病毒TCID50测定的标准操作规程（编号：014）
1、目的及适用范围
该SOP 适用于病毒滴度测定，即病毒半数感染量TCID 50的测定。
2、主要仪器及试剂
倒置显微镜、细胞培养箱、微量移液器、DMEM 细胞培养液、小牛血清、0.1M PBS 、胰酶
3、操作步骤
3.1准备细胞：取生长良好的细胞，按常规方法消化，运用10%FBS DMEM 制备细胞悬液；对细胞进行计数，调整细胞浓度为1×10个/mL 的悬液，然后加入到96 孔细胞培养板上，100µL/孔。
37℃，5%CO 培养一定时间使其铺满单层。
523.2准备病毒：将待测定病毒进行10倍梯度稀释，选取6-8个梯度进行试验。
3.3感染病毒：96孔板中细胞长满单层后，将培养液吸出，加入稀释好的病毒也，每个梯度8-16孔，每孔100μL ，置37℃，5%CO 培养一定时间后观察病变孔数并记录。
23.4 根据如下方法计算
3.4.1Reed －Muench 氏法
例：某病毒其稀释度及接种细胞后观察到的CPE 结果如下： 病毒稀释度
出现CPE 的孔数 103
16/16 104
16/16 105
16/16 106
13/16 107
7/16 108
1/16 109
0/16
1010 31。
病毒TCID50测定病毒TCID50测定是一种常见的病毒滴度测定方法。
下面将介绍具体的操作步骤。
首先，需要准备好细胞。
取出一块细胞培养板，每个孔铺成单层大约60％丰度即可接种病毒。
对照选取16个孔即可。
注意不要窜孔，保证实验条件一致。
其次，稀释待测病毒液。
可以采用A法或B法。
在A法中，向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液，依次10倍系列稀释至适宜浓度。
在B法中，可以根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数，并根据接种的孔数稀释病毒。
接下来，进行接种。
用多道加样器吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液。
将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100µl，根据观察的惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度到原液加样。
切记要设置正常的细胞对照，每次实验要重复4次，计算标准差。
最后，进行培养。
37℃CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液，加入维持液200µl继续在37℃CO2培养箱中培养。
实验方法将待检病毒接种于细胞培养物中，培养时间为5天，培养温度为37℃，CO2浓度为5%。
测定结果取出培养板，使用显微镜观察细胞病变情况。
根据病变程度，计算出病毒的浓度。
计算方法1) ___-Karber法利用病变程度计算出病毒的50%细胞传染量（CCID50），计算公式为：LgCCID50/0.2ml= -（X-d/2 + d×∑R1/N1）,其中X代表全部病变最低稀释度对数，d代表稀释因数对数，N1代表每个稀释度所种的孔数，R1代表病变孔数，∑代表积和。
2) Reed-Muench法观察细胞病变情况，找出能引起半数细胞感染的病毒稀释倍数，按照Reed和Muench公式计算出该病毒液的50%细胞传染量（TCID50）。
根据实验结果，能使50%细胞感染的病毒稀释度在10^-4~10^-5之间，根据Reed和Muench公式计算出TCID50.。
查看文章病毒TCID50测定（组织半数感染量）方法步骤2009-11-27 21:50操作步骤(1) 准备细胞取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）。
每个孔的细胞铺成单层大约60％丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）。
细胞对照选取16个孔即可。
滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。
也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。
(2) 稀释待测病毒液。
A法为参考书上标准的操作方法B法参照书将液体量减少后的结果病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。
A向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液。
向1号试管中加入0.2ml病毒，依次10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。
B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1，10-2…10-10等)，根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。
首次滴定可以多稀释几个滴度。
根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500µl，即10-1为50µl 加入450µl的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为100µl加入900µl 孵育液中。
若接种8个孔，则相应增加液体量。
上述的配液并不是固定不变的，可以根据接种的量自行调整。
【！此步操作注意事项：1）建议每个稀释度接种8个孔，若要统计分析则还要增加至16个孔。
2）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。
2）此过程中需要使用加样器和tip头。
使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。
使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）。
】(3) 接种取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。
病毒TCID50测定操作步骤(1) 准备细胞取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）。
每个孔的细胞铺成单层大约60％丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）。
细胞对照选取16个孔即可。
滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。
也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。
(2) 稀释待测病毒液。
A法为参考书上标准的操作方法B法参照书将液体量减少后的结果病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。
A向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液。
向1号试管中加入0.2ml病毒，依次10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。
B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1，10-2…10-10等)，根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。
首次滴定可以多稀释几个滴度。
根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500µl，即10-1为50µl加入450µl的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为100µl加入900µl孵育液中。
若接种8个孔，则相应增加液体量。
上述的配液并不是固定不变的，可以根据接种的量自行调整。
【！此步操作注意事项：1）建议每个稀释度接种8个孔，若要统计分析则还要增加至16个孔。
2）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。
2）此过程中需要使用加样器和tip头。
使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。
使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）。
】(3) 接种取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。
将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100µl，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度（10-1，10-2 ）到原液加样。
