农业科学院兽医研究所，农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，国家兽用生物制品工程技术研究中心，南京，210014；2. 金陵科技学院，动物科学与技术学院，南京，210038）酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA）是Engvall和Perlman（1971）首次报道建立的一种生物活性物质微量测定技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断，也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定。
该方法不仅适用于临床标本的检查，而且也适合于血清流行病学调查，以其灵敏度高（可达ng，甚至pg 水平）、特异性好等优点，在生命科学领域得到广泛应用[1,2]。
近年来，国内外有关建立ELISA检测方法的研究报道较多，但商品化试剂盒却较少，特别是国内。
其主要原因是该检测方法达不到理想的敏感性和特异性。
ELISA检测方法操作步骤虽简单，但影响因素较多，封闭是其中最重要的影响因素之一。
封闭不当会直接影响ELISA检测方法的敏感度和特异性，产生假阳性结果，导致疾病误诊，造成不良后果；此外，良好的封闭液还可以发挥稳定剂和保护剂作用，提高酶标板的保存期；反而，不佳封闭液还会干扰各种试剂的反应。
因此，在检测过程中，为了避免过高的阴性本底影响检测结果的判断，样本必须要先行稀释，样品稀释液也是影响ELI SA检测的一个重要因素。
稀释液选择不佳反而会提高阴性本底，增强非特异性反应。
因此，选择最佳封闭液和样品稀释液是提高ELISA检测方法敏感性和特异性的关键，对建立良好的ELISA检测方法具有重要的作用。
本试验对多种封闭剂和样品稀释液进行了组合优化试验，筛选出最佳封闭液和样品稀释液组合，提高ELISA检测方法的敏感性与特异性，在今后猪疫病防控和疫苗监测中发挥重大作用。
1 材料与方法1.1 血清样品准备从不同养猪场采集猪血，离心分离血清，用IDEXX试剂盒检测所分离的不同份血清，记录并标记检测结果（阴性或阳性），4℃保存。
1.2 封闭液1%酪蛋白（Casein）、2% Casein、3% Casein，1%明胶（Gelatin），1% BSA、2% BSA、3% BS A，10%山羊血清（GS），10%马血清（HS），10%兔血清（RS）、8% RS、7% RS和6% RS。
1.3 样品稀释液PBST，1% Casein，1% Gelatin，1% BSA，5% GS，5% HS，8% RS，7% RS，6% RS，4% R S，2% RS和1% RS。
1.4 方法1.4.1 最佳封闭液和样品稀释液的筛选本试验直接用封闭液封闭无抗原包被酶标板，每孔加入200μL封闭液，37℃孵育2h，用洗涤液洗涤3次，拍干；将阳性临床样品用样品稀释液按1:40稀释后分别加入酶标板孔中，每孔100μL，3 7℃温育30min，同上方法洗涤5次，拍干；将稀释好的羊抗猪IgG加入酶标板孔中，每孔100μL，3 7℃孵育30min，洗涤5次，拍干；然后每孔加入100μL底物显色液，避光显色15min，最后每孔加入50μL终止液终止反应，酶标仪上读取OD450-OD630值。
用不同的封闭液和样品稀释液组合进行如上测定，选择OD450-OD630值最小的封闭液和样品稀释液为最佳组合。
[基金项目] 江苏省农业科技自主创新资金项目（No. CX(13)3076），江苏省博士后基金项目（No. 6511201，1202055C）。
[作者简介] 杜改梅（1976-），女，博士，副教授。
主要从事猪病防控研究。
Email：gaimeidu@。
[通讯作者] 邵国青（1964-），男，江苏省人，研究员。
博士。
主要从事猪病防控。
Email：84391973@。
127812791.4.2 最佳封闭液和样品稀释液组合的验证为进一步验证1.4.1中确定的最佳封闭液和样品稀释液组合对抗原包被ELISA 检测结果的影响，我们又进行了如下试验。
以8μg/mL 猪肺炎支原体全菌蛋白包被酶标板，每孔100μL ，37℃孵育1h ，洗涤液洗涤3次后，拍干，用封闭液封闭每个酶标板孔，每孔200μL ，37℃孵育2h ，同上洗涤，拍干；将已知背景的阴阳性血清用样品稀释液按1:40稀释后分别加入酶标板孔中，每孔100μL ，37℃温育30min ，同上方法洗涤5次，拍干；将稀释好羊抗猪IgG 加入酶标板孔中，每孔100μL ，37℃孵育30m in ，洗涤5次，拍干；然后每孔加入100μL 底物显色液，避光显色15min ，最后每孔加入50μL 终止液终止反应，酶标仪上读取OD 450-OD 630值并判定结果。
2 结果2.1 不同浓度BSA 作封闭液和样品稀释液对ELISA 检测结果的影响按1.4.1步骤分别选用1% BSA 、2% BSA 和3% BSA 同时作为封闭液和样品稀释液进行ELISA 试验。
结果显示，2% BSA 为封闭液和样品稀释液时，血清OD450-630值均介于0.1与0.2之间，而1% BSA 和3% BSA 的血清OD450-OD630值均大于0.2（图1）。
