微生物的无菌操作及接种技术

微生物的接种技术1 目的1.1学习掌握微生物的几种接种技术1.2 建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节2 实验说明将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。

接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。

无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定以及有关微生物的形态观察及生理研究都必须进行接种。

接种的关键是要严格的进行无菌操作，如操作不慎引起污染，则实验结果就不可靠，影响下一步工作的进行。

3 实验器材3.1 器械和用品酒精灯，玻璃铅笔，火柴，试管架、接种环、接种针、接种钩、滴管、移液管、三角型接种棒等接种工具。

3.2 菌种和培养基菌种：大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。

培养基：普通琼脂斜面和平板,营养肉汤,普通琼脂高层(直立柱)。

4 实验流程斜面接种法→液体接种法→固体接种法→穿刺接种法。

5 操作步骤5.1 斜面接种法斜面接种法主要用于接种纯菌，使其增殖后用以鉴定或保存菌种。

通常先从平板培养基上挑取分离的单个菌落，或挑取斜面，肉汤中的纯培养物接种到斜面培养基上。

操作应在无菌室、接种柜或超净工作台上进行，先点燃酒精灯。

将菌种斜面培养基(简称菌种管)与待接种的新鲜斜面培养基(简称接种管)持在左手拇指、食指、中指及无名指之间，菌种管在前，接种管在后，斜面向上管口对齐，应斜持试管呈45～0度角，并能清楚地看到两个试管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面。

以右手在火焰旁转动两管棉塞，使其松动，以便接种时易于取出。

右手持接种环柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧。

镍铬丝部分（环和丝）必须烧红，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接镍铬丝的螺口部分，要彻底灼烧以免灭菌不彻底。

用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。

1.目的规范无菌操作流程，减少及避免发生染菌现象出现。

2.使用范围无菌室及洁净区的操作。

3.无菌操作技术原则3.1环境要清洁，在每次无菌操作结束后都需要对环境进行清理、清洗；且避免操作前进行清扫。

3.2做好个人卫生，进入无菌室前需修剪指甲、洗手，穿好无菌服，帽子需遮住所有头发，口罩遮住口鼻。

3.3在无菌操作时，不可讲话，打喷嚏，对怀疑染菌的无菌物品，不可使用。

4.内容4.1.1 准备：工作人员着装整洁，洗手、戴口罩、修剪指甲；备齐用物（如：接种针、接种环、酒精灯、斜面、平皿、摇瓶、75%酒精棉、无菌水等）；核对无菌用品，接种菌种的种类、型号。

4.1.2 所有实验使用的物品都需要进行消毒、灭杀；进入洁净区前需要经传递窗进行紫外表面消毒30min以上；4.1.3 开始实验前需要打开超净台的紫外灯，消毒半个小时以上；超净台避免放入过多的物品（一般只放入当次的实验所有的物品），所使用的试剂和耗材都需事先进行灭菌（灭菌日期超过4天的需重新消毒）。

4.1.4 进入洁净区前关闭紫外灯，并打开风机，等待半个小时以上，使臭氧尽量排放干净。

4.1.5 除去手腕等部位的饰品，穿好无菌服，戴好头套、口罩，做到“三不漏”：不暴漏头发，不暴漏口鼻，不暴漏躯干皮肤和衣物。

4.1.6 双手要进行清洗、消毒。

4.1.7 要经风淋室风淋30秒后再进入洁净室。

4.1.8 在局部百级区域操作要戴一次性无菌手套。

4.1.9 实验操作过程中应尽量减少进入洁净区的人员（不超过4人/间）并尽量减少人员走动。

4.1.10 所有要放入超净工作台的物品都需进过消毒液喷洒擦拭消毒。

4.1.11 无菌物品若取离超净台则视为已污染，不得放回再用；无菌液体在取离超净台前必须密封其开口；密封的无菌液体容器在放入超净台后，对其开口前须对开口在酒精灯火焰上烧烤。

4.1.12 在拆开任何一次性无菌使用耗材的包装时都要在超净台内完成，并须同时保证与细菌直接接触的使用端/面不得与超净台内的任何物品发生触碰。

实验三微生物接种技术一、实验目的1、掌握无菌操作在微生物接种过程中的重要性。

2、掌握几种常用的微生物接种方法。

3、掌握微生物微生物扩大繁殖的基本方法。

4、认识微生物接种工具二、实验原理微生物接种技术是生物科学研究中最基本的操作技术。

由于实验目的、培养基种类及容器等不同，所用接种方法不同，如斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种等，以获得生长良好的纯种微生物。

为此，接种必须在一个无杂菌污染的环境中进行严格的无菌操作；同时，因接种方法的不同，常采用不同的接种工具，如接种针、接种环、移液管和玻璃刮铲等。

三、实验器材主要仪器及设备无菌室、超净工作台、培养箱、振荡器、接种针、接种环、接种钩、接种铲，试管固体斜面培养基、培养基平板、三角瓶液体培养基，PDA平板及斜面，牛肉膏-蛋白胨-琼脂平板、斜面培养基、牛肉膏-蛋白胨液体培养基、试管半固体培养基。

菌种大肠杆菌（Escherichia coli)、青霉(Penicillium sp．)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Hansen)、细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)放线菌等。

四、操作步骤(一)斜面接种技术具体操作如下：1、贴标签接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。

贴在距试管口径2-3厘米的位置。

2、点燃酒精灯。

3、接种用接种环将菌种移接到贴好标签的试管斜面上。

无菌操作程序简述如下：⑴手持试管将菌种和用于接种的斜面两支试管用大拇指和其他四指握在左手中、使中指位于两试管之间。

斜面向上，并使它们位于水平位置(图a)。

⑵旋松棉塞先用右手将棉塞旋松，以便接种时易于拔出。

⑶取接种环右手拿接种环在火焰将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌。

⑷拔棉塞用右手的无名指、小指和手掌边先后拔出试管的棉塞，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)，如图b、c所示。

⑸环冷却将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却。

第二课时无菌操作和接种技术及微生物的分离、培养与数量测定一、无菌操作和接种技术1．接种通常把在______条件下将微生物接入________的操作过程叫做接种。

由于接种方法的不同,采用的接种工具也有区别，如用________进行固体培养基划线接种；用________穿刺接种；用__________涂抹平板等。

2．无菌操作__________是微生物接种技术的关键。

通常在酒精灯________进行接种操作,其原因是：酒精灯火焰附近的________使微生物不能存活。

预习交流1．根据接种工具的区别,分析有哪些接种技术。

2．接种过程中在接种环从菌种管中抽出时，应该注意什么问题？3．无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？二、微生物的分离、培养与数量测定1．分离微生物的依据分离微生物时,根据微生物对________、______、______等要求的不同，通过只提供目的微生物生长的必需条件，或加入__________使____________不能生长，从而达到选择分离微生物的目的。

2．菌落单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，可以形成肉眼可见的、有____________的______________,称为菌落.当______培养基表面众多菌落连成一片时，便成为______.当多种微生物混杂在一起时，根据它们在平板上形成的菌落的________可初步将所需的微生物与其他微生物区分开，并在此基础上获得所需微生物的________.3．分离微生物的常用方法______分离法能将单个微生物______和固定在______培养基表面或里面，每个孤立的活微生物经过______、______均可形成便于移植的菌落。

最常用的分离、培养微生物的固体培养基是________________平板。

平板分离法有多种，如__________和____________就是常用的两种________的方法。