2.2 不同浓度Casein 作封闭液和样品稀释液对ELISA 检测结果的影响同上方法用不同浓度的Casein 直接封闭酶标板，选用相应浓度的封闭液为样品稀释液，进行EL ISA 试验。
结果表明，1% Casein 和2% Casein 作封闭液和样品稀释液效果相近，且血清OD450-OD 630值均小于0.15（图2）。
图1 不同浓度BSA 作封闭液和样品稀释液对ELISA 检测结果的影响图2 不同浓度Casein 作封闭液和样品稀释液对ELISA 检测结果的影响2.3 不同浓度RS 作封闭液对ELISA 检测结果的影响1280按1.4.1步骤分别用6% RS 、7% RS 、8% RS 和10% RS 作封闭液，封闭液同时作样品稀释液，进行ELISA 检测试验。
结果显示，8% RS 和10% RS 作为封闭液和样品稀释液，血清OD 450-OD 630值均小于0.06（图3）。
图3 不同浓度RS 作封闭液对ELISA 检测结果的影响 2.4 不同浓度RS 作样品稀释液对ELISA 检测结果的影响按1.4.1步骤用8% RS 和10% RS 作为封闭液，分别选用8%、4%、2%和1% RS 为样品稀释液，进行ELISA 检测试验。
从图5可知，10% RS （图4左）或8%RS （图4右）作封闭液时，血清OD 450-OD 630值均随着样品稀释液浓度的降低而升高，其中8% RS 作样品稀释液效果最佳，血清OD 450-OD 630值均小于0.06。
图4 不同浓度RS 作样品稀释液对ELISA 检测结果的影响 2.5 不同封闭液和样品稀释液对ELISA 检测结果的影响在上述优化的基础上，将不同类的封闭液和样品稀释液按1.4.1步骤进行ELISA 临床样品检测试验。
由图5可知，用PBST 溶液为样品稀释液时，8% RS 、1% Casein 和2% BSA 三种封闭液的封闭效果相近，但OD 450-OD 630值均较高（图5左）；而选用相应浓度的封闭液作样品稀释液时，与PBST 样品稀释液检测结果相比，OD 450-OD 630值均降低，且8% RS 、1% Casein 、2% BSA 和10% GS 四种封闭液的封闭效果相近，血清OD 450-OD 630值均介于0.1与0.2之间（图5右），其中8%RS 作封闭液和样品稀释液效果最佳。
2.6 8% RS 封闭液和样品稀释液对ELISA 检测结果的影响按1.4.2步骤进行ELISA 试验检测。
从图6（略）可见，这两组封闭液和样品稀释液组合均可使阴性血清OD450-630值小于0.1，封闭效果很好。
IDEXX 检测结果与自制ELISA 检测结果比值介于1.0-1.1之间，检测结果的符合率较高。
1281图5 不同封闭液和样品稀释液对ELISA 检测结果的影响 3 讨论随着我国畜牧养殖业的不断发展，牲畜交易的广泛性，跨省市交易时有发生，而不同地区疾病免疫的不确定性导致了疫病的不时暴发。
目前，我国疫病的控制手段主要是疫苗免疫，但许多疾病疫苗免疫后病原仍然可以持续感染，难以控制[3,4]。
因此，我们要本着“疾病以防为主，既病防变”的原则。
疾病的早期发现，早期治疗可减缓疾病的发展，避免继发感染，降低经济损失。
疾病诊断方面，主要有病原的分离培养、血清学诊断和分子生物学诊断[5-7]。
病原的分离培养需要时间一般较长，并且容易受到相近病原的污染，分子生物学诊断虽然敏感度较高，但需要先进的仪器设备，均难以应用于临床生产中[8-10]。
血清学诊断中ELISA 方法是应用到科研生产中最为广泛，最为灵敏的技术手段，在动物疾病的诊断中起到了很大的作用[11-16]。
而目前，许多疾病缺少商品化的抗体检测试剂盒。
因此，建立一种快捷可行的抗体体外检测方法是十分必要的。
目前，国内的疫病诊断试剂盒多为国外进口的ELISA 试剂盒，其价格极其昂贵，难以满足国内市场的需求。
国内虽开展了大量ELISA 检测方法的研究[17,18]，但可靠稳定的商品化试剂盒甚少，究其原因主要是敏感性和特异性达不到理想的效果。
ELISA 检测方法的影响因素较多，高纯度抗原是间接ELISA 成功的先决条件，虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。
此外，封闭液是一个重要的影响因素。
封闭是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程，即让不相关的蛋白质充填这些未包被间隙，从而减少ELISA 后续步骤中干扰物质的再吸附。
常用封闭液的种类较多，但不同封闭液和不同浓度封闭液的封闭效果均不同。
本试验分别用同类不同浓度封闭液和不同种类封闭液进行封闭，结果发现，2% BSA 较1% BSA 和3% BS A 封闭效果好，2% Casein 和1% Casein 较3% Casein 封闭效果好，这表明封闭效果不会随着封闭液浓度的升高而一定增强。
与BSA 和Casein 相比，RS 具有更好的封闭效果，且8% RS 和10% RS 封闭效果相近，均强于6% RS 和7% RS 。
为了进一步证明8%RS 避免封闭过量，影响检测特异性，本试验对8% RS 和10% RS 封闭液进行了筛选研究，结果表明这两个浓度封闭液均具有较好的封闭效果。
为了避免过高的阴性本底影响检测结果的判断，样本必须要先行稀释，不同样品稀释液对ELISA 检测结果有较大的影响。